Методическая статья

Измерение глобального сотовой матрицы металлопротеиназ и метаболической активности в 3D гидрогели

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59123

⸱

22 января 2019 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлены протокол для инкапсуляции и культивирования клеток в poly(ethylene glycol) (PEG) гидрогели функционализированных с fluorogenic матрицы металлопротеиназы (СПП)-разложению пептида. Клеточных ММП и метаболической активности измеряются непосредственно из гидрогеля культур с использованием стандартного Гонав читателя.

Аннотация

Часто трехмерные (3D) клетки культуры системы более тесно пилки в vivo клеточных реакций и функции чем систем традиционной культуры двухмерный (2D). Однако измерение функции клеток в 3D культуры зачастую является более сложным. Многие биологические анализы требуют поиска клеточного материала, который может быть затруднено в 3D культур. Одним из способов решения этой задачи является разработка новых материалов, позволяющих измерение функции клеток внутри материала. Здесь для измерения активности клеточных матрицы металлопротеиназы (СПП) в 3D гидрогели в формате 96-луночных представлен метод. В этой системе является функционализированных Гидрогель poly(ethylene glycol) (PEG) с датчиком fluorogenic горные ММП. ММП клеточную активность пропорциональна интенсивности флуоресценции и может быть измерена с читателем стандартного микроплиты. Миниатюризация этот assay в 96-луночных формат сократить время, необходимое для экспериментальной установки, использование 50% и реагента на 80% за состояние по сравнению с предыдущей версией 24-ну assay. Этот assay также совместим с другими измерениями клеточных функций. Например метаболической активности пробирного показано здесь, который может проводиться одновременно с измерений активности ММР в пределах же гидрогеля. Assay продемонстрировал с инкапсулирован в различных клеток, заполнение плотности для определения плотности соответствующие инкапсуляции для Рабочий диапазон assay клетки человека меланомы. После 24 ч клеток инкапсуляции ММП и метаболической активности показаний были пропорциональны посева плотность клеток. В то время как assay продемонстрировали здесь с одной fluorogenic разложению субстрата, пробирного и методологии могут быть адаптированы для широкого спектра других флуоресцентные датчиков и систем гидрогеля. Такие assay обеспечивает практических, эффективных и легко доступных 3D культивирования платформу для широкого спектра приложений.

Введение

Трехмерная (3D) культуры системы часто более тесно пилки в vivo клеточных реакций чем систем традиционной культуры двухмерный (2D), увидеть несколько отличные публикаций1,2,3 . Однако используя 3D культуры систем для измерения функция ячейка была сложной из-за сложности поиска сотовой и далее пример обработки. Эта сложность ограничивает измерения многих клеточных функций в системах 3D культуры. Для преодоления этой трудности, новые методы необходимы позволяют легко измерения функции клеток в трехмерных средах. Один из способов решения этой задачи является разработка материалов, которые не только поддерживают 3D клеточной культуры, но также включать датчики для измерения функции клеток. Например несколько систем гидрогеля включили fluorogenic протеазы горные постановление возможность визуализации активности протеаз в трехмерных средах4,5,6,7. Хотя первоначально эти системы использовались для микроскопических изображений, эти системы также могут быть адаптированы для использования в глобальной матрицы металлопротеиназы (СПП) деятельности пробирного с помощью стандартной плиты читатель, позволяя снисходительный измерения функции клеток в 3D окружающей среды8.

Равенству, надсемейства цинка протеаз, играют важную роль в нормальной ткани гомеостаза и многих заболеваний. Равенству деградировать и переделывать внеклеточного матрикса (ECM), Клив поверхности рецепторы клеток и цитокинов и активировать другие равенству9,10. Равенству играют решающую роль в физиологических процессах, таких как заживление ран и болезней, как артрит, атеросклероз, болезнь Альцгеймера и рак (см. обзоры в 9,10,11). В рак высокие уровни выражения MMP сильно коррелируют с метастазами рака и плохой прогноз12. Кроме того равенству способствуют прогрессии опухоли путем поощрения вторжение раковых клеток и миграции, клеточных процессов, которые являются по своей сути 3D явлений13,14. Таким образом существует большой интерес в способность измерения активности ММР в 3D культуры во многих контекстах, включая основные биологические исследования и наркотиков скрининг анализов.

PEG гидрогели широко используются для 3D клеточной культуры благодаря их высоким содержанием воды, устойчивость к адсорбции белка и перестраиваемые характер. PEG гидрогели были функционализированных с числом постановление для прямого клеточной функции, такие как с ECM подражательный пептидов как РСЗ, RLD и IKVAV для облегчения клеточной адгезии, или прямой, привязывая факторов роста, такие как преобразование фактор роста β (TGF-β) 15,16. Совсем недавно гидрогели PEG были функционализированных с пептидами датчиков, позволяющих измерение клеточной функции как хорошо5,8. В частности использование системы гидрогеля PEG функционализированных с fluorogenic MMP-разложению пептид включено измерение клеточной активности ММР в 3D культур с читателем стандартной плиты и требуется дальнейшая обработка не. Эти системы также совместимы с другими измерениями клеточной функции, в том числе метаболической активности. Здесь описывается протокол для измерения активности ММР клетки культивировали в 3D PEG гидрогеля функционализированных с fluorogenic пептид MMP-разложению и представлены результаты демонстрируют первоначальной оптимизации эксперименты, необходимые для использования этого анализа. Клетки человека меланомы (A375) были инкапсулированы в fluorogenic гидрогелей в диапазоне посева плотности, чтобы определить соответствующие плотности посева, которые находятся в пределах Рабочий диапазон assay. После 24 ч инкапсуляции ММП и метаболической активности были измерены используя стандартный Гонав читателя. Далее деятельности МЦП нормализована метаболической активности для определения плотности посева в пределах диапазона линейной assay. Наконец между triplicates отразить воспроизводимость полученных результатов были рассчитаны интра плита коэффициент вариации в процентах (% CV). Этот метод позволяет просто и быстро 3D клеточной культуры и легко измерения активности протеаз с минимальным образец обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. гидрогеля подготовка компонентов

  1. Синтезируют флуоресцентный протеаз разложению пептидов как описано других8, используя флуоресцеин как флуоресцентные молекулой и dabcyl качестве утоления. Растворите пептида в ДМСО до концентрации 10 мм и хранить в морозильной камере-80 ° C в малых (~ 30 мкл) аликвоты избегать повторного замораживания оттаивания циклов.
    Примечание: Эти пептиды можно также приобрести коммерчески. Этот протокол требует C-терминал цистеина в пептидной последовательности для включения ковалентных включения в сеть полимерного гидрогеля.
  2. Подготовка 8 руки 40 кДа поли (этиленгликоля) Амин (PEG)-норборненом (NB) как описано17. Проверьте конец группы функционализации более чем на 90%, с использованием 1H ЯМР. ПЭГ-NB растворяют в стерильной фосфатный буфер (PBS) на 25% w/v и хранить в морозильной камере-80 ° C в аликвоты (~ 300 мкл).
    Примечание: PEG функционализированных с норборненом также может быть приобретен коммерчески.
  3. Синтезировать trimethylbenzoylphosphinate фенил 2,4,6 литий фото инициатор (LAP), как описано в других разделах18. Распустить круг в стерильной воде для концентрации 68 мм и хранить в морозильной камере-80 ° C в аликвоты (~ 300 мкл).
    Примечание: в качестве альтернативы, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) может использоваться в качестве фото инициатора. КОЛЕНИ и Irgacure могут быть приобретены коммерчески.
  4. Распустить MMP-разложению пептид сшивателя (KCGPQG↓IWGQCK) и пептида адгезии клеток (CRGDS) в стерильной воде для концентрации 200 мм и 100 мм, соответственно и хранить их в холодильнике-80 ° C (~ 300 мкл и ~ 30 мкл) аликвоты, соответственно.

2. анализа СМИ подготовка

  1. Подготовить тепло инактивированная, древесный уголь раздели плода бычьим сывороточным (ФБС) для assay ММП:
    Примечание: Протеазы в FBS может производить высокий фоновый сигнал с ММП assay; Поэтому, рекомендуется инактивирует тепла и древесного угля Стрип FBS для анализа СМИ.
    1. Инактивирует 100 мл FBS топлением 30 мин при температуре 55 ° C.
      Примечание: 100 мл FBS была использована здесь для aliquoting и хранения при температуре-20 ° C для использования в будущем. Меньшие объемы может использоваться при необходимости.
    2. Добавить 0,25% w/v активированного угля и 0,025% w/v декстрана в небольшое количество ФБС (примерно 5 мл) и перемешать до получения суспензии образуется. Затем добавьте остальные FBS и перемешать в течение 30 мин при температуре 55 ° C.
    3. Центрифуга на 1,962 x g 20 мин при 4 ° C. Супернатант затем перенесите другому судну.
    4. Повторите шаг 2.1.2, но при 37 ° C, а затем шаг 2.1.3. Стерилизуйте супернатанта, используя 0,45 мкм фильтром и затем 0.2 мкм фильтром.
  2. Подготовить анализ средств массовой информации с помощью СМИ, дополнен с 1% уголь раздели FBS, 2 мм L-глютамином, 10 ед/мл пенициллин, стрептомицин 10 мкг/мл.
    Примечание: СМИ без фенола Красного рекомендуется, потому что она имеет меньше помех флуоресценции. Другие дополнения к assay СМИ как инсулин, факторы роста, и т.д.. могут быть добавлены как поглощение и пики спектр флуоресценции не перекрываются с датчиком (494 Нм/521 Нм).
  3. Разбавить бактериальных коллагеназы фермента типа на 10 и 1000 мкг/мл в Пробирной СМИ как позитивный элемент управления.

3. гидрогеля подготовка и ячейки Инкапсуляция

  1. Приготовляют раствор прекурсоров гидрогеля.
    1. Добавьте реагентов на 1,5 мл в следующем порядке, vortexing после добавления каждого компонента: 20 мм 8 руки 40 кДа PEG-NB, 12,75 мм сшивателя MMP-разложению пептид, 17.8 мм NaOH, 1 мм CRGDS, 2 мм круг и пептида fluorogenic MMP-разложению 0,25 мм.
      Примечание: В таблице 1 показаны гидрогеля прекурсоров решение содержание, запасов концентрации, рабочие концентрации, формулы расчета объема и необходимых объемов необходимо сделать 120 мкл гидрогеля прекурсоров решения, которое является достаточным для проведения эксперимент с 10 гидрогели. Для учета потери гидрогеля решения благодаря закупорить, увеличьте общий объем на 20%. Коммерческие пептиды часто поставляются в растворе кислой хлористого водорода; Таким образом NaOH добавляется к достижению окончательного рН 7. pH окончательного решения должны быть подтверждены пользователем.
    2. Гидрогель прекурсоров решение разделить несколько 1.5 мл пробирок, одна трубка условие тестируемого.
      Примечание: Предлагаются несколько управления условий, в которых гидрогели готовятся без добавления клеток. Для отрицательного контроля для учета деградации неспецифические fluorogenic датчика, одно условие гидрогеля может быть инкубирован с управления транспортного средства или экспериментальных средств массовой информации только если нет условий лечения. Для позитивного управления и для калибровки между эксперименты гидрогели может инкубировали с протеазы, известно прилепится датчик fluorogenic. Например две концентрации бактериальной коллагеназы были использованы здесь.
  2. Инкапсуляция клетки в гидрогели.
    1. Подготовьте одну ячейку подвеска в зависимости от используемого типа ячейки. Например мыть 10 см блюдо A375 меланома клеток с 10 мл ФСБ. Trypsinize ячеек с помощью 0,05% трипсина и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 3 мин Подсчет ячеек с Горяева для определения числа общей ячейки.
    2. Центрифуга клетки решение на 314 x g на 3 мин, аспирационная культуры средств массовой информации, а затем вновь приостановить клетки в PBS на примерно в три раза высоких требуемых посева плотности для эксперимента. Например суспензию клеток с плотностью 21 x 106 клеток был использован здесь для достижения окончательного инкапсулированные плотности 7 х 106 клеток/мл.
    3. Подсчет ячеек снова для обеспечения точной ячейки концентрации.
    4. Добавьте подвесной клетки и PBS в каждую пробирку гидрогеля прекурсоров решения согласно необходимые плотности посева (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 x 106 клеток/мл в этом примере). Добавьте PBS в условиях с клеток не вместо подвесной клетки.
      Примечание: Все условия должны быть того же объема окончательный гидрогеля прекурсоров решения для обеспечения соотношения между компонентами гидрогеля и PBS является константой. Сделать не вихревой трубы, которые имеют клетки в них, энергично Пипетка вверх и вниз без создания пузыри для того, чтобы смешать раствор прекурсоров.
    5. Обойтись 10 мкл раствора гидрогеля прекурсоров в стерильных черный раунд 96-луночных днище, обеспечивая, что кончик центрируется в середине каждой скважины во время отпуска.
    6. Полимеризоваться гидрогеля прекурсоров решение, разоблачение пластины ультра фиолетовый (УФ) света в 4 МВт/см2 за 3 мин.
      Примечание: УФ-лампа (Карманный УФ-лампа UVL-56, UVP, возвышенности, CA) производит УФ-свет на длинные волны УФ (365 Нм), которая не влияет на клеточной жизнеспособности.
    7. Добавьте 150 мкл пробирного СМИ для всех скважин за исключением положительный контроль условий без инкапсулированные клетки. К позитивным элементам управления 150 мкл раствора фермент коллагеназа.
    8. Добавьте 150 мкл PBS внешних скважин пластину для уменьшения испарения во время инкубации.

4. ММП и метаболической активности измерения

  1. Измерения флуоресценции сразу после инкапсуляции установить базовые измерения флуоресценции и обеспечения единообразия в гидрогеля полимеризации. Читайте пластину с помощью флуоресценции Гонав читателя, используя протокол непрозрачной 96-луночных пластины с площадью сканирования параметр 494 Нм/521 Нм (возбуждение/излучение). Это будет 0 h читать.
  2. Инкубируйте пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для 18 h.
  3. Добавление метаболической активности реагента (резазурина) в 1:10 (v/v) для каждой скважины.
  4. Инкубируйте пластины в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2 для дополнительных 6 ч.
    Примечание: Время инкубации может отличаться в зависимости от типа ячейки.
  5. Измерения флуоресценции в 24 ч после инкапсуляции. Читайте пластину с помощью флуоресценции Гонав читателя, используя протокол непрозрачной 96-луночных пластины с площадью сканирования параметр 494 Нм/521 Нм (возбуждение/излучение) для деятельности ММП и 560 Нм/590 Нм (возбуждение/излучение) для метаболической активности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Текущий анализ был адаптирован от ранее развитых и характеризуется 3D гидрогеля культуры системы функционализированных с ММП горные датчик fluorogenic8. Fluorogenic MMP датчике здесь состоит из последовательности пептид, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (AdOO) C (↓ указывает на сайте расщепления), ранее был оптимизирован для расщепления MMP-14 и MMP-11-19. Пептид обозначено с молекулой флуоресцентные (флуоресцеин) и утоления молекулы (dabcyl) по обе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

3D в пробирке клеточной культуры резюмирует многие важные аспекты в естественных условиях окружающей среды. Однако 3D культуры также делает оценки функции клеток и сигнализации сложной, как многие биологические анализы требуют поиска сотовой и большое количество клеток. Таким образом, разработка простой 3D культуры системы, которая позволяет измерение клеточной функции без дальнейшего образец обработки будет значительно увеличить полезность систем 3D культуры. 3D система, описанная здесь могут быть адаптированы для ряда ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы признать Огайо исследования рака (OCR), Огайо, США для финансирования этой работы, а также король университет Сауд (КГУ), Эр-Рияд, Саудовская Аравия для авторов первого автора. Молекулярная масса датчика флуоресцентные пептид была измерена с помощью матрицы помощь, лазерной десорбции ионизации, время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии с помощью кампуса химических инструмент центр масс спектрометрии и протеомики Фонд в университете штата Огайо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1X Фосфатный буферный солевой растворFisher Scientific10-010-049
Активированный уголь Sigma-AldrichC3345
Черная круглая нижняя 96-луночная пластинаBrand-Tech89093-600
Пептид адгезии клеток (CRGDS)GenScript США Inc.на заказ
фермент коллагеназа типа I Life Technologies17100-017
ДекстранСигма-ОлдричD4876
DMEM Среда с высоким содержанием глюкозыИнвитроген11965118
фетальная бычья сыворотка (FBS)Seradigm1500-500
Флуоресцентный считыватель микропланшетов Гемоцитометр BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-глутаминLife Technologies25030-081
MMP-разлагаемый пептидный сшиватель (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript США Inc.изготовленный на заказ
NaOHFisher ScientificS318500
пенициллин/стрептомицинLife Technologies15140-122
Резазурин (Аламар Блю)Life TechnologiesDAL1100
ультрафиолетовым светом УВП95-0006-02
изготовленный

Ссылки

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  3. Hoarau-Véchot, J., Rafii, A., Touboul, C., Pasquier, J. Halfway between 2D and Animal Models: Are 3D Cultures the Ideal Tool to Study Cancer-Microenvironment Interactions. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
  4. Lee, S. -H., Miller, J. S., Moon, J. J., West, J. L. Proteolytically Degradable Hydrogels with a Fluorogenic Substrate for Studies of Cellular Proteolytic Activity and Migration. Biotechnology Progress. 21 (6), 1736-1741 (2005).
  5. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  6. Chalasani, A., et al. Live-Cell Imaging of Protease Activity: Assays to Screen Therapeutic Approaches. Methods in Molecular Biology. 1574, Clifton, N.J. 215-225 (2017).
  7. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing Protease Activity in Living Cells: From Two Dimensions to Four Dimensions. Current Protocols in Cell Biology. 04, Unit-4.20 (2008).
  8. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  9. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  10. Tokito, A., Jougasaki, M., Tokito, A., Jougasaki, M. Matrix Metalloproteinases in Non-Neoplastic Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 17 (7), 1178(2016).
  11. Visse, R., Nagase, H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation Research. 92 (8), 827-839 (2003).
  12. Vihinen, P., Kähäri, V. -M. Matrix metalloproteinases in cancer: Prognostic markers and therapeutic targets. International Journal of Cancer. 99 (2), 157-166 (2002).
  13. Yodkeeree, S., Garbisa, S., Limtrakul, P. Tetrahydrocurcumin inhibits HT1080 cell migration and invasion via. downregulation of MMPs and uPA1. APHS Acta Pharmacologica Sinica. 29 (7), 853-860 (2008).
  14. Yodkeeree, S., Chaiwangyen, W., Garbisa, S., Limtrakul, P. Curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin differentially inhibit cancer cell invasion through the down-regulation of MMPs and uPA. The Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (2), 87-95 (2009).
  15. Mabry, K. M., Schroeder, M. E., Payne, S. Z., Anseth, K. S. Three-Dimensional High-Throughput Cell Encapsulation Platform to Study Changes in Cell-Matrix Interactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21914-21922 (2016).
  16. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  17. Sridhar, B. V., et al. Development of a cellularly degradable PEG hydrogel to promote articular cartilage extracellular matrix deposition. Advanced Healthcare Materials. 4 (5), 702-713 (2015).
  18. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  19. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1' Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
  20. Chai, S. C., Goktug, A. N., Chen, T. Assay Validation in High Throughput Screening - from Concept to Application. Drug Discovery and Development. , (2015).
  21. Iversen, P. W., et al. HTS Assay Validation. Assay Guidance Manual. , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK83783/ (2004).
  22. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
  23. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3DA375

Похожие статьи