Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка и иммуноокрашивания Myelinating Organotypic мозжечка ломтик культур
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В нервной системе миелина является комплекс мембранные структуры, порожденных myelinating глиальных клеток, которые ensheathes аксоны и облегчает быстро электрической проводимости. Было показано, что миелина изменения происходят в различных неврологических заболеваний, где это связано с функциональными недостатками. Здесь, мы предоставляем подробное описание ex vivo модель, состоящая из мыши organotypic мозжечка фрагменты, которые можно сохранить в культуре на несколько недель и далее быть помечены для визуализации миелина.
Введение
Нейроны являются крайне поляризованную клетки, которые составляют Сомато дендритных отсек, который получает входы от окружающей его среды и аксон, который обеспечивает генерации и распространения электрических импульсов в другие ячейки. Быстрое распространение и своевременное предоставление информации имеет важное значение для правильного функционирования нервной системы. В позвоночных он способствует миелинизации, что позволяет увеличить аксональное проводимости скорости1. Миелиновые является специализированная структура, образованная уплотненных слоев плазматической мембраны, порожденных myelinating глии, а именно Олигодендроциты в центрально....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все работы с участием животных выполнены с институциональной политикой и руководящими принципами, установленными UPMC, INSERM и французский и директивы Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС.
1. Подготовка питательной среды и культуры вставляет (практический время ≈ 10-15 мин)
Примечание: Выполните этот шаг в капюшоне культура потока в стерильных условиях
- Подготовить 40 мл питательной среды, которая состоит из 50% BME, 25% Хэнк сбалансированного солевого раствора (1 x), 25% тепло инактивированная Верховая сыворотки, дополненная производная глютамин 2 мм, 100 МЕ/мл пенициллин стрептом....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Примеры immunostainings представитель миелиновый organotypic мозжечка ломтиками, полученные от C57black6 P9-P10 одичал типа (WT) (рисунок 2A), а также ПЛП-GFP трансгенных мышей (рис. 2B), вместе с окрашивания клеток Пуркинье. Мозжечковая ломтики myelinate от белого вещества отслеживает область срезов к периферии folia и миелинизации клеток Пуркинье основном достигается после 6-7 DIV. На 7 DIV индукция полная демиелинизации возмож.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь, мы подробно протокол для создания ex vivo модель, соответствующую мыши мозжечковой organotypic срез культур, адаптированных из ранее опубликованные методы15,16,19 и последующих миелина иммуноокрашивания этих препаратов. Эта стратегия предоставляет возможность визуализировать миелина компоненты с высоким разрешением в здоровой и патологических государствах.
Мозжечковой organotypic срез культуры .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Никто из авторов у конкурирующих или противоречивых интересов.
Благодарности
Мы благодарим д-р Шон Фриман, д -р Натали соль-Фулон и д-р Томас Ру за ценные замечания по рукописи. Эта работа финансировалась INSERM, ICM, ARSEP грантов R13123DD, НРУ R17127DD (до н.э.) и FRM стипендий, SPF20110421435 (до н.э.), FDT20170437332 (для м.т.). Мы благодарим фонд культуры клеток СЕЛИС и icm. Платформа Квант.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BME средний | ThermoFisher Scientific | 41010026 | |
| Hank' s Сбалансированный раствор соли (10x HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14180046 | |
| GlutaMAX (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050038 | |
| Термоинактивированная сыворотка для лошадей | ThermoFisher Scientific | 26050088 | |
| пенициллин– Стрептомицин (10.000 МЕ/мл) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Gey' s Сбалансированный солевой раствор | Sigma Aldrich | G9779-500ML | |
| D-раствор глюкозы (45%) | Sigma Aldrich | G8769-100ML | |
| Лизофосфатидилхолин (LPC) | Sigma Aldrich | L4129-100MG | |
| Параформальдегид (PFA) | Электронная микроскопия Sciences | 15714 | |
| Абсолютный этанол (100% этанол) | VWR Chemicals | 20821.330 | Охлаждается при -20°С; C |
| Triton® X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 10% Нормальная сыворотка крови коз (NGS) | ThermoFisher Scientific | 500622 | |
| Фосфатный буферный раствор | EuroMEDEX | ET330-A pH | 7,4 |
| Антитела против GFP (поликлональные, куриные) | Merck Millipore | 06-896 | Разведение 1/300 |
| Антитела к основному белку (MBP) против миелина (поликлональные, куриные) | Merck Millipore | AB9348 | Разведение 1/150 |
| Антитело к основному белку миелина (MBP) (моноклональное, мышиное IgG2b) | Merck Millipore | NE1019 | Разведение 1/200 |
| Антитело против PLP (крыса, гибридома) | Подарок от доктора К. Икенака; Okasaki, Japan | Dilution 1/5 to 1/10 | |
| Anti-Sodium Channel, Pan Антитело (моноклональное, мышиное IgG1, клон K58/35) | Sigma Aldrich | S8809 | Dilution 1/150 |
| Anti-Caspr антитело (поликлональное, кроличье) | Abcam | ab34151 | Dilution 1/500 |
| Goat вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488, 594, 647 или 405 | ThermoFisher Scientific | Dilution 1/500 | |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Измельчитель тканей | McIlwain | ||
| Бритвенные лезвия | |||
| Большие ножницы | F.S.T | 14101-14 | |
| Маленькие ножницы | F.S.T | 91500-09 | |
| Тонкие прямые щипцы | F.S.T | 91150-20 | |
| Изогнутые-тонкие щипцы | F.S.T | 11297-00 | |
| Чашки для клеточных культур (60 мм и 100 мм) | TPP | ||
| 4-, 6-луночные культуральные планшеты | TPP | ||
| Вставки для культивирования милликлеточных культур (0,4 &; m, диаметр 30 мм) | Merck Millipore | PICM0RG50 | |
| Инкубатор для клеточных культур | 37° C, 5% CO2 | ||
| Наконечники для пипеток с тонким концом | Dutscher | 134000CL | |
| Наконечники для пипеток с широким отверстием | ThermoFisher Scientific | 2079G | |
| Стерильный шприц | Terumo Europe | 20 или 50 мл | |
| Стерильные шприцевые фильтры | Terumo Europe | 0.22 &микро; m | |
| Скальпель | Swann-Morton | 0510 | |
| Кистковый | |||
| микроскоп предметные стекла | RS France | 76 мм x 26 мм x 1,1 мм | |
| Стеклянные покровные стекла | RS France | 22 мм x 22 мм | |
| Kimtech Sciences Салфетки | Kimberly-Clark Professional | 5511 | |
| Бинокулярный микроскоп |
Ссылки
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple scleros....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
