Методическая статья

Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59126

⸱

28 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Immunology Programme, Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Emerging Infectious Diseases Program, Duke-NUS Graduate Medical School, 4Singapore Immunology Network, A*STAR, 5NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering (NGS), National University of Singapore, 6Department of Immunology, Wright-Fleming Institute, Imperial College London

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает использование одной цепи гистосовместимости комплексы для изучения молекулярных взаимодействий в активации клеток человека CD8 + T: поколение инженерии антиген представляющих клеток, выражая единую цепочку конструкции, культуры человеческого клона клеток CD8 + T и активация Т-клеток экспериментов.

Аннотация

Non стимулирующее самостоятельной пептидных комплексов MHC (реализует) не вызывают функции активации и эффекторных клеток T, но может повысить Т-клеток ответов реализует агонист, через процесс называется co агонизмом. Этот протокол описывает экспериментальной системы расследования co агонизмом во время активации клеток человека CD8 + T, выразив человека MHC I класса молекул, представив заранее пептидов как сингл полипептидов (одной цепи MHC) в линии культивированная клетки. Мы выразили единую цепь MHCs в условиях, где низкий уровень агонист единой цепи p-MHC комплексов и высокий уровень не стимулирующее одной цепи p-MHC комплексов были выражены. Использование этой экспериментальной системы позволило нам сравнить CD8 + Т-клеток ответов агонист реализует в наличие или отсутствие не стимулирующее реализует. Протокол описывает transfection клетки линии с одной цепи MHC конструкциями, поколение стабильной клеток линии, культуры клеток человека CD8 + T гепатитом вирус специфических и активация Т-клеток экспериментов одновременно количественного определения производство цитокинов и дегрануляции. Представленные методы могут использоваться для проведения исследований по различным аспектам CD8 + Т-клеток активации в системах человека Т-клеток с известных пептид MHC специфичности.

Введение

Гистосовместимости (MHC-I) молекулы представляют пептиды короткий (8-10 аминокислот), производным от Белки синтезируются в каждой ячейке. MHC-I молекулы на здоровые клетки представляют самостоятельной пептиды, полученные от эндогенных белков. Вирусная инфекция приводит к презентации несамоуправляющихся вирус производные пептидов на MHC-I, но даже инфицированные клетки нынешних несамоуправляющихся пептидов при наличии большого количества самостоятельной пептид MHC (реализует). MHC-я признан CD8 ко-рецептор на Т-клетки и Т-клеточных рецепторов (TCR). TCR сродство к пептид реализует сильно зависит от последовательности представленных пептиды, тогда как CD8 привязки пептид независимые. TCR привязки несамоуправляющихся агонист реализует комплекс приводит к активации и эффекторные функции Т-клеток. Non стимулирующее самостоятельно реализует комплексы не вызвать функции активации и эффекторных клеток T, но может повысить Т-клеток ответов реализует агонист, через процесс называется co агонизмом1,2,3. Co агонизмом наблюдается в мыши CD4 + T клетки4,5,6 , а также в человеческих CD8 + T клетки7,8,9,10, и мыши 11 , 12 , 13. в физиологических условиях, Т-клеток необходимо признать ограниченные количества агонист реализует на антиген представляющих клеток (БТР) совместного представления высокий уровень не стимулирующее реализует комплексов, предполагая, что co агонизмом способствует оптимальной T Мобильные ответы в естественных условиях. Общая клеток поверхности MHC класса я уровнях зачастую downregulated во время вирусных инфекций14 и15опухоли. Эта стратегия иммунной уклонение уменьшается агонист реализует презентации, но также уменьшает количество совместно агонист реализует я доступны для повышения активация Т-клеток. Кроме того высокая клеток поверхности выражение уровень MHC класса I молекулы HLA-C показали коррелируют с более ВИЧ управления16, предложив решающую роль для всего MHC класса выражение в активации клеток T. Несмотря на физиологическое значение co агонизмом его молекулярный механизм по-прежнему неполно понимается. Это обусловлено главным образом технические проблемы экспериментально контролировать количество представленных совместно агонист реализует сохраняя агонист реализует константа.

Мы разработали экспериментальный системы расследования co агонизмом во время активации клеток человека CD8 + T, выразив человека MHC I класса молекул, представив заранее пептид как одного полипептида (Одноместный цепи MHC-I, рис. 1A) в ячейке культивированная линия9,10. Агонист реализует единую цепь (sc) была выражена под контролем промотора тетрациклин индуцибельной в строке хомяк производные клеток T-REx Чо, выражая тетрациклин репрессор; Это позволяет очень низкий «Дырявый» выражение sc агонист реализует в отсутствие тетрациклин и высокого sc агонист реализует выражение после добавления тетрациклина (рис. 1BC). Sc агонист реализует выражая T-REx Чо клетки были затем supertransfected с стимулирующее, Сопредседатель агонист sc реализует-я под контролем промотора конститутивно активных (рис. 1BC). Использование этой экспериментальной системы позволило нам сравнить CD8 + Т-клеток ответов агонист реализует в наличие или отсутствие высокого уровня не стимулирующее реализует. Критически, начиная с пептида и MHC-я тяжелые цепи ковалентно связан в scMHC-формате, это позволяет интродукции мутаций в MHC молекулы, представив заранее пептиды. Использование scMHC-я технология таким образом позволил нам конкретно модулировать TCR или CD8-привязки свойства агонистов или совместного агонист реализует.

Co агонизмом в активации клеток CD8 + T наблюдается с использованием очищенного MHC-I комплексы, представляя агониста и Сопредседатель агонист пептидов в виде гетеродимерами11,17 или представленных на квантовых точек12,13. Ранние работы по co агонизмом в активации клеток CD8 + T в контексте признания реализует агониста на APC в качестве БТР TAP2-недостаточным клеточных линий. TAP необходим для транспортировки пептид из цитоплазмы в эндоплазматический ретикулум, и кран дефицит резко снижает в пул доступных MHC класса-привязки пептиды. В отсутствие пептиды, зарождающейся комплекс MHC класса I тяжелые цепи и β2- микроглобулина неустойчива, что приводит к очень низкой MHC-я клеток поверхности выражение. Первоначально сравнение Т-клеток, стимулируется с антигеном, загружены на TAP-достаточно - и несовершенным мыши RMA и RMA-S клеточных линий, соответственно, как БТР, не выявило каких-либо доказательств для co агонизмом во время мыши Т-клеток активации18. Однако использование этой экспериментальной системы не позволяют точно контролировать количество агонист реализует представил независимо от не стимулирующее самостоятельно реализует. Кроме того эти два клеточных линий могут также отличаться в выражение других молекул, которые модулируют активации Т-клеток, таких как лиганды рецепторов Т-клеток co-stimulatory или тормозящее или молекул адгезии.

Впоследствии мы разработали протокол для загрузки TAP2-недостаточным RMA-S клетки с экзогенной пептиды разрешить представление фиксированное количество агонист реализует в наличие или отсутствие не стимулирующее реализует. Это было достигнуто благодаря следующее: инкубационный TAP2-недостаточным RMA-S клеток при более низких температурах (28 ° C, вместо обычного 37 ° C) для стабилизации пустой MHC класса I тяжелые цепи/β2 микроглобулин комплексы19; Инкубация при 28 ° C с экзогенной агонист пептид; Инкубация при 28 ° C в присутствии или отсутствии внешних не стимулирующее пептид; и инкубации при 37 ° C для уменьшения поверхности выражение ячейку пустой MHC класса я комплексы8,9. Использование этой экспериментальной установки показали, что присутствие не стимулирующее реализует расширение активация тимоцитов мыши, наивно периферийных CD8 + Т-клеток и ЦТЛ8. Механически присутствие не стимулирующее реализует может вызвать CD8 набора для ячейки: APC иммунной синапса T даже в отсутствие агонист реализует, и не стимулирующее реализует может усилить взаимодействие TCR с CD8 coreceptor7,8. Однако эта экспериментальная система не позволяет тестирование относительного вклада TCR и CD8 coreceptor привязки агониста и Сопредседатель агонист реализует в посредничестве активации расширения, как любые изменения, изменяя TCR или CD8 привязки MHC класса, я бы влияет на все молекулы MHC, независимо от представленных пептид. Поэтому мы использовали MHC класса я одной цепи технологии для преодоления этой проблемы.

Класс MHC единой цепи (sc), которую я формат уже использовался для улучшения антигенной реализует презентации для терапевтических стратегий, фундаментальные вопросы о механизмах TCR и NK клеток рецепторов активации и функционируют20,21 . scMHC-я состоит из пептид, β2- микроглобулина и MHC-я тяжелые цепи, к которым присоединились два гибких Серин/глицин богатые линкеры (рис. 1A), несколько различных компоновщика последовательности были разработаны и протестированы22. scMHC-я могу сложить независимо от крана комплекс и шаперона белки, необходимые для обычных реализует комплекс Ассамблеи20. scMHC-у меня было показано сложить правильно, как определено с помощью конформации специфичные антитело пятная22 и решая sc структуры с рентгеноструктурного23. Основные scMHC-я был изменен дизайн для улучшения привязки низкого сродства пептиды24,25.

Этот протокол описывает использование человеческих scMHC-я расследовать co агонизмом во время человека CTL клонировать активации. Протокол был оптимизирован для человеческого клона CTL конкретных эпитопу вирусом гепатита в (HBV). HBV является тяжелым бременем здравоохранения во всем мире, как есть 350 миллионов человек, инфицированных ВГВ и хронической HBV инфекции может привести к развитию гепатоцеллюлярной карциномой (HCC). КЦУК клетки в результате инфекции ВГВ может обычно присутствуют ГВ производные эпитопов и могут быть признаны конкретного человека Т-клеток. ГВ и КЦУК Распродажа опирается на ответы клеток человека T26, но КЦУК пациенты часто страдают от истощения Т-клеток и снижение Т-клеток ответов27. Введение в Т-клетки ГВ ГВ конкретные TCR пробовало как потенциальной стратегии иммунотерапии для устранения хронической HBV инфекции28. Однако, это неизвестно, если этот метод будет эффективным в клинических условиях, из-за низкого уровня поверхности MHC-I в человека гепатоцитов29. Таким образом понимание механизма coagonism может предоставить альтернативные перспективы для иммунотерапии ГВ, возможно путем повышения презентации эндогенного реализует побудить co агонизмом опосредованной Т-клеток ответов. Протокол охватывает все необходимые шаги для проведения исследований на человека co агонизмом: transfection клеток T-REx Чо с агонистом и Сопредседатель агонист sc реализует, поколение стабильной T-REx Чо клеточных линий, культуры HBV-конкретного человека CTL CD8 + T линии клеток и активации CTL эксперименты, производство цитокинов и дегрануляции в ответ клетки T-REx Чо. Хотя мы сосредоточить внимание на использовании sc MHC класса I технологии расследовать co агонизмом во время активации клеток HBV T, необходимо отметить, что представленные методы может быть легко адаптирована для исследования других аспектов активация Т-клеток в клетки человека T системах с известными реализует-я специфика.

Этот протокол использует конкретного человека CD8 + CTL линии на ГВ производные пептид Е183-91 (FLLTRILTI: «Е183»)30 представлены по HLA-A2. молекулы HLA SC, состоящий из последовательности сигнала от человека β2-МИКРОГЛОБУЛИНА, HLA-A2 привязки пептид интерес, глицин/сериновые компоновщик, β2-микроглобулина человека, глицин/сериновые компоновщик и А2, тяжелые цепи могут быть коммерчески синтезированных (Рисунок 1A ). Плазмиды кодирования scA2 конструкции с агонистом Е183 пептид, или coagonist кляп ВИЧ (SLYNTVATL)31 пептиды доступны от авторов по запросу. Пептид последовательности могут быть изменены с помощью сайта направленного мутагенеза. Тетрациклин индуцибельной вектор pcDNA5/TO был использован выразить одной цепи агонист HLA-A2 с Е183 пептида (sc Е183-HLA-A2). Присутствии тетрациклин репрессор, pcDNA5/плазмида позволяет только очень низкая, «Дырявый» выражение протеина интереса; высокое выражение может быть вызвана добавлением Тетрациклин (рис. 1BC). Использование системы тетрациклин индуцибельной выражение позволяет контролировать количество клеток поверхности агонист реализует выражение. Учредительный выражение плазмида pcDNA3.1 был использован для Экспресс coagonist scA2 с кляп пептида (sc кляп-HLA-A2). Тетрациклин регулируемых выражение Чо (T-REx) клетки (линия хомячка клетки, не эндогенного человеческого MHC) был использован выразить конструкции агониста и Сопредседатель агонист sc-HLA-A2. Эта экспериментальная система позволяет точно контролировать реализует презентации (рис. 1 c): не реализует презентации (untransfected T-REx), большое количество совместно агонист реализует презентации (учредительных sc кляп-HLA-A2 выражение), низкое количество агонист реализует Презентация (sc Е183-HLA-A2 в отсутствие тетрациклина), большое количество агонист реализует презентации (sc Е183-HLA-A2 присутствии тетрациклина), низкое количество агонист реализует представления и высокой выражения реализует совместное агонистов (sc Е183-HLA-A2 в отсутствие тетрациклин и учредительные sc выражение кляп-HLA-A2). Использование этой экспериментальной системы позволяет точно контролировать поверхности количество клеток агониста и реализует coagonist.

Протокол

Примечание: Все шаги использования живой, не фиксированные клетки должна быть выполнена в биобезопасности капот, и любые зараженные отходы должны быть отброшены согласно местных правил гигиены и безопасности.

1. Чо Transfection клетки и создания стабильных Чо клеточных линий

  1. Transfection клетки Чо
    Примечание:     в этом разделе описываются Чо transfection клетки с помощью polyethylenimine (PEI). Однако можно использовать альтернативные методы, как Чо клетки являются относительно легко transfect использование коммерчески доступных липидов трансфекции реагентов.
    1. Культуры Чо клеток в полной F12 (cF12, F12 с 5% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и 10 мкг/мл blasticidin для поддержания выражение репрессор тетрациклина). Проход клетки каждые 3-4 дней в 1:10 соотношение.
    2. Один день перед трансфекции, готовят суспензию клеток Чо. Чо, вымыть клетки в колбу с помощью PBS (10 мл для PBS для T75 колбу, 5 мл PBS для колбу T25). Добавить 0,05% Trypsin/0.02% ЭДТА в PBS (2 мл для T75 колбу, 1 мл раствора для T25 колбу) в колбу и проинкубируйте 5-10 мин при комнатной температуре (RT). С помощью световой микроскоп, проверьте, что клетки отдельный и остановить trypsinization путем добавления cF12 колбу (8 мл для T75 колбу, 4 мл флакон T25).
    3. Суспензию клеток Чо передать 15 мл трубки и центрифуги на 300-400 x g 5 мин при 4 ° C или RT. удалить супернатант, вновь приостановить в cF12 (10 мл для T75 колбу, 5 мл флакон T25) и рассчитывать, с помощью Горяева.
    4. Отрегулируйте концентрации клеток до 60,000-100,000 Чо клеток/мл. Добавьте 5 мл суспензии клеток Чо (300 000-500 000 Чо клетки) за хорошо в 6 пластины хорошо. Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
    5. В день трансфекции добавьте 400 мкл сыворотки свободных СМИ F12 или низкой сыворотки СМИ в 1,5 мл. Добавьте 3 мкг плазмида 400 мкл средств массовой информации. Смешать, закупорить. Добавить 6 мкг Пей (6 мкл раствора 1 мг/мл PEI) в СМИ/ДНК смесь, и вихрь немедленно для 10 s.
    6. Инкубируйте ДНК/СМИ/PEI смесь на RT для 10-15 мин. Во время этой инкубации замените Чо ячейки СМИ в пластину 6 хорошо 5 мл свежего cF12 СМИ.
    7. СМИ/ДНК/PEI решение добавьте Чо клеток. Добавьте решение каплям и равномерно над колодцем. Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
  2. Создание стабильных клеточных линий Чо
    1. Один день после трансфекции, удалите СМИ из скважин и добавьте 5 мл cF12, содержащие соответствующий выбор антибиотиков для каждой скважины. Используйте 0.3 мг/мл hygromycin на основе pcDNA5TO плазмид, и 1 мг/мл geneticin для pcDNA3 основе плазмид.
    2. Если клетки достичь больше, чем 90% confluency на 24 ч после трансфекции, trypsinize клетки.
    3. Промыть скважин с 1 мл PBS на хорошо, добавляют 1 мл 0,05% trypsin/0.02% ЭДТА в PBS и проинкубируйте 5-10 мин на RT. Using световой микроскоп, проверьте, что клетки отсоединяется и остановить trypsinization путем добавления 3-4 мл cF12 за хорошо.
    4. Суспензию клеток Чо передать 15 мл трубки и центрифуги на 300-400 x g за 5 мин при 4 ° C или RT. удалить супернатант и вновь приостановить в 10 мл cF12. Добавьте 5 мл суспензии клеток в колодец в 6 пластины хорошо. Используйте две скважины для максимизации доходности transfected клеток.
    5. Инкубируйте 6 хорошо пластин при 37 ° C, 5% CO2. Следить за гибель клеток и рост колоний устойчивы, с использованием световой микроскоп. Извлеките носитель и заменить его свежие средства массовой информации, содержащие соответствующие антибиотики после 4-5 дней, или когда наблюдается значительное клеточной смерти.
    6. После того, как достичь устойчивостью клеток больше, чем 70% слияния, trypsinize клетки, как описано в шаге 1.2.2 и передать T25 Фляга для расширения. Антибиотиком выбора занимает 1-2 недели.
    7. По достижении 70-80% слияния антибиотикам Чо клетки в колбу T25 выполняют Пятнать антитела для проверки клеток поверхности выражение конструкций интерес. Один день до Пятнать антитела, trypsinize клетки, как описано в шаге 1.2.2 и регулировка концентрации клеток до 200 000 клеток/мл и добавить 1 мл суспензии клеток к 12 хорошо пластины. Для тестирования тетрациклин индуцибельной конструкций, добавьте 50-60 нг/мл тетрациклина. Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
    8. Использование ячейки скребок для отсоединения Чо клетки от дна скважины. Этот метод является предпочтительным для trypsinization, как это уменьшает риск повреждения epitope протеолитического расщепления.
    9. Передача 1 мл средства массовой информации, содержащих Чо клетки к трубе СУИМ. Спин вниз на 300-400 x g, 4 ° C на 5 мин вновь приостановить в 100 мкл анти HLA антитела, разбавленный FWB. Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C на льду. Выполнять этот Пятнать антитела анти A2 для обнаружения всего уровни поверхности выражения ячейки A2, и TCR-как антитела конкретных для A2 в комплексе с Е183 пептидные для выявления агонист реализует-я клеток поверхности выражение уровня.
    10. После проверки MHC выражение, СУИМ рода позитивные клетки и поддерживать сортировки клеток в СМИ с антибиотиками, чтобы снизить потери трансген. Чо клетки, выражая агонист реализует одну ячейку сортировку рекомендуется, для обеспечения сопоставимых агонист реализует выражение с и без supertransfection с совместного агонист реализует. 2-3 недели необходимы для роста клеток Чо после одну ячейку Сортировка.

2. HBV-конкретные CTL культура

  1. Подготовка репликацию в качестве питателей для HBV-конкретного человека CTL повторной стимуляции
    Примечание:     для CTL А2-E183-определенного клона, повторной стимуляции с свежевыделенных репликацию, вместо получения талой, дает лучшие результаты.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Получите все необходимые согласования этических перед вербовки добровольцев для донорской крови. Для целей этой работы КСДОР были собраны от здоровых добровольцев под протоколом, утвержденным NUS IRB. Информированное согласие было получено от всех доноров. Выполните все необходимые меры предосторожности при работе с человеческой крови для снижения риска передачи заболеваний через кровь.
    1. Прежде чем начать, установите температуру центрифуги на 19-20 ° C и предварительно теплой градиент плотности (например, Ficoll) для RT.
    2. Добавьте градиент плотности комнатной температуре 15 мл тюбик 50 мл. Центрифуга на 400 x g 5 мин на 19-20 ° C. Это чтобы убедиться, что нет никаких градиент плотности на стороне трубки.
    3. Соберите 20 мл крови от здоровых добровольцев доноров путем венепункции. Добавьте 15 мл PBS в 20 мл крови в 50 мл трубки. Смешайте закупорить вверх и вниз.
    4. Медленно добавьте 35 мл крови разбавляют в PBS на вершине 15 мл градиент плотности от шага 2.1.2. Убедитесь, что кровь и градиент плотности не смешивать. Центрифуга трубы на 19 ° C, 1200 x g 20 мин с тормозами выкл.
    5. Удаление примерно 70% плазменный слой. Тщательно удалить слой, содержащий КСДОР (облачный слой поверх ясно плотность градиентного слоя) с использованием Пастер Пипетка и поместить его в новый Тюбик 50 мл.
    6. Добавление PBS для получения получить общий объем 50 мл. Центрифуга трубки на 4 ° C, 300-400 x g , для 10 минут тщательно удалить супернатант с помощью вакуум отсос и стерильной стеклянной пипетки Пастера, или сцеживать.
    7. Вновь приостановите клетки в 50 мл ФСБ. Центрифуга трубки на 4 ° C, 300 x g , для 10 минут тщательно удалить супернатант с помощью вакуум отсос и стерильной стеклянной пипетки Пастера, или сцеживать.
    8. Вновь приостановите клетки в 2 мл полная человеческих клеток T СМИ (сыворотка свободных средств массовой информации с 2% человеческой сыворотки). Подсчет количества ячеек, используя Горяева. Этот протокол дает в среднем 1-2 х 106 репликацию на 1 мл крови.
  2. CTL повторная стимуляция с помощью получения как клетки фидера
    1. Облучить репликацию на 30 гр, чтобы препятствовать распространению в ответ на последующие стимуляции.
      Предупреждение: Обеспечить надлежащую подготовку и соблюдение лаборатории требования безопасности при использовании облучателя.
    2. Вновь приостановите облученного получения в средствах массовой информации полный человеческий Т-клеток в 2 х 106 клеток/мл. Добавление цитокинов и Лектин от Phaseolus vulgaris (ФГА) для повторной стимуляции CTL на 2 x концентрации в КСДОР подвеска. Окончательный цитокинов и ПХА концентрации являются: 20 ед/мл рекомбинантный человеческий Ил-2, 10 нг/мл рекомбинантного ИЛ-7, 10 нг/мл рекомбинантный человеческий Ил-15-1,5 мг/мл ФГА.
    3. Оттепель замороженных CTL флакона в ванну воды 37 ° C. Перенос размороженных клетки в 15 мл тюбик 10 мл средства массовой информации полный человеческий Т-клеток. Спина на 300-400 x g при 4 ° C за 5 мин тщательно удалить супернатант с помощью вакуум отсос и стерильной стеклянной пипетки Пастера, или сцеживать.
    4. Вновь приостановите ЦТЛ в 2 мл средства массовой информации полный человеческий Т-клеток. Подсчет количества ячеек, используя Горяева. Добавьте полный человеческих клеток T СМИ для получения концентрации клеток 106 клеток/мл.
    5. В 24 хорошо тарелку, добавить 0,5 мл облученного репликацию (106 клеток) с 2 x cytokines и ФГА (шаг 2.2.2) и 0,5 мл ЦТЛ (0,5 х 106 клеток) в колодец. Количество скважин используется зависит общее количество сертификатов или получения доступных. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2.
    6. После 4-5 дней, когда CTL взрывов видны и средства массовой информации становится желтой, передача культуры в 6 хорошо пластин и дополнять объем первоначальных 1 мл с 4 мл средства массовой информации полный человеческий Т-клеток с 20 ед/мл IL-2, IL-7 10 нг/мл и 10 нг/мл Ил-15 (не ФГА).
    7. После 2-3 дня передачи культур в колбе T75, добавить 40 мл средства массовой информации полный человеческий Т-клеток с цитокинами (шаг 2.2.2, не ФГА) и культура в вертикальном положении.
    8. Поддерживать ЦТЛ в концентрации 1-2 х 106 клеток/мл, добавляя свежий СМИ, дополнена цитокинов (шаг 2.2.2, не ФГА) в объеме равный объем существующей культуры на каждый день. Списки доверия сертификатов можно использовать для экспериментов 7-14 дней после повторной стимуляции.

3. Т-клеток активации эксперименты

Примечание: Типичная эксперимент требует несколько разных линий T-RExCHO: untransfected Чо T-REx клетки (отрицательный контроль), T-REx Чо клетки выражая не стимулирующее реализует только (scA2-кляп; отрицательный контроль), T-REx Чо клетки выражая низкого количества агонист реализует-я () scA2-ENV без тетрациклин, экспериментальный образец), T-REx Чо клетки, выражая низкого количества агонист реализует и большое количество не стимулирующее сотрудничество агонист реализует (scA2-ENV и scA2-кляп, без тетрациклин, экспериментальный образец), и клетки T-REx Чо выражая большое количество реализует агонист-я scA2-ENV с тетрациклином, положительный контроль), как показано на рисунке 1 cD.

  1. Обшивка Чо клетки как антиген представляющих клеток
    1. Культура клетки Чо в колбе T75, как описано в шаге 1.1.1. Для достижения наилучших результатов используйте клетки при впадении в 70-90%. Один день до активации клеток T эксперимент, trypsinize клетки, как описано в разделе 1.1.2. После trypsinization передача суспензию клеток в 15 мл трубку, центрифуги на 400 x g 5 мин при 4 ° C или RT, удалить супернатант закупорить или сцеживать.
    2. Вновь приостановите Пелле клеток в 5 мл cF12. Подсчитать ячейки Чо с помощью Горяева.
    3. Регулировка концентрации клеток до 2 x 105/мл с помощью cF12. Добавьте 50-60 нг/мл тетрациклина для агонистов только образцы побудить высокое количество реализует агонист-я выражение как позитивного управления (рис. 1 c). Чо ячейки будет располагаться в 15 мл пробирок, поэтому убедитесь, смешивать их закупорить или vortexing перед обшивкой.
    4. Для активации assay клетки T добавить 100 мкл суспензии клеток Чо за хорошо U-дно 96 хорошо пластины и использовать triplicates за Чо линии клеток. Для Чо клеток анти MHC пятнать, добавить 1 мл суспензии клеток к 12 хорошо пластины и использовать triplicates на линии клеток. Инкубируйте на ночь при 37 ° C, 5% CO2.
  2. Активации assay клетки t
    Примечание:     этот assay активация Т-клеток позволяет одновременно количественное определение дегрануляции Т-клеток (CD107a окрашивание, мера Т клеточной цитотоксичности) и производство цитокинов.
    1. За день до эксперимента, центрифуга ЦТЛ клетки на 400 x g при 4 ° C за 5 мин, рассчитывать, используя Горяева и вновь приостановить клетки на 106 клеток/мл в средствах массовой информации полный человеческий Т-клеток без цитокинов или ФГА. Инкубируйте при 37 ° C, 5% CO2. Этот отдых шаг предназначен для снижения чувствительности CTL, как мы наблюдали максимальная активации в ответ на низкое количество антигена без этого шага.
    2. В день эксперимента, центрифуга Т клетки на 400 x g при 4 ° C за 5 мин, удалить супернатант сцеживать или закупорить и вновь приостановить клетки в 2 мл полный сыворотки свободных средств массовой информации (без цитокинов или PHA). Количество живых клеток T, с помощью Горяева и регулировка концентрации клеток T 106 живых клеток/мл с помощью средств массовой информации полный человеческий Т-клеток (без цитокинов или PHA).
    3. Добавить CD107a антитела против человека в разведении 1: 100 (конечная концентрация 2,5 мкг/мл), добавить brefeldin A в разведении 1: 1000 (конечная концентрация 1 мкг/мл).
    4. Удалите медиа из Чо клеток в пластину 96 хорошо аспирационных с стеклянной пипетки Пастера или стряхивая пластину. На хорошо добавьте 200 мкл Т-клеток подвеска (0,2 х 106 клеток) содержащих анти CD107a и brefeldin а. Сопредседатель культуры Т-клеток с Чо клетки для 3-4 ч.
    5. В конце совместного культуры выполняют окрашивание поверхности антиген Т-клеток. Спин вниз 96 хорошо пластины на 300-400 x g, 5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант аспирационных или жест. Добавьте 2.5 мкл CD3 и 2,5 мкл антител CD8 в 50 мкл 0,5% BSA в PBS (мыть буфер потока, FWB) за хорошо для окрашивания клеток поверхностного антигена. Проинкубируйте образцы на льду на 30 мин в темноте.
    6. Стирать образцы, добавив 150 мкл FWB за хорошо. Спин вниз 96 хорошо пластины на 300-400 x g, 5 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант аспирационных или жест.
    7. Выполните фиксацию/permeabilization с помощью фиксации/permeabilization комплект. 100 мкл раствора фиксации/permeabilization (из комплекта фиксации/permeabilization) на колодец, смешивать, закупорить. Инкубируйте на льду за 20 мин.
    8. Центрифуга на 300-400 x g и 4 ° C за 5 мин и удалить супернатант аспирационных или жест. Добавить 200 мкл 1 x Пермь/мыть буфера (развести 10 x Пермь/мыть запасов буфер из комплекта до использования) в колодец. Повторите этот шаг.
    9. Вновь приостановите Пелле клеток в 50 мкл 1 x Пермь/мыть буфер, содержащий антитела анти IFN-γ в 0,3 мкг/мл. Инкубируйте на льду на 30 мин в темноте.
    10. Добавьте 150 мкл буфера 1 x Пермь/мыть. Центрифуга на 300-400 x g для на 4 ° C за 5 мин и удалить супернатант аспирационных или жест. Добавьте 200 мкл 1 x Пермь/мыть буфера, центрифуга 300-400 x g для на 4 ° C за 5 мин и удалить супернатант аспирационных или стряхивая.
    11. Вновь приостановите каждый образец в 200 мкл FWB. Продолжите анализ гранулярных потока.
  3. Чо клеток гистосовместимости пятнать
    Примечание:     важно, чтобы проверить scMHC-я клеток поверхности уровня на клетки, используемых на каждом эксперименте, как линии клетки могут потерять трансген выражение. При подготовке 96 хорошо пластины для стимуляции клеток T, создан 12 хорошо пластины для окрашивания клеток Чо, как указано в разделе 3.1.4.
    1. Используйте ячейки скребок для отсоединения Чо клетки от нижней части скважины. Этот метод является предпочтительным для trypsinization, как это уменьшает риск повреждения epitope протеолитического расщепления.
    2. Передача 1 мл СМИ, содержащих Чо клетки к трубке СУИМ. Спин вниз на 300-400 x g при 4 ° C за 5 мин вновь приостановить в 100 мкл анти HLA антитела, разбавленный FWB. Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C на льду.
      1. Выполнять этот Пятнать антитела анти A2 для обнаружения всего уровни поверхности выражения ячейки A2, и TCR-как антитела конкретных для A2 в комплексе с Е183 пептид32 для обнаружения агонист реализует-я клеток поверхности выражение уровня.
    3. Добавьте 1 mL FWB для каждого образца Чо, спина вниз на 300-400 x g, 4 ° C, 5 минут и затем вновь приостановить образца в 0,3 мл FWB. Продолжите анализ цитометрия потоков.

Результаты

Гистосовместимости технологии используются здесь sc позволяет точный контроль поверхности выражения ячейки MHC класса I с известными, ковалентно связанного пептиды, чтобы побудить активация Т-клеток. Мы породили инженерии культивированная APC системы (рис. 1A, B, C), позволяющий презентация низкий уровень агонист реализует в присутствии или отсутствии реализует совместное агонистов (рис. 1 d, E). Критически мы использовали TCR-как антитела специфические для HLA-A2, представляя Е183 пептид чтобы показать, что презентация агонист sc, которую Е183-HLA-A2 не изменено выражением Сопредседатель Сопредседатель агонист sc кляп-HLA-A2 (Рисунок 1E). Необходимо, однако, отметить, что конкретные TCR-как антитела Е183-HLA-A2 показывает некоторые привязки к HLA-A2, представляющие кляп пептида (Рисунок 1E). Подобные инженерии антиген представляющих клеток систем могут быть построены с использованием различных пептидов или MHC молекулы для изучения молекулярных требования к TCR и/или coreceptor взаимодействий в клетках человека T с различными особенностями.

Мы использовали эти инженерии АСУТП для стимулирования Е183-HLA-A2-определенного человека CD8 + Т-клеток клон. Были использованы три негативный контроль: T клетки только, untransfected T-REx Чо клетки и клетки T-REx Чо, выражая большое количество совместно агонист sc кляп-HLA-A2 для проверки потенциальных T Сотовый активации любой молекул, выраженные на клетки T-REx Чо (untransfected T-REx Чо клетки, по сравнению с Т-клеток) и для активации клеток T, sc кляп-HLA-A2 (T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень sc кляп-HLA-A2 по сравнению с untransfected клеток T-REx CHO). Untransfected T-REx Чо клетки или клетки T-REx Чо, выражая sc кляп-HLA-A2 не побудить активации Е183 HLA-A2-специфичные CD8 + CTL клона, как определяется количественного производства ИФН γ и выражения дегрануляции маркера CD107a как мера Т-клеток цитотоксичность (рисунок 2AB). Проявление высокого уровня агонист sc Е183-HLA-A2, используется как положительный контроль, индуцированная очень эффективное производство ИФН γ и дегрануляции (Рисунок 2аБ), демонстрируя, что sc HLA-A2 конструкции могут быть признаны конкретные TCR активировать Т-клеток эффекторных функций. Выражение низкий уровень sc Е183-HLA-A2 индуцированной более низкие уровни ИФН γ производства и дегрануляции, и это способствовало присутствие Сопредседатель агонист sc кляп-HLA-A2 (рисунок 2AB). Необходимо отметить, что весьма высокий процент CD107a + Т-клеток наблюдалось даже в ответ на низкий уровень антигенных реализует (Рисунок 2Б), в соответствии с предыдущими докладами относительно низкие требования на сумму агонист реализует для индукции клетки T цитотоксичность33. МФО CD107a, указывающий количество дегрануляции на основе одной ячейки, обеспечивает лучше динамический диапазон (рис. 2B). Assay активация Т-клеток используется позволяет одновременное количественная оценка двух основных эффекторных функций: цитокина производства и цитотоксичность и обеспечивает очень чувствительной индикация с хорошим динамическим диапазоном.

Мы использовали технологию единая цепь для проверки ли TCR привязка реализует совместное агонист требуется для совместного агонист реализует зависимой активации расширения. Мы мутировал валин в позиции 152 на краю HLA-A2 пептид привязки паз (рис. 3B) глутаминовая кислота для создания V152E мутант, как эта мутация уже сообщалось об отмене привязки TCR HLA-А234. Затем мы тестировали, если V152E мутация может отменить TCR привязки для CTL Е183-HLA-A2 клон используется, представляя такой мутации в агонист sc Е183-HLA-A2 и выражая мутант агонист sc конструкции в клетки T-REx Чо. Дикого типа, но не V152E, sc Е183-HLA-A2 индуцированной активации CTL Е183-HLA-A2-определенного клона используется (рис. 3A). Необходимо отметить, что любой TCR-привязки мутации на MHC класса я должен испытываться отдельно для каждого индивидуального клона клеток TCR/T используется, как эффект мутаций будет зависеть от точной молекулярных взаимодействий между TCR и реализует комплекс, и они будут отличаться между различные TCRs. К примеру мы протестировали восемь мутации, либо сообщалось ранее TCR-привязки мутации или мутации, предсказал сорвать TCR привязки без отмены привязки пептида в HLA-A2. Из них V152E был единственным мутации, которая отменили активации Е183 специфичных Т-клеток клона используется10. Мы затем представил V152E мутации в совместное агонист sc кляп-HLA-A2 и совместно выразили sc кляп-HLA-A2 WT или V152E с низким уровнем агонист sc Е183-HLA-A2. WT и V152E sc кляп-HLA-A2 расширение производства ИФН γ и дегрануляции (рис. 3 cD), предположить, что TCR привязка реализует совместное агонист не требуется для совместного агонист реализует зависимых CD8 + T клетки активации расширения. Одной цепи MHC класса I технологии, как представленные здесь, может быть использована для изменения TCR и/или coreceptor привязки к MHC класса я с известными пептид расследовать молекулярных требования для признания антигена Т-клеток и активации.

figure-results-1
Рисунок 1: одной цепи, HLA-A2 конструкции используется расследовать совместно агониста в активации клеток человека CD8 + Т. (A) принципиальная схема scHLA-A2 конструкции, состоящей из ковалентно последовательность сигнала из плавленого человека β2 микроглобулин, пептид выбора, гибкие глицин Серина компоновщик (GGGGSGGGGS GGGGS),2 микроглобулина человека β, гибкие Глицин Серина компоновщик и HLA-A2 тяжелые цепи. (B) схема плазмид, используемый для создания инженерных антиген представляющих клеток расследовать co агонизмом в активации клеток человека CD8 + T: Репрессор тетрациклин, агонист sc Е183-HLA-A2 под контролем промотора тетрациклин индуцибельной, не стимулирующее сотрудничество агонист sc кляп-HLA-A2 под контролем промотора конститутивно активных. (C) схема инженерных антиген представляющих клеток, используются для изучения co агонизмом: T-REx Чо клетки (выражение не человека MHC), T-REx Чо клетки, выражая конститутивно высокий уровень sc кляп-HLA-A2 (не стимулирующее сотрудничество агонист реализует), Клетки T-REx Чо выражения «Дырявый» низкий СК Е183-HLA-A2 в отсутствие Тетрациклин (низкий уровень агонист пептида), T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень sc Е183-HLA-A2 присутствии Тетрациклин (высокий уровень агонист пептида), T-REx Чо клетки выражая низкий уровень sc Е183-HLA-A2 и высокий уровень sc кляп-HLA-A2 (низкий уровень агонист пептида) и высокий уровень сотрудничества агонист пептида. (D) клеток поверхности окрашивание инженерных антиген представляющих клеток линии с использованием антител анти HLA-A2. Номера, указанные обозначения МФО значения для MHC пятно в ворота живой клетки. Данные представителя 5 независимых экспериментов (E) клеток поверхности окрашивание инженерных антиген представляющих клеточных линий, используя конкретные TCR-как антитела против HLA-A2, представляя Е183 пептид. Номера, указанные обозначения МФО значения для MHC пятно в ворота живой клетки. Данные представителя 5 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: наличие совместного агонист реализует расширение производство цитокинов и дегрануляции Е183-HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL. (A) внутриклеточных ИФН γ окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3 h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (B) клеток поверхности, CD107a окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3 h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания CD107a или CD107a МФО для популяции клеток CD8 + T. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Сопредседатель агонист-опосредованной Т-клеток активации расширения не требует TCR привязки для совместного агонист реализует комплекс. (A) V152E мутации в sc Е183-HLA-A2 отменяет активацию Е183-HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL. T-REx Чо клетки, выражая высокий уровень (всасывание тетрациклина) WT или V152E мутант sc Е183-HLA-A2 были использованы для стимулирования Е183-HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон за 3 ч. Активация т-клеток было количественно с помощью внутриклеточных ИФН γ пятнать. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (B) местоположение V152E мутации в паз привязки пептид HLA-A2. (C) V152E мутации на sc кляп-HLA-A2 Сопредседатель агонист реализует комплекс не отменить повышение co agonist зависимой активации. Внутриклеточные ИФН γ пятнать HLA-A2-определенного человеческого клона CD8 + CTL после 4 ч стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания ИФН γ. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. (D) V152E мутации на sc кляп-HLA-A2 Сопредседатель агонист реализует комплекс не отменить повышение co agonist зависимой активации. Ячейки, поверхности CD107a окрашивание HLA-A2-определенного человека CD8 + CTL клон после 3h стимуляции с указанного инженерии антиген представляющих клеток. Номера, указанные обозначения процент положительных для окрашивания CD107a или CD107a МФО для популяции клеток CD8 + T. Данные представителя 3 независимых экспериментов, каждый выступал с технической triplicates. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Представленные протокол обеспечивает надежный инструмент для изучения молекулярных взаимодействий во время активации клеток человека CD8 + T. Важным шагом для расследования co агонизмом во время активации клеток человека T является контроль над агонист реализует клеток поверхности выражение для обеспечения равных агонист реализует презентации на БТР с или без совместного агонист реализует выражение. В нашей экспериментальной системы, это достигается с помощью одной ячейки клонов, выражая низкого количества реализует агонист, а затем supertransfection с совместного агонист реализует конструкцию и агонист реализует количественной оценки с использованием антител TCR-как10, 32. как агониста sc реализует выражение может меняться со временем, важно определить количественно агонист реализует поверхности выражение на БТР, используемых в каждом эксперименте с использованием антител TCR-как. Если доступен не конкретные TCR-как антитела, агонист scMHC-я может быть выражено как флуоресцентный белок fusion, и его выражение поверхности клетки затем могут быть количественно с помощью метода чувствительных микроскопии, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования 35 , 36. Кроме того, клетки поверхности выражение реализует совместное агонист уменьшается со временем, благодаря Метилировани зависимых и - независимый глушителей ЦМВ промоутер37и должны контролироваться с помощью антитело пятная и потока цитометрии анализа, с неоднократные СУИМ сортировка при необходимости. Мы культивируемых клеток Чо на срок до 5 недель с относительно ограниченной потерей sc реализует выражение. Мы настоятельно рекомендуем, замораживания Чо клетки вскоре после выбора/Сортировка обеспечить надежный запас клеток с известными sc MHC выражение.

Несколько шагов представленных протоколов можно изменить, в зависимости от наличия оборудования, или в зависимости от конкретных научно-исследовательских целей. Например, КСДОР распространения потенциал может быть ингибированный (шаг 3.2.1), с использованием альтернативных методов, которые не требуют гамма (или X-) облучатель, например лечение с митомицин C38. Буферы диссоциации неферментативного ячейки, содержащие металл хелаторов39 может использоваться вместо клеток, соскоб на шаге 3.3.1. Кроме того, антиген представляющих системы могут быть изменены, чтобы сделать его более подходящим для человеческих клонов CTL, выражая различные TCRs. Чо клетки Экспресс хомяка MHC I класса молекул, и хотя эти значения для линии CTL, учился здесь (рисунок 2A и На рисунке 3A, мы наблюдали нет Т-клеток ответов на untransfected Чо клетки), существует возможность, что другие человеческие TCRs может показать некоторые xenoreactivity. В случае, хомяк MHC I класса выражение может быть уменьшена путем стучать вне хомяка β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9; или человеческой линии APC может использоваться после ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной β2-microglubulin или КОСНИТЕСЬ выбить.

Экспериментальная система, представленная здесь позволяет точное управление TCR и CD8 взаимодействия с молекулами MHC, представляя предопределенных пептиды. Например мы ранее показали, что мутации, отмены привязки CD840 до coagonist реализует ликвидировать coagonist опосредованной активации расширения в мышиных и человеческого CD8 + T клетки9,10, тогда как отмены TCR взаимодействие с совместного агонист реализует было не влияет на повышение coagonist опосредованной активации10. Однако использование единой цепи MHC конструкций имеет ряд ограничений. К примеру пришло время и трудоемкость для тестирования нескольких совместно агонист пептид последовательностей с помощью этой экспериментальной системы, как это предполагает поколения несколько плазмидов кодирования sc MHC с различных пептидов и последующей transfections и сортировки клеток. Ранее мы использовали мышиных TAP-недостаточным клеточная линия RMA-S для проверки нескольких совместно агонист пептидов в мыши Т-клеток активации8,9, но этот подход не был успешным с TAP-недостаточным человека T2 клеток линии10, скорее из-за представление TAP-независимые пептиды41. Еще одно ограничение нашей экспериментальной системы является не обеспечивает быстрый метод для изменения количества молекул реализует совместное агониста для целей определения критических количество реализует совместное агонист, необходимых для запуска активации Т-клеток. Кроме того тетрациклин индуцибельной система, используемая не позволяют титрования агониста реализует количество на уровне отдельной ячейки путем изменения концентрации тетрациклинов, как различной концентрации тетрациклинов изменяет доли положительных клеток HLA-A2, Вместо того чтобы HLA-A2 уровнях на основе за клеток. Альтернативный подход, который мы изучаем в настоящее время является использование поддерживаемых липидных бислоев42, ранее использовались для изучения co агонизмом во время активации клеток мышиных CD4 + T4 или бисер представляет фиксированное количество агонист реализует в наличие различную реализует совместное агониста. При использовании в сочетании с УФ горные пептид технология4,43, этих альтернативных экспериментальных систем должно позволить быстро тестирование нескольких совместно агонист пептида последовательности, а также различное количество совместно агонист реализует .

Sc MHC технология может быть также применимо к расследованию co агонизмом в человека или мышиных CD4 Т-клеток, как единая цепь MHC класса II молекул представляя предопределены пептиды были успешно выразили на поверхности клеток млекопитающих44. Кроме того использование технологии sc MHC может быть расширен для расследования неклассических MHC молекул, таких как HLA-E. SC HLA-E было описано ранее, и его выражение было показано, что подавляют активацию клеток человека Т45. CD1, который представляет липиды вместо пептиды46другой неклассических MHC молекулы интерес. SC конструкции, состоящей из тяжёлой цепи CD1 и β2-МИКРОГЛОБУЛИНА было показано выражаться на поверхности клеток и для связывания соответствующих липидов лигандов47. Одной цепи MHC технологии обладает большим потенциалом как средство исследования для изучения молекулярных взаимодействий во время активации T и NK клеток.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством здравоохранения Сингапура Национальный совет медицинских исследований под его CBRG/0064/2014 до N.R.J.G., на создание под ее R571-002-012-592 абстрагироваться., Национальный исследовательский фонд Investigatorship R571-000-272-281 чтобы абстрагироваться . и премию следователь трансляционного исследования (звезда) Сингапур (NMRC/звезда/013/2012) для а.б. Мы благодарны д-р Пол Хатчинсон и г-н Тео Guo Хуэй из основного потока NUS иммунологии программы фонда для сортировки клеток экспертов. Мы благодарны Чэнь Elijah для критических чтении рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Aim-V (бессывороточная среда)Gibco12055091
БластицидинGibcoR21001
Цитофикс/Цитоперм (набор для фиксации/пермеалибизации)BD554714
F12Gibco10565-018
Фетальная бычья сыворотка (FBS)HyCloneSH3007103
GeneticinGibco
ГольджиПлаг (Брефельдин А)BD555029
сыворотка крови человекаSigma-AldrichH4522
ГигромицинGibco10687010
лектин из Phaseolus vulgaris (PHA)Sigma-AldrichL4144
Opti-MEM (с низким содержанием сывороточных сред)Bibco31985070
10x PBSVivantisPB0344 – 1л
пенициллин/стрептомицинHyCloneSV30010
Полиэтиленимин (PEI)Sigma-Aldrich408727
рекомбинантный человеческий IL2R& D Systems202-IL
Рекомбинантный человеческий IL7R& D Systems207-IL
Рекомбинантный человеческий IL15R& D Systems247-ILB
ТетрациклинSigma-AldrichT7660
T-REx CHO клеточная линияThermo Fisher ScientificR71807
10 x Trypsin/EDTAGibco15400054
антитела
CD3BD347347Клон SK7, RRID:AB_400287
CD8&альфа;BD563795клон RPA-T8, RRID:AB_2722501
CD107aBD566261клон H4A3, RRID:AB_2739639
HLA-A2eBioscience17-9876-41клон BB7.2, RRID:AB_11151522
ИФН-&гамма;eBioscience12-7319-41Клон 4S. B3, RRID:AB_1311250
10131035

Ссылки

  1. Gascoigne, N. R. Do T cells need endogenous peptides for activation? Nature Reviews. Immunology. 8 (11), 895-900 (2008).
  2. Gascoigne, N. R., Zal, T., Yachi, P. P., Hoerter, J. A. Co-receptors and recognition of self at the immunological synapse. Current Topics in Microbiology and Immunology. 340, 171-189 (2010).
  3. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  4. Krogsgaard, M., et al. Agonist/endogenous peptide-MHC heterodimers drive T cell activation and sensitivity. Nature. 434 (7030), 238-243 (2005).
  5. Ebert, P. J., Jiang, S., Xie, J., Li, Q. J., Davis, M. M. An endogenous positively selecting peptide enhances mature T cell responses and becomes an autoantigen in the absence of microRNA miR-181a. Nature Immunology. 10 (11), 1162-1169 (2009).
  6. Lo, W. L., et al. An endogenous peptide positively selects and augments the activation and survival of peripheral CD4+ T cells. Nature Immunology. 10 (11), 1155-1161 (2009).
  7. Yachi, P. P., Ampudia, J., Gascoigne, N. R., Zal, T. Nonstimulatory peptides contribute to antigen-induced CD8-T cell receptor interaction at the immunological synapse. Nature Immunology. 6 (8), 785-792 (2005).
  8. Yachi, P. P., Lotz, C., Ampudia, J., Gascoigne, N. R. T cell activation enhancement by endogenous pMHC acts for both weak and strong agonists but varies with differentiation state. The Journal of Experimental Medicine. 204 (11), 2747-2757 (2007).
  9. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  10. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716(2018).
  11. Juang, J., et al. Peptide-MHC heterodimers show that thymic positive selection requires a more restricted set of self-peptides than negative selection. The Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1223-1234 (2010).
  12. Anikeeva, N., et al. Quantum dot/peptide-MHC biosensors reveal strong CD8-dependent cooperation between self and viral antigens that augment the T cell response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (45), 16846-16851 (2006).
  13. Anikeeva, N., Gakamsky, D., Scholler, J., Sykulev, Y. Evidence that the density of self peptide-MHC ligands regulates T-cell receptor signaling. PloS One. 7 (8), e41466(2012).
  14. Schuren, A. B., Costa, A. I., Wiertz, E. J. Recent advances in viral evasion of the MHC Class I processing pathway. Current Opinion in Immunology. 40, 43-50 (2016).
  15. Bubenik, J. MHC class I down regulation, tumour escape from immune surveillance and design of therapeutic strategies. Folia Biologica. 51 (1), 1-2 (2005).
  16. Apps, R., et al. Influence of HLA-C expression level on HIV control. Science. 340 (6128), New York, N.Y. 87-91 (2013).
  17. Cebecauer, M., et al. CD8+ cytotoxic T lymphocyte activation by soluble major histocompatibility complex-peptide dimers. The Journal of Biological Chemistry. 280 (25), 23820-23828 (2005).
  18. Sporri, R., Reis e Sousa, C. Self peptide/MHC class I complexes have a negligible effect on the response of some CD8+ T cells to foreign antigen. European Journal of Immunology. 32 (11), 3161-3170 (2002).
  19. Ljunggren, H. G., et al. Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346 (6283), 476-480 (1990).
  20. Kotsiou, E., Brzostek, J., Gould, K. G. Properties and applications of single-chain major histocompatibility complex class I molecules. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (3), 645-655 (2011).
  21. Hansen, T. H., Connolly, J. M., Gould, K. G., Fremont, D. H. Basic and translational applications of engineered MHC class I proteins. Trends in Immunology. 31 (10), 363-369 (2010).
  22. Yu, Y. Y., Netuschil, N., Lybarger, L., Connolly, J. M., Hansen, T. H. Cutting edge: single-chain trimers of MHC class I molecules form stable structures that potently stimulate antigen-specific T cells and B cells. Journal of Immunology. 168 (7), Baltimore, Md. 3145-3149 (2002).
  23. Mitaksov, V., et al. Structural engineering of pMHC reagents for T cell vaccines and diagnostics. Chemistry & Biology. 14 (8), 909-922 (2007).
  24. Truscott, S. M., et al. Disulfide bond engineering to trap peptides in the MHC class I binding groove. Journal of Immunology. 178 (10), Baltimore, Md. 6280-6289 (2007).
  25. Truscott, S. M., et al. Human major histocompatibility complex (MHC) class I molecules with disulfide traps secure disease-related antigenic peptides and exclude competitor peptides. The Journal of Biological Chemistry. 283 (12), 7480-7490 (2008).
  26. Bertoletti, A., Ferrari, C. Innate and adaptive immune responses in chronic hepatitis B virus infections: towards restoration of immune control of viral infection. Postgraduate Medical Journal. 89 (1051), 294-304 (2013).
  27. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81 (8), 4215-4225 (2007).
  28. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  29. Gehring, A. J., et al. The level of viral antigen presented by hepatocytes influences CD8 T-cell function. Journal of Virology. 81 (6), 2940-2949 (2007).
  30. Bertoni, R., et al. Human histocompatibility leukocyte antigen-binding supermotifs predict broadly cross-reactive cytotoxic T lymphocyte responses in patients with acute hepatitis. The Journal of Clinical Investigation. 100 (3), 503-513 (1997).
  31. Goulder, P. J., et al. Patterns of immunodominance in HIV-1-specific cytotoxic T lymphocyte responses in two human histocompatibility leukocyte antigens (HLA)-identical siblings with HLA-A*0201 are influenced by epitope mutation. The Journal of Experimental Medicine. 185 (8), 1423-1433 (1997).
  32. Sastry, K. S., et al. Targeting hepatitis B virus-infected cells with a T-cell receptor-like antibody. Journal of Virology. 85 (5), 1935-1942 (2011).
  33. vanden Berg, H. A., et al. Cellular-level versus receptor-level response threshold hierarchies in T-cell activation. Frontiers in Immunology. 4, 250(2013).
  34. Moots, R. J., Matsui, M., Pazmany, L., McMichael, A. J., Frelinger, J. A. A cluster of mutations in HLA-A2 alpha 2 helix abolishes peptide recognition by T cells. Immunogenetics. 34 (3), 141-148 (1991).
  35. Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  36. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), e53158(2015).
  37. Mariati,, Koh, E. Y., Yeo, J. H., Ho, S. C., Yang, Y. Toward stable gene expression in CHO cells. Bioengineered. 5 (5), 340-345 (2014).
  38. Matsushita, S., Tanaka, Y., Matsuoka, T., Nakashima, T. Clonal expansion of freshly isolated CD4T cells by randomized peptides and identification of peptide ligands using combinatorial peptide libraries. European Journal of Immunology. 31 (8), 2395-2402 (2001).
  39. Heng, B. C., Cowan, C. M., Basu, S. Comparison of enzymatic and non-enzymatic means of dissociating adherent monolayers of mesenchymal stem cells. Biological Procedures Online. 11, 161-169 (2009).
  40. Smith, K., et al. Sensory adaptation in naive peripheral CD4 T cells. The Journal of Experimental Medicine. 194 (9), 1253-1261 (2001).
  41. Wei, M. L., Cresswell, P. HLA-A2 molecules in an antigen-processing mutant cell contain signal sequence-derived peptides. Nature. 356 (6368), 443-446 (1992).
  42. Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).
  43. Bakker, A. H., et al. Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3825-3830 (2008).
  44. Rhode, P. R., et al. Single-chain MHC class II molecules induce T cell activation and apoptosis. Journal of Immunology. 157 (11), Baltimore, Md. 4885-4891 (1996).
  45. Crew, M. D., Cannon, M. J., Phanavanh, B., Garcia-Borges, C. N. An HLA-E single chain trimer inhibits human NK cell reactivity towards porcine cells. Molecular Immunology. 42 (10), 1205-1214 (2005).
  46. Van Kaer, L., Wu, L., Joyce, S. Mechanisms and Consequences of Antigen Presentation by CD1. Trends in Immunology. 37 (11), 738-754 (2016).
  47. Im, J. S., et al. Direct measurement of antigen binding properties of CD1 proteins using fluorescent lipid probes. The Journal of Biological Chemistry. 279 (1), 299-310 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Исследование ко-агонизмаТ-клеткиспецифичные к вирусу гепатита Bтетрациклин-индуцибельная экспрессиятрансфекция клеток CHOанализ методом проточной цитометрииколичественное определение продукции цитокиновизмерение дегрануляцииокрашивание антителами к HLA
Использование единой цепи MHC технологии расследовать Co агонизмом в человека CD8 + Т-клеток активации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.