Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59194

⸱

10 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Northwestern University, 2Division of Pediatric Surgery, Ann & Robert H. Lurie Children's Hospital of Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Enteroids появляются как модель роман в исследовании болезней человека. Протокол описывает как имитировать модель enteroid человека некротизирующего энтероколита, используя липополисахарида (LPS) лечение enteroids, созданный из новорожденных ткани. Собранные enteroids демонстрируют воспалительные изменения наподобие тех, которые видели в человека некротизирующего энтероколита.

Аннотация

Некротизирующего энтероколита (НЭК) разрушительное заболевание новорожденных. Он характеризуется несколькими патофизиологические изменения в человека кишечного эпителия, приводит к увеличению проницаемости кишечника, нарушениями реституции и возросла клеточной смерти. Хотя существует множество животных моделей NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. Кроме того это этически сложный для изучения патофизиологии болезни или роман терапевтических агентов непосредственно в человеке, особенно детей. Таким образом весьма желательно разработать модель Роман NEC с использованием тканей человека. Enteroids, 3-мерной organoids, производный от клеток кишечного эпителия. Они идеально подходят для изучения сложных физиологических взаимодействий, сигнализации ячейки и хост Возбудитель обороне. В этой рукописи мы описываем протокол этого человека enteroids культур после изоляции кишечных стволовые клетки от пациентов, перенесших резекция кишечника. Склеп клетки культивировали в СМИ, содержит факторы роста, которые поощряют дифференцировку в различных родной типы клеток человека кишечного эпителия. Эти клетки выращивают в смесь синтетических, коллагеновых белков, которые служат в качестве лески, подражая внеклеточных базальной мембраны. В результате enteroids развивать апикальной базолатеральной полярности. Совместное управление липополисахарида (LPS) в средствах массовой информации вызывает воспалительной реакции в enteroids, ведущих к гистологических, генетические и белка выражение изменения, аналогичные тем, которые видели в человека NEC. Экспериментальная модель NEC с использованием тканей человека может предоставить более точные платформу для наркотиков и лечения тестирования до испытания на человеке, как мы стремимся определить лекарство от этой болезни.

Введение

Человеческого enteroids являются ex vivo система 3-мерного культуры генерируется из стволовых клеток, изолированных от кишечных склепы образцов человеческой ткани кишечника. Эта модель наземного разорвать был впервые, Hans Clevers et al. в 2007 году после обнаружения Lgr5 + стволовых клеток в склепы тонкой кишки у мышей1. Их работа заложила основу для установления ex vivo кишечного эпителия культуры несколько типов клеток, которые могут быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. После этого открытия enteroids использовались как Роман модель для изучения нормальной физиологии пищеварения и патофизиологии кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника, хост возбудитель взаимодействия и регенеративной медицины2.

Использование в enteroids как ex vivo модель для изучения кишечных патофизиологии имеет ряд преимуществ перед альтернативные методы. За последние несколько десятилетий Животные модели и увековечен кишечного рака производные клеточных линий использовались для изучения физиологии кишечника3,4,5. Сингл клеточных культур не отражают разнообразие типов клеток в нормальной кишечного эпителия, тем самым не хватает в ячейке кросс talk и сегмент специфичность белков, сигнализации и индуцированных возбудителя болезни6. Стволовые клетки в enteroids дифференцироваться в основных типов эпителиальных клеток, таких как enterocytes, Paneth клетки, бокаловидных клеток, клеток enteroendocrine и более3. Они проявляют полярности, эпителиальные транспортных функций и позволяют для кишечных сегмент специфика6. Поскольку enteroids можно повторить несколько типов клеток кишечного эпителия человека, они могут преодолеть это ограничение признанных систем на основе клеток рака. Со временем производные клеточных линий subcloned и развиваться, чтобы выставлять большее разнообразие в выражение и локализация протеина3. Напротив enteroids может быть пассированной без значительных генетических и физиологических изменений2. Хотя существует множество животных моделей для NEC, ответ на травмы и терапевтические мероприятия может быть сильно варьирует между видами. В результате этих ограничений, терапевтов, полученных от животных моделей неудачу 90% времени при тестировании в человеческих испытаний из-за различий в токсичности или эффективность3. Enteroids служат в качестве перспективных доклинических моделей, которые можно преодолеть эти недостатки, ведущих к лучшему пониманию сложных кишечных патофизиологии и, следовательно, более успешным и экономически эффективных терапевтических инноваций. Существует также недавние свидетельства того, что возраст ткани, создаваемый enteroid остается биологически важных7. Это особенно важная деталь для нашей модели, так как enteroids генерируются из новорожденных ткани, тем самым сохраняя физиологическое значение для пациентов с НВК.

Утилита enteroids как модели заболеваний человека продолжает расширяться, в надежде найти лекарства от серьезных и широко распространенных условий. Некротизирующего энтероколита (НЭК) является разрушительной кишечных заболеваний новорожденных характеризуется кишечных некроза и часто приводит к перфорации кишечника стены, сепсис и смерти8. Из-за сложных и многофакторных патофизиологии NEC точный механизм заболевания не еще не выяснен полностью; Однако повышение проницаемости кишечной ясно было вовлечено в процесс болезни8. Учитывая, что изучение NEC и потенциальных терапевтических агентов является этически сложный в человеке, особенно детей, это крайне желательно использовать биологически соответствующих enteroid модель NEC с использованием тканей человека новорожденных. До настоящего времени enteroids имеют ограниченную роль в изучении NEC. Этот протокол описывает использование enteroids, производный от образцов человеческой ткани кишечника как Роман ex vivo модель для изучения некротизирующего энтероколита.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Одобрение Советом институциональный обзор был получен (СИБ #2013-15152) для сбора образцов ткани от пациентов, перенесших резекция кишечника на Энн и Роберт H. Лурье Детская Больница Чикаго, Чикаго, Иллинойс. Все протоколы были исполнены в соответствии с институциональных и национальных руководящих принципов и правил для благополучия человека. Письменные информированные согласия родителей требуется и получены до взятия пробы во всех случаях.

1. Реагент подготовка

  1. Подготовить раствор культуры средств массовой информации для всей ткани коллекции: 1 Л из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM), 110 мл плода Bovine сыворотки (ФБС), 11 мл пенициллин-стрептомицином (конечная концентрация 1%) и 1,1 мл фильтр стерилизации инсулина (конечная концентрация 0,1%). Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
  2. Подготовка Chelating буфера #1: 30 мл культуры средств массовой информации (как описано в 1.1), 600 мкл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (конечная концентрация 10 мм), 300 мкл гентамицина (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%). Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка Chelating буфера #2: 30 мл культуры средств массовой информации (как описано в 1.1), 300 мкл 0,5 М ЭДТА (конечная концентрация 5 мм), 300 мкл рабочего раствора гентамицина (конечная концентрация 1%) и 60 мкл амфотерицин B (конечной концентрации 0,2%). Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
  4. Подготовить человека Minigut СМИ: 41.4 мл DMEM/F-12, 5 мл FBS (окончательное 10%), 500 мкл пенициллин-стрептомицином (конечная концентрация 1%), 500 мкл L-глютамин (конечная концентрация 1%), 500 мкл гентамицина (конечная концентрация 1%), 100 мкл амфотерицин B (финал концентрации 0,2%), 500 мкл 1 М N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane сульфоновой кислоты (HEPES) (конечная концентрация 10 мм), 100 x 500 мкл N-2 дополнение, и 1 мл 50 x B-27 доплата за вычетом витамина А суммарный объем 50 мл. Стоковый раствор хранить при температуре-20 ° C.
  5. Подготовить человека полный медиа Minigut: 10 мл человеческого Minigut СМИ (подготовленные в 1.4), 10 µL 100 мкг/мл Wnt3a (конечной концентрации 100 нг/мл), 10 µL 100 мкг/мл Башка (конечной концентрации 100 нг/мл), 10 мкл 1 мг/мл Р-Spondin (конечная концентрация 1 мкг/мл) , 10 мкл 500 мкг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (конечная концентрация 50 нг/мл), 10 мкл 1 M N-ацетилцистеин (конечная концентрация 1 мм), 10 мкл 10 мм Y-27632 (конечная концентрация 10 мкм), 10 мкл 500 мкм A-83 (конечная концентрация 500 Нм), 10 мкл 10 мм SB202190 (окончательный концентрация 10 мкм), 100 мкл 1 M никотинамид (конечная концентрация 10 мм) и 1 мкл 100 мкм [лей] 15-гастрина 1 (конечная концентрация 10 Нм). Объём 10 мл. Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
    Примечание: Решения должны быть использованы в течение 48 ч.

2. склеп изоляции и обшивки из цельной ткани

  1. В то время коллекции в постановляющей части люкс место кишечных тканей человека небольшой образец в холодной Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS). Вымойте образца в холодной DPBS до очищают от табуретки и крови. Магазин образец на 4 ° C в среде RPMI 1640 до готовности для изоляции склеп.
    Примечание: Ткани не могут храниться более чем на 24 ч.
    1. Убедитесь, что образец очищают от табуретки и крови. Используя тонкие рассечения ножницы, удалите любой избыток жира или хирургические клипы/скобы и т.д. Взвесьте образец.
      Примечание: Цель для куска приблизительно 0,75-2,5 г.
  2. Образец нарезать 0,5 см и поместите в 30 мл Хелатирующие буфера #1 (подготовленных на шаге 1.2).
    1. Встряхнуть на низкой скорости для 15 мин при 4 ° C.
    2. Через 100 мкм ячейки фильтра фильтр ткани и отменяет потока через.
  3. Добавьте ткани 30 мл Хелатирующие буфера # 2 (как подготовленные в шаге 1.3).
    1. Встряхнуть на низкой скорости для 15 мин при 4 ° C.
    2. Через стрейнер ячейки 100 мкм фильтр ткани и отменяет потока через.
  4. Разморозить 500 мл базальной мембраны матрицы на льду для использования на этапе 2.8.
  5. Добавление 10 мл холодного DMEM в 50 мл Конические трубки ткани и встряхнуть рукой для 10 s.
    1. Процеживают через сито ячейки 100 мкм и собирать потока через (Label #1). Держите трубку #1 на льду.
    2. Добавить еще 10 мл холодного DMEM в отдельном 50 мл Конические трубки ткани и встряхнуть рукой для 10 s.
    3. Процеживают через сито ячейки 100 мкм и собирать потока через (лейбл #2).
    4. Повторите еще два раза, до тех пор, пока существуют четыре конические трубы с потоком через (помечены трубы #1-4).
  6. Фильтр трубки #1 решение через 100 мкм клеток сетчатый фильтр и передачи потока через в 15 мл Конические трубки (Label #1). Повторите для #2-4.
    1. Центрифуга для 15 мл трубки #1-4 на 200 x g 15 мин при 4 ° C.
  7. Ламинарный шкаф удалить супернатант из трубы #1-4 и отбросить. Избегайте нарушения облако ткани непосредственно над Пелле, даже если это означает, оставив некоторые супернатант.
    1. На дозирование медленно, смешайте гранулы с оставшихся супернатант в трубках #1-4.
    2. Передача смеси из трубы #1-4 в один единый 2 мл Конические трубки.
    3. Центрифуга для конической трубки на 200 x g 20 мин при 4 ° C.
  8. Удалить супернатант и вновь приостановить гранулы в 500 мкл базальной мембраны матрицы.
    Примечание:     все время сохраняйте базальной мембраны матрицы на льду и работают быстро для последующих шагов. Этот продукт очень быстро polymerizes при комнатной температуре.
    1. Обратиться в центр хорошо в пластине 24-ну 50 мкл образца/подвал мембрана матрица подвеска. Это должно появиться, куполовидная.
      Примечание: Использование охлажденной пипеткой советы СПИД в гладкой передачи подвески, минимизации полимеризации.
    2. Повторите 9 раз, чтобы заполнить 10 всего скважин.
  9. Место пластину 24-Ну в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для 30 мин для полимеризации.
  10. Добавьте 500 мкл человеческого Minigut массовой информации полный (как подготовленные на шаге 1.5) в каждой скважине. Замена каждые 2 дня.
  11. После 5-10 дней, когда подающий надежды визуализируется, сбор enteroids. Увидеть шаги 4 и 5 для коллекции инструкций.

3. индукция экспериментальной NEC

  1. Добавьте 10 мкл 5 мг/мл липополисахарида (LPS) 500 мкл человека Minigut массовой информации полный (как подготовленные на шаге 1.5) в каждой скважине на день 0. Замена каждые 2 дня до коллекции.

4. подготовка для встраивания парафин

  1. Осторожно удалите средства массовой информации.
    1. Добавьте 1 mL PBS и аккуратно Пипетка вверх и вниз, чтобы растворить базальной мембраны матрица с осторожностью, чтобы не лизируют enteroids.
    2. Центрифуга для PBS/enteroid смесь в < 300 x g 5 мин для гранул и удаления PBS.
  2. Добавление параформальдегида 4% исправить при комнатной температуре в течение 1 ч.
  3. Центрифуга в < 300 x g 5 мин в гранулах, а затем удалить PBS.
    1. Мыть нежно с 1 мл раствора PBS и центрифуги на < 300 x g 5 мин в гранулах, а затем удалить PBS.
    2. Повторите шаг 4.3.1.
  4. Расплава достаточного объема ткани, обработки лари (около 300 мкл), поместив желаемую сумму в коническую пробирку и потепление в инкубатор сухой ванны при 65 ° C для 3-10 мин до жидкости.
    1. Добавьте гель Пелле обработку ткани и осторожно перемешать.
    2. На coverslip место небольшое кольцо клонирования.
    3. Пипетка обработки гель и enteroid смесь в клонирования кольцо монтируется на coverslip ткани.
  5. Разрешить ткани, обработки гель и enteroid смесь для закрепления на 4 ° C на 1 ч.
    1. Погружаться клонирования кольцо с затвердевшей смеси в 70% этанола в подготовке для встраивания парафина.

5. Enteroid коллекция для РНК и белка добычу

  1. Осторожно удалите человека Minigut массовой информации полный из каждой скважины.
  2. Добавьте 1 mL PBS и аккуратно Пипетка вверх и вниз, чтобы растворить матрице базальной мембраны. Будьте осторожны, чтобы не разбить enteroids.
    1. Поместите смесь PBS/enteroid в стерильные 2 мл Конические трубки.
    2. Центрифуга в < 300 x g за 5 мин до Пелле.
    3. Осторожно удалите PBS, стараясь не удалить enteroids.
  3. Повторите шаг серии 5.2 еще два раза.
  4. Заморозить в-80 ° С до готовности для белков и/или РНК добыча.
  5. Выполняйте ген выражение и белка изоляции enteroids, используя налаженные qRT-PCR и западный Blotting методы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сразу же после покрытия, свежевыделенных кишечные крипты появляются как удлиненные стержней. В течение часов enteroid будет принимать круглый вид(рисунок 1). В течение следующих нескольких дней enteroids начнет формирование сфер, как показано на рисунке 1b. Начинающие должны происходить между 5-10 дней (рис. 1c) и enteroid коллекции должно происходит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот роман ex vivo человека кишечные enteroid модель служит полезным методом для изучения дисфункции кишечника барьер в некротизирующего энтероколита (НЭК). Представленные здесь методы обработки enteroid были адаптированы из предыдущей работы Drs. Misty добра, Майкл Helmrath и Джейсон Wertheim10,,1112.

Детали окружающего всей коллекции тканей и время склеп изоляции являются важнейшие шаги в этом прото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальный институт здравоохранения Институт диабета и пищеварительной и Грант болезни почек (K08DK106450) и Джей Гросфельд премию от Американской ассоциации детской хирургической C.J.H.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегидThermoFisherAAJ19943K2
A-83R& D Tocris2939/10
Амфотерицин BThermoFisher15290026
добавка B-27 минус витамин AThermoFisher17504-044
Матрица базальной мембраны (Matrigel)CorningCB-40230C
DMEM/F-12ThermoFisherMT-16-405-CV
Dulbecco' s Модифицированный Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11-965-118
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS)ThermoFisher14190-144
Эпидермальный фактор роста (EGF)SigmaE9644-.2MG
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaEDS-500G
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gemini Bio-Pro100-125
ГентамицинSigmaG5013-1G
GlutaMAX ( L-глютамин)ThermoFisher35050-061
ИнсулинSigmaI9278-5mL
[лей] 15-гастрин 1SigmaG9145-.1MG
Липополисахарид (ЛПС)SigmaL2630-25MG
N-2 добавкаThermoFisher17502-048
N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота (HEPES)ThermoFisher15630-080
N-ацетилцистеинSigmaA9165-5G
никотинамидSigmaN0636-100G
NogginR& D Systems INC6057-NG/CF
Пенициллин-стрептомицинThermoFisher15140-148
Фосфатный буферный раствор (PBS)SigmaP5368-5X10PAK
RPMI 1640 Среднийинвитроген11875093
R-спондиномPEPROTECH INC120-38
SB202190SigmaS7067-5MG
Гель для обработки тканей (Histogel)ThermoFisher22-110-678
Wnt3aR& Д Системс ИНК5036-WN-010
Y-27632СигмаY0503-1MG

Ссылки

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  2. Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  3. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
  4. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
  5. Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
  6. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  7. Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  8. Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
  9. Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
  10. Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).
  11. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).
  12. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
  13. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  14. Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
  15. Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
  16. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Toll 4qRT PCR
Роман человеческого эпителиального Enteroid модель развития некротизирующего энтероколита
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.