Это исследование демонстрирует использование проточной цитометрии для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) производства в результате активации FcγR. Этот метод может использоваться для оценки изменений в противомикробные и сигнальные функции фагоцитов в ответ иммунные комплексы, опсонизированными микроорганизмов или прямого FcγR cross-linking окислительно-восстановительные.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Окислительная или дыхательных всплеск используется для описания быстрого потребления кислорода и поколение реактивнооксигенных видов (ров), фагоциты в ответ на различные стимулы иммунной. ROS, созданные во время иммунной активации оказывает мощный антимикробной активности, главным образом через Рось возможность повреждения ДНК и белков, вызывает гибель микроорганизмов. Будучи в состоянии измерить ROS производства можно воспроизвести и с легкостью необходимо для того, чтобы оценить вклад различных путей и молекул, чтобы этот механизм узла обороны. В этой статье мы продемонстрировать использование флуоресцентных зондов и проточная цитометрия обнаружить производства рос. Хотя широко используется, флуоресцентный измерение ROS крайне проблематичным, особенно в том, что касается измерения ROS, вызванных конкретными и не митогенный раздражителей. Мы представляем подробная методология для обнаружения рос в результате конкретных FcγR стимуляции, начиная с поколения макрофагов, грунтование, окрашивание, FcγR cross-linking и заканчивая гранулярных анализа потока.
Введение
Реактивнооксигенных видов (ров), реактивных молекул или свободные радикалы, которые являются побочными продуктами аэробного дыхания (обзор в 1). К ним относятся супероксид анион, пероксид, перекись водорода, Гидроксильная группа и гидроксильных ионов, среди других. В нормальных физиологических условиях Рось производятся главным образом в митохондриях и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы и быстро обезвреженных различными ферментов и белков, таких как супероксиддисмутазы и глутатиона. Преувеличенные производства ROS или дефект в возможность удалять ROS может привести к окислительный стресс, whereby реактивнооксигенных видов со....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол для обработки животных был одобрен институциональный уход животных и использования Комитет (IACUC) из университета Центральной Флориды.
1. поколение костного производные макрофагов (BMDMs)
-
Подготовка Культура СМИ
- Подготовить D10F базы СМИ: чтобы Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), пируват натрия 1 мм, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) и β-меркаптоэтанол 0,05 мм.
Примечание: Хотя это лучше всего использовать свежие D10F СМИ, D10F базы СМИ могут быть готовы до двух недель заранее испол....
- Подготовить D10F базы СМИ: чтобы Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС), пируват натрия 1 мм, 10 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) и β-меркаптоэтанол 0,05 мм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью протокола, изложенные в рамках, мы представляем репрезентативных данных, демонстрируя потока гранулярных обнаружение производства рос в результате стимуляции WT C57BL/6J BMDMs через FcγR. Как и ожидалось, мы наблюдаем минимальные изменения в значения параметров FL1 и FL2 флуоресценции выше фоновых уровней в кератоз клеток (рис. 3A, сравнить «витражи, кератоз» против «безупречная, кератоз» точка участков). Мы отмечаем заметное увеличение в значения параметров FL1 и FL2 флуоресценции.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
DCFH2-да и на основе DHE обнаружения рос является широко используется техника14,15. Простота использования и адаптации этих ROS зонды для кинетического Гонав форматов, флуоресцентной микроскопии или потока гранулярных анализа способствовала их популярности. Однако в наших исследованиях функций макрофагов, FcγR опосредованной, там не представляется стандартный протокол для выполнения этот assay для анализа потока гранулярных клеток сшитого FcγR. Учитыва.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить других членов Tigno-Аранхуэс лаборатории, включая Madelyn Миллер, Омар Кардона, Andjie Jeudy и Roopin Сингха за их помощь в лабораторной мыши и ведением колонии обслуживания. Была оказана поддержка для этого исследования Грант R00 HL122365 и начальных средств для J.T.T-A.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Антитело против мыши CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Антитело против мыши F4/80, конъюгированное с Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| антитело против мыши F4/80, конъюгированное с FITC | BioLegend | 123108 | |
| антитело против мыши/человека CD11b, конъюгированное с Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| бета-меркаптоэтанол (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Бычья сыворотка альбумин (BSA) | FractionV Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Артикул 000664 | |
| CM-H2DCFDA | Молекулярные зонды | C6827 | Могут быть заменой реагента для детектирования окислительного стресса в наборе Enzo |
| Dihydroethidium (DHE) | Молекулярные зонды | D11347 | Могут быть заменой реагента для детектирования супероксида в наборе Enzo |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| ДМФ Безводный | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Крыса IgG2a, κ Изотип Ctrl Антитело | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L глутамин | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC клетки | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| мышь IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-ацетил-L-цистеин | EMD Milipore | 106425 | Может быть заменой ингибитора/поглотителя АФК в наборе Enzo |
| Новоцитарный проточный цитометр с автоподатчиком | Acea | 2060R | |
| Пиоцианин (индуктор АФК) | Кайман химический | 10009594 | Может быть заменой индуктора в наборе Enzo |
| ROS-ID общий набор для обнаружения АФК/супероксида | ENZO | ENZ-51010 | |
| Пируват натрия (100мМ) | Gibco | 11360-070 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%) | Gibco | 25200-056 |
Ссылки
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
