Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.
В нервной системе миелина является комплекс мембранные структуры, порожденных myelinating глиальных клеток, которые ensheathes аксоны и облегчает быстро электрической проводимости. Было показано, что миелина изменения происходят в различных неврологических заболеваний, где это связано с функциональными недостатками. Здесь, мы предоставляем подробное описание ex vivo модель, состоящая из мыши organotypic мозжечка фрагменты, которые можно сохранить в культуре на несколько недель и далее быть помечены для визуализации миелина.
Нейроны являются крайне поляризованную клетки, которые составляют Сомато дендритных отсек, который получает входы от окружающей его среды и аксон, который обеспечивает генерации и распространения электрических импульсов в другие ячейки. Быстрое распространение и своевременное предоставление информации имеет важное значение для правильного функционирования нервной системы. В позвоночных он способствует миелинизации, что позволяет увеличить аксональное проводимости скорости1. Миелиновые является специализированная структура, образованная уплотненных слоев плазматической мембраны, порожденных myelinating глии, а именно Олигодендроциты в центрально....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все работы с участием животных выполнены с институциональной политикой и руководящими принципами, установленными UPMC, INSERM и французский и директивы Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС.
1. Подготовка питательной среды и культуры вставляет (практический время ≈ 10-15 мин)
Примечание: Выполните этот шаг в капюшоне культура потока в стерильных условиях
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Примеры immunostainings представитель миелиновый organotypic мозжечка ломтиками, полученные от C57black6 P9-P10 одичал типа (WT) (рисунок 2A), а также ПЛП-GFP трансгенных мышей (рис. 2B), вместе с окрашивания клеток Пуркинье. Мозжечковая ломтики myelinate от белого вещества отслеживает область срезов к периферии folia и миелинизации клеток Пуркинье основном достигается после 6-7 DIV. На 7 DIV индукция полная демиелинизации возмож.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Здесь, мы подробно протокол для создания ex vivo модель, соответствующую мыши мозжечковой organotypic срез культур, адаптированных из ранее опубликованные методы15,16,19 и последующих миелина иммуноокрашивания этих препаратов. Эта стратегия предоставляет возможность визуализировать миелина компоненты с высоким разрешением в здоровой и патологических государствах.
Мозжечковой organotypic срез культуры .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.
Мы благодарим д-р Шон Фриман, д -р Натали соль-Фулон и д-р Томас Ру за ценные замечания по рукописи. Эта работа финансировалась INSERM, ICM, ARSEP грантов R13123DD, НРУ R17127DD (до н.э.) и FRM стипендий, SPF20110421435 (до н.э.), FDT20170437332 (для м.т.). Мы благодарим фонд культуры клеток СЕЛИС и icm. Платформа Квант.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BME средний | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank' s Сбалансированный раствор соли (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Термоинактивированная сыворотка для лошадей | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| пенициллин– Стрептомицин (10.000 МЕ/мл) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey' s Сбалансированный солевой раствор | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-раствор глюкозы (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Лизофосфатидилхолин (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Параформальдегид (PFA) | Электронная микроскопия Sciences | 15714 | |
| Абсолютный этанол (100% этанол) | VWR Chemicals | 20821.330 | Охлаждается при -20°С; C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Нормальная сыворотка крови коз (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Фосфатный буферный раствор | EuroMEDEX | ET330-A pH | 7,4 |
| Антитела против GFP (поликлональные, куриные) | Merck Millipore | 06-896 | Разведение 1/300 |
| Антитела к основному белку (MBP) против миелина (поликлональные, куриные) | Merck Millipore | AB9348 | Разведение 1/150 |
| Антитело к основному белку миелина (MBP) (моноклональное, мышиное IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Разведение 1/200 |
| Антитело против PLP (крыса, гибридома) | Подарок от доктора К. Икенака; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Антитело (моноклональное, мышиное IgG1, клон K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr антитело (поликлональное, кроличье) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488, 594, 647 или 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Измельчитель тканей | McIlwain | ||
| Бритвенные лезвия | |||
| Большие ножницы | F.S.T | 14101-14 | |
| Маленькие ножницы | F.S.T | 91500-09 | |
| Тонкие прямые щипцы | F.S.T | 91150-20 | |
| Изогнутые-тонкие щипцы | F.S.T | 11297-00 | |
| Чашки для клеточных культур (60 мм и 100 мм) | TPP | ||
| 4-, 6-луночные культуральные планшеты | TPP | ||
| Вставки для культивирования милликлеточных культур (0,4 &; m, диаметр 30 мм) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Инкубатор для клеточных культур | 37° C, 5% CO2 | ||
| Наконечники для пипеток с тонким концом | Dutscher | 134000CL | |
| Наконечники для пипеток с широким отверстием | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Стерильный шприц | Terumo Europe | 20 или 50 мл | |
| Стерильные шприцевые фильтры | Terumo Europe | 0.22 &микро; m | |
| Скальпель | Swann-Morton | 0510 | |
| Кистковый | |||
| микроскоп предметные стекла | RS France | 76 мм x 26 мм x 1,1 мм | |
| Стеклянные покровные стекла | RS France | 22 мм x 22 мм | |
| Kimtech Sciences Салфетки | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Бинокулярный микроскоп |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.