Трансплантат стенозом критических препятствием в инженерии ткани дыхательных путей замены. Расследовать клеточных механизмов лежащие в основе стенозом, мы используем модель мышиных трахеи замена ткани инженерии с семенами костного мононуклеарных клеток (БМ-MNC). Здесь мы подробно нашего протокола, включая эшафот производство, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Заполнение и имплантации биосинтетических ткани инженерии трахеи трансплантата в мышиной модели
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Варианты лечения врожденных или вторичные длинные сегмент трахеи дефектов исторически были ограничены из-за неспособности заменить функциональные ткани. Тканевая инженерия открывает большие перспективы как потенциальное решение с его способностью интегрировать клетки и сигнальных молекул в 3-мерной леску. Последние работы с трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) наблюдается некоторый успех, но их перевод было ограничено трансплантата стенозом, прививка крах и задержки эпителизации. С целью изучения механизмов, вождение эти вопросы, мы разработали модель мыши для имплантации трахеи лоскута ткани инженерии. TETGs были построены с использованием electrospun полимеров полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) в смеси ПЭТ и ПУ (вдохновившей % веса). Подмости затем были посеяны, используя мононуклеарных клеток костного мозга, изолированных от 6-8 недели-старых мышей C57BL/6, градиентного центрифугирования. Десять миллионов клеток за графт были посеяны на просвет эшафот и разрешено инкубировать на ночь перед имплантацией между третьей и седьмой трахеи кольца. Эти смогли резюмировать выводы стеноза и задержки эпителизации, как свидетельствует гистологический анализ и отсутствием кератин 5 и 14 кератин базальных клеток эпителия на иммунофлюоресценции. Эта модель будет служить инструментом для исследования клеточном и молекулярном механизмами, задействованными в принимающей ремоделирования.
Введение
Лонг сегмент трахеи дефекты можно представить как редких врожденных заболеваний как полный трахеи кольца трахеи агенезия, а также травмы, злокачественности и инфекции. Когда более 6 см в 30% от длины трахеи у детей или взрослых, эти дефекты не могут рассматриваться по хирургической реконструкции. Попытки заменить дыхательных путей с аутологичной ткани, трансплантации трупной и искусственные конструкции были страдает от хронической инфекции, грануляции, механических повреждений и стенозом.
Трахеи трансплантатов тканей инженерии (TETGs) потенциально может решить эти проблемы избегая необходимость непрерывного иммунодепрессией. В течение последнего десятилетия были протестированы на животных моделях и клинически используется в редких случаях сострадательного использование1,2,3TETGs. В как в клинических, так и в крупных исследованиях на животных, послеоперационное восстановление из ткани инженерии сократимость замены требуются многочисленные мероприятия по борьбе с стеноза (определяется как > 50% Люминал сужения) и поддержание проходимости дыхательных путей. Дополнительная работа TETG стремился уменьшить этот стеноз путем оценки роли ячейки посева выбора, васкуляризации и дизайн эшафот. Высева выбор ячейки и дизайн эшафот, направленных на восстановление родной трахеи структуры/функции главным образом уделялось эпителиальных клеток дыхательных путей и хондроцитов посеян на различных рассасывающимся, не рассасывающимся и decellularized леса. Как васкуляризации вероятно играет важную роль в развитии стенозом, другие группы были сосредоточены на оптимизации в пробирке или heterotopic модели для ускорения реваскуляризации или neoangiogenesis4. Тем не менее достижение успешных васкуляризации, сохраняя при этом механически компетентным и функциональной TETG остается проблемой. Несмотря на недавние успехи минимизации стенозом остается критическим препятствием для клинических перевод.
Расследовать этот гистопатологические ответ TETG имплантации в естественных условиях, мы разработали баранину модель инженерии ткани трахеи замены. Трансплантат состояла из смешанного полиэтилентерефталат (ПЭТ) и полиуретан (PU) electrospun леску семенами с костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ-МНК). В этой небольшой когорты мы показали, что посеяны аутологичной BM-МНК ускоренного эпителизация и задержки стенозом5. Хотя заполнение с аутологичной BM-МНК улучшение выживаемости, сотовой механизм, по которому BM-МНК модулировать формирования функциональных neotissue остается неясным.
Расследование на сотовой уровне требуется развитие мышиных модели ткани инженерии трахеи замены. Подобно к изучению баранину, мы использовали PET:PU electrospun леску семенами с БМ-МНК. в соответствии с моделью баранину, TETG стеноза разработаны в течение первых двух недель после имплантации1,2,3 ,5. Это предполагает, что мышиных модель резюмировалась патологии, отмечалось ранее, позволяя нам далее опросить клеточных механизмов лежащие в основе стеноз дыхательных путей.
В настоящем докладе мы подробно наш протокол для ткани инженерии трахеи замена в модель мыши, включая производство эшафот, БМ-MNC изоляции, трансплантат посева и имплантации (рис. 1, рис. 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в стране детской больнице.
1. эшафот производства
- Приготовляют раствор полимера нановолокно прекурсоров путем: 1) растворения 8 wt % ПЭТ в 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol и Отопление раствора до 60 ° C и 2) растворяют 3 wt % ПУ в 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol при комнатной температуре.
- После охлаждения, сочетают в себе решения для создания окончательного полимерная смесь ПЭТ и ПУ (вдохновившей).
- Electrospin пу PET+ раствор на стержень из нержавеющей стали (диаметром 1 мм) используя 20 G тупым кончик иглы на 60 мл шприц, заполненные раствором PET:PU с использованием набора питания питания постоянного тока высокого напряжения до + 14 кв на иглу, другой питания постоянного тока высокого напряжения комплект для поставки -3 кв , 5 мл/ч скорость потока и на расстоянии 20 см наконечник к подложке. Вращаться стержень на 350 об/мин во время волокна осаждения.
- Продолжайте electrospinning, пока не будет достигнуто желаемого леска толщина стенок 300 мкм. Слайд леску с стержня, а затем провести его под вакуумом на ночь, чтобы удалить любой остаточный растворитель.
- Стерилизуйте эшафот, с использованием ультрафиолетового света доза 350 МДж/см2 до имплантации.
2. костного мозга-производные мононуклеарных клеток (БМ MNC) заготовки
- Усыпить 6-8 недель старые, женский, C57BL/6 мышь с коктейлем кетамин (200 мг/кг), Ксилазина (20 мг/кг) и кетопрофен (10 мг/кг). Проверьте полный эвтаназии методом хвост пинча. Не забудьте следовать местные руководящие принципы для эвтаназии.
- В стерильных условиях снять кожу бедра и tibias подвергать кости с помощью тонкой ножницы и микро Adson щипцами. Использование Дюмон #5 щипцы и Дюмон #5/45 щипцы для удаления фасции и сухожилий. Отдельные кости и разрезать каждый из них на обоих концах. С помощью 5 мл шприца и иглы 25G, флеш костного мозга в чашке Петри, содержащих 30 мл Розуэллом парк Мемориальный институт (RPMI) средства массовой информации. Фильтр этот RPMI с костного мозга через стрейнер клеток нейлон 70 мкм в 50 мл трубки.
- В кабинете биобезопасности место 5 мл polysurcrose и натрия diatrizoate в 15 мл. Аккуратно добавьте RPMI, содержащие мононуклеарных клеток костного вниз стороне трубки, чтобы избежать смешивания двух слоев. Центрифуги, на 461 x g 30 мин с «тормоз 1» на 24 ° C.
Примечание: На наших центрифуг, стенды тормозные 1 для самой длинной истекло время замедления. - Из трех слоев сформирована отказаться от верхнего слоя (розовый) плазмы и собирать среднего (прозрачный) слой, состоящий из мононуклеарных клеток костного мозга. Слейте осадок красных кровяных клеток.
- Разбавить мононуклеарных клеток костного мозга (БМ-MNC) в-фосфатный буфер (PBS) в соотношении 1:1 и центрифуги на 461 x g 10 мин с «тормоз 9» на 24 ° C.
- Удалить супернатант и разбавленных лепешка с 5 мл ФСБ. Центрифуги, на 461 x g 10 мин с «тормоз 9» на 24 ° C.
- Удалить супернатант и разбавленных лепешка с ~ 10 мл RPMI.
- Развести 10 мкл раствора BM-МНК с равным объемом 0,4% Трипановый синий в 1 мл. Место 10 мкл раствора в ячейке подсчета палата слайд. Подсчет количества ячеек, используя счетчик автоматизированных клеток. Повторите шаг и вычислить среднее количество клеток.
Примечание: Средняя клеток количество клеток 1 X 10-8 был получен от использования двух доноров мышей. Это будет эквивалентна двум бедра, и два tibias, которые костного изолирован от. - Центрифуга BM-MNC решение на 461 x g 10 мин с «Тормоз 9» на 24 ° C. Удалить супернатант и разбавленных концентрации клеток до 107 клеток/трансплантата.
Примечание: Мы изучили посева эффективности между 1, 10 и 100 миллионов клеток и обнаружили, что 10 миллионов клеток за графт дает наивысшую эффективность посева.
3. клетки, посев на графтов
- Мера длины подмостей и в случае необходимости, разрежьте их длиной 5 мм.
- Предварительно влажные леса с 5 мкл RPMI для 5 минут удалить RPMI.
- Добавьте 5 мкл раствора BM-MNC в Люмене эшафот за 10 мин.
- Передайте иглой 21G через просвет трансплантата и инкубировать трансплантата в 1000 мкл RPMI на ночь при 37 ° C в инкубаторе.
4. трансплантата имплантации
Примечание: Следует поддерживать асептической техники во время процедуры имплантации трансплантата.
- 6-8-недельных самок мышей C57BL/6 можно используйте в качестве получателей для ячейки посеян графтов. Придать Энрофлоксацин (10 мг/кг) подкожно 24 ч до операции и как раз перед разрез.
- Весят мыши и администрирование доза 0,1 мл/10 g обезболивающий коктейль кетамин (100 мг/кг), Ксилозин (10 мг/кг) и кетопрофен (5 мг/кг) как анальгезии внутрибрюшинно.
- Проверьте, если был достигнут в плоскости анестезии методом хвост пинча. На подтверждающий уровень седации, применить стерильная глазная мазь для глаз и обрезать волосы на месте операции от подбородка до ключицы. Поместите животное на площадку в спинной лежачем положении. Дезинфекция хирургические сайта, сначала через площадку приготовительный повидон йод, следуют приготовительный площадку алкоголя (70% спирта) и еще раз площадку приготовительный повидон йод.
- Место животного под микроскопом рассечения с ее головы от хирурга. Сделайте разрез средней линии, от ключицы до подъязычной кости с помощью тонкой ножницы и микро Adson щипцами. Очистите фасции с Дюмон #5 и тонкой щипцы Дюмон #7, наряду с стерильным ватным тампоном если необходимо и вставить Colibri втягивающее устройство самостоятельно сохранить.
- Откройте ремешок мышцы (рис. 3А) пинцетом Дюмон #5 и #7 Дюмон тонкой подвергать щитовидный хрящ, перстневидного хряща и трахеи. Тупо отделяют трахею от периодических гортани нервы, параллельно по обе стороны, следуют окружные отделения трахеи от пищевода (рис. 3B).
- С помощью иглы 20G и хирургического маркера, пятно передней части трахеи.
- Идентифицировать трахеи и надрезают ниже третьего кольца трахеи хряща и разрез трахеи, используя беззаботными Тюбинген весной ножницами и пара Дюмон #7 штрафа щипцами. Держа его с тонкой Изогнутый пинцет, безопасный дистальной части трахеи к грудине, с использованием стерильных шовный материал нейлон 9-0 для создания временной трахеостомические (рис. 3C). Примечание: Альтернативная шовный материал, который может быть использован является 9-0 PDS для трахеи имплантации и мышечную reapproximation.
- С иглой 20G и хирургического маркера пятно трансплантата для представления в передней части.
- Имплантат трансплантата, вставки проксимального кзади, проксимальной боковое и проксимальной передней швы, в таком порядке, с использованием 9-0 стерильные нейлон шов (рис. 3D), Дюмон #7 изысканных щипцы и иглодержателя.
- Поверните животных 180° разместить свой хвост от хирурга. Релиз временные трахеостомические. Дистальная трахеи неполно перерезанных гори разрешить использование резекции сегмента как пень для опровержения. Когда больше не нужен, 5 мм трахеи сегмент удаляется полностью.
- Выполните дистальной анастомоза, поместив швы в Аналогичным образом как Проксимальная анастомоза.
- Повторно приблизительный позиции трансплантата и ремешок мышц. Закройте разрез с помощью 9-0 стерильные нейлон швы в шаблон работает.
- Подкожно вводить 0,1 мл бупренорфин (0,1 мг/кг) и поместите животное в клетке восстановления на грелку без других животных в клетке.
- Наблюдать за мыши до тех пор, пока это сознательное и способны передвигаться, а затем перенесите мыши в новой клетке с мягкой подстилкой, влажные Чоу и лечебные воды (ибупрофен, 30 мг/кг) в течение 48 часов. После этого периода времени вернуться к нормальной клетке с другими мышами мыши.
Примечание: Мышей, которые поддерживают респираторного дистресса или снижение активности после имплантации наблюдаются сотрудниками лаборатории и/или животного в инкубаторе 32 ° С. Если это продолжается в течение более чем 48 часов, должен быть euthanized мышей.
5. гистология и иммуногистохимии
Примечание: Гематоксилином и эозином пятна были исполнены с использованием стандартной техники Национальная Детская больница морфология ядро. Иммуногистохимия была выполнена согласно ниже шаги.
- Deparaffinize слайды с помощью 1) ксилол за 5 мин., 2) ксилол за 5 мин, 3) 100% этанола за 5 мин, 4) 90% этанола за 5 мин, 5) 70% этанола за 5 мин, 6) дистиллированной H2O (dH2O) за 5 мин.
- Опускайте слайды в буфера цитрата и место в заполненные водой скороварки. Тепло в течение 10 мин, затем охладите до комнатной температуры. Вымойте с 0.1% бычьего сывороточного альбумина в PBS (BSA-PBS) для 5 минут промыть с dH2O.
Примечание: Отопление также может быть сделано с горячей водой ванну или микроволновую печь на 15 мин. - Инкубируйте слайды с 3% нормальной козьего сыворотки в PBS на 1 ч при комнатной температуре. Стирка с 0.1% BSA-PBS на 5 мин инкубировать в основное антитело с концентрации для кератина, 5 (1: 1000)6, кератин, 14 (1: 250)6 и7 F4/80 (1: 100) для 18 h на ночь при 4 ° C.
- Вымойте с 0,1% BSA-PBS дважды за 10 мин каждый мыть. Проинкубируйте с соответствующие вторичные антитела в концентрации 1: 500 для К5/K14 и 1: 300 F4/80 за 1 ч при комнатной температуре. Вымойте с 0,1% BSA-PBS дважды за 10 мин каждый мыть.
- Крепление с помощью 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) содержащий монтажа СМИ и стекла Крышка скользит. Позвольте сидеть за 30 мин до изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 иллюстрирует схема TETG посева и имплантации. Костный мозг был собран от мышей C57BL/6 и культивировали в пробирке. BM-МНК были изолированы центрифугированием плотности и посеян на TETG. TETGs в сеяный были имплантированы в получателей мышь сингенных C57BL/6.
На рисунке 2 представлен обзор PET:PU TETG леску, производственного процесса. Pet:PU решение ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Разработка модели мыши для инженерии ткани трахеи имеет важное значение в понимании тех факторов, которые имеют ограниченные клинические перевод TETGs; а именно крах трансплантата, стеноз и задержки эпителизации4. Несколько факторов, которые способствуют эти ограничения включают в себя выбор материала имплантата, производственного процесса, эшафот дизайн и клеток, заполнение протоколов. Эта модель позволяет быстрее оценки этих факторов для того, чтобы понять механизмы клеточной и молекулярной, зат...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы признать Роберт Strouse и исследований информации решения и инновации отдела Национальная Детская больница для их поддержки в области графического дизайна. Эта работа была поддержана грантом от НИЗ (NHLBI K08HL138460).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% Хлорид натрия для инъекций | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10cc серологическая пипетка | Falcon | 357551 | |
| 18G 1,5 дюйма. Игла | BD | 305190 | |
| 1мл Шприц | BD | 309659 | |
| 24-луночный планшет | Corning | 3526 | |
| 25cc серологическая пипетка | Falcon | 356535 | |
| 25G 1 дюйм. Игла | BD | 305125 | |
| трубка 50cc | BD | 352070 | |
| Спиртовые прокладки | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| Байтрил (энрофлоксацин) раствор | Bayer Healthcare, LLC | NDC 0859-2267-01 | |
| Черный полиамидный монофиламентный шовный материал, 9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/ 6, женский | Jackson laboratories | 664 | 6-8 недель |
| Цитратный буфер pH 6,0 20x концентрат | ThermoFisher | 5000 | |
| Colibri ретракторы | F.S.T | 17000-04 | |
| Аппликаторы с хлопковыми наконечниками | Fisher scientific | 23-400-118 | |
| Цитокератин 14 Моноклональное антитело | ThermoFisher | MA5-11599 | |
| Щипцы Dumont #5 | F.S.T | 11251-20 | |
| Щипцы Dumont #5/45 | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Тонкие щипцы | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 Антитела к мышам к крысе | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| Тонкие ножницы - Sharp-blunt | F.S.T | 14028-10 | |
| Защитные очки премиум-класса Fisherbrand | ThermoFisher | 12-548-5M | |
| Флюорощит Монтажный носитель с DAPI | Abcam | ab104139 | |
| Козлятник против мыши IgG Вторичное антитело Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11001 | |
| Козье анти кролика IgG Вторичное антитело Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-11012 | |
| Козье анти крыса IgG вторичное Антитело Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | A-21247 | |
| Ибупрофен | Прецизионная доза, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| Прокладки для приготовления йода Professional | disposables international, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| Кератин 5 Поликлональное антитело, очищенное | BioLegend | 905501 | |
| инъекции гидрохлорида кетамина | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Щипцы Micro-Adson | F.S.T | 11018-12 | |
| Микроскоп | Leica | M80 | |
| Губки нетканые | Covidien | 441401 | |
| Мазь офтальмологическая | Dechra Ветеринарные изделия | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| ПЭТ/ПУ (Полиэтилен терефталат и Полиуретан) скаффолды | из нановолокна | индивидуальному заказу | |
| BD | 353003 | ||
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875-093 | |
| TISH Иглодержатель/щипцы | Micrins | MI1540 | |
| Триммер | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tü bingen Пружинные ножницы | F.S.T | 15008-08 | |
| Рециркулятор теплой воды | Gaymar | TP-700 | |
| Ксилазин стерильный раствор | Akorn здоровье животных | NDC 59399-110-20 |
Ссылки
- Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Jungebluth, P., et al. Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study. The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).
- Elliott, M. J., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study. The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).
- Clark, E. S., et al. Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).
- Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool. American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).
- Onwuka, E., et al. The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft. Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).
- Grimmer, J. F., et al. Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).
- Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. Tracheal reconstruction in a canine model. Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).
- Haag, J., et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue. Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).
- Best, C. A., et al. Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
