Методическая статья

Средне-пропускная способность, отбор проб для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы

DOI:

10.3791/59212

⸱

1 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь, две средних-пропускная способность анализов для оценки воздействия на Ca2 +-описаны сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экрана быстро и легко большое количество соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CA2 +-сигнализации имеет важное значение для функции нормальных клеток спермы и мужской фертильности. Аналогично реакция Акросома имеет жизненно важное значение для способности человека сперматозоид проникает вителлинового и оплодотворить яйцеклетку. Именно поэтому представляет большой интерес для проверки соединений (например, экологические химических веществ или наркотиков кандидатов) за их влияние на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы либо для изучения потенциального неблагоприятного воздействия на человека сперматозоид функции или для изучения возможной роли в качестве средства контрацепции. Здесь описаны два анализов средне-пропускная способность: 1) на основе флуоресценции assay для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческой спермы и 2) изображения гранулярных assay для оценки реакции Акросома в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экран большое количество соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Кроме того анализов может использоваться для создания узкоспециализированных доза реакция кривых индивидуальных соединений, определить потенциальные аддитивности/синергизм для соединения двух или более и для изучения режима фармакологических действий путем конкурентного ингибирования эксперименты с ингибиторами CatSper.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель двух анализов, описанные здесь является изучить воздействие на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы, как уже было показано для нескольких соединений в ряде публикаций, используя эти assays1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-сигнализации и Акросома реакции являются жизненно важное значение для нормального человека сперматозоид функцию и плодовитость мужчины.

Общая цель клетки спермы человека заключается в том, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Чтобы иметь возможность успешно и естественно оплодотворить яйцеклетку, функции клетки спермы должно регулироваться плотно во время путешествия сперматозоид через женского репродуктивного тракта8,9. Многие из функций клеток спермы регулируются через внутриклеточные Ca2 +-концентрация [Ca2 +]я (например, спермы моторики, хемотаксис и Акросома реакции)10. Кроме того процесс созревания, называется капацитации, который оказывает сперматозоид способен подкормки яйцо, это частично регулируется [Ca2 +],я10. CA2 +-экструзия Ca2 +-АТФазы насосы11 поддерживать приблизительно 20.000 раза Ca2 +-градиента над человеческой спермы клеточной мембраны, с отдыха [Ca2 +]я 50-100 Нм. Если Ca2 + разрешается пересекать клеточной мембраны (например, путем открытия Ca2 +-каналы), значительный приток Ca2 + происходит, что приводит к высоте [Ca2 +]я. Однако, также носит сперматозоид внутриклеточных Ca2 +-магазины, которые могут освободить Ca2 + и, таким образом, также дать подняться над уровнем моря [Ca2 +]я12. Интересно, что все канал опосредованной Ca2 +-приток в клетках человека спермы до настоящего времени были найдены происходят через CatSper (Catионный канал Sperm), который только выражается в сперматозоиды11. В клетках человека спермы, CatSper активируется эндогенные лиганды прогестерона и простагландинов через собственный лигандом привязки сайтов13,14,15, приводит к быстрому Ca2 +-приток в сперматозоид. Два основных источника возле яйца обеспечивают высокий уровень эти эндогенные лиганды. Один является фолликулярная жидкость, которая содержит высокий уровень прогестерона16. Фолликулярная жидкость освобождается от зрелых фолликулов вместе с яйцо в овуляции и смешивается с жидкостью в пределах яйцеводов17. Другим основным источником является кучевые клетки, которые окружают яйцо и освободить высокий уровень прогестерона и простагландинов. Прогестерон индуцированной Ca2 +-приток в клетки спермы было показано посредником хемотаксис к яйцо9,18, контролировать19,подвижности сперматозоидов20 и стимулировать Акросома 21реакция. Срабатывание этих отдельных [Ca2 +]я-регулируемые спермы функций в правильном порядке и в нужное время имеет решающее значение для оплодотворения яйцеклетки8. В соответствии с этим, субоптимальный прогестерон индуцированной Ca2 +-приток был найден ассоциируется с снижением мужской фертильности22,23,24,25,26 ,27,,2829 и функциональных CatSper имеет важное значение для мужской плодовитости26,30,,3132, 33,34,35,36.

Как сперматозоиды достигают яйцо, последовательность событий должны иметь место для оплодотворение происходит: 1 клетки спермы должны проникнуть окружающие отель cumulus слоя клеток, 2) привязки к zona pellucida, 3) exocytose акросомной содержание, так называемый Акросома реакции 37, 4) проникают zona pellucida и 5) предохранитель с яйцо мембраны для завершения оплодотворение38. Чтобы иметь возможность пройти через эти шаги и оплодотворить яйцеклетку, сперматозоид должны сначала пройти капацитации11, которая начинается как клетки спермы оставить семенной жидкости, содержащие «decapacitating» факторов39 и плавать в жидкости самка репродуктивного тракта с высоким уровнем бикарбоната и альбумина37. Капацитации выносит сперматозоиды могут пройти гиперактивацию, форма подвижности с энергичной избиение жгутика, и Акросома реакции37. Гиперактивными подвижности требуется для проникновения в zona pellucida40, и Акросома содержит различные гидролитических ферментов, которые помогают этот процесс проникновения41. Кроме того реакция Акросома отрисовывает клетки спермы, способных слияния с яйцом, подвергая конкретных мембранных белков на поверхности сперматозоидов необходимых для спермы яйцо фьюжн42. Следовательно, возможность пройти гиперактивацию и Акросома реакции, так необходимых для успешного оплодотворения яйцеклетки40,42. Вопреки тому, что видел для мыши сперматозоиды43,,4445только человеческие сперматозоиды, которые сохранились Акросома можно привязать к zona pellucida46. Когда человека клетки спермы привязаны к zona pellucida, они должны пройти Акросома реакции как проникнуть вителлинового41 , так и для предоставления конкретных мембранных белков, которые необходимы для синтеза с яйцо38. Таким образом, время реакции Акросома в человеческой спермы имеет решающее значение для оплодотворение произойти.

Как описано выше, Ca2 +-сигнализации имеет жизненно важное значение для нормальной спермы функция8, и это, следовательно, большой интерес для экрана большого числа соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческих клеток спермы. Точно так же как только человеческие сперматозоиды, которые проходят Акросома реакции в нужное время и место может проникнуть вителлинового и оплодотворить яйца46,47, это также большой интерес, чтобы иметь возможность проверить соединения на их способность влияет на Акросома реакции в человеческой спермы. С этой целью, описаны два скрининга средне-пропускная способность анализов: 1) assay для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческие сперматозоиды и 2) assay для получения возможности побудить Акросома реакции в человеческих клеток спермы.

Проба 1 является средне-пропускная способность Ca2 +-сигнализации assay. Этот метод на основе чтения флуоресценции пластины отслеживает изменения в флуоресцировании как функцию от времени одновременно в нескольких скважин. Ca2 +-чувствительных Люминесцентную краску, Fluo-4 имеет Kd для Ca2 +≈ 335 Нм и клеток permeant в форме Эстер AM (acetoxymethyl). С помощью флуоресцентного-4, это можно измерить изменения в [Ca2 +]я со временем и после добавления соединений, представляющих интерес для клеток спермы. Проба была разработана лабораторией Timo Strünker в 201113 и с тех пор был использован в нескольких исследованиях на экране соединений для воздействия на Ca2 +-сигнализации в человеческой спермы1,2,3, 4,5. Также подобный метод использовался для экран несколько наркотиков кандидатов48. Кроме того этот assay также полезна для оценки режима фармакологических действий1,2,3,4,5,, доза реакция кривых1 2,3,4,5, конкурентного ингибирования1,2, аддитивности1,2и3 синергизм соединений, представляющих интерес.

Проба 2 относится средне-пропускная способность Акросома реакции. Этот метод на основе цитометр изображения измеряет количество жизнеспособных отреагировали Акросома сперматозоидов в выборке, используя три Краски люминесцентные, флуоресцентные: пропидий йодидом (PI), FITC-сочетании Лектин Pisum sativum (FITC-PSA) и Hoechst 33342. Проба была изменена от аналогичного метода на основе цитометрии потока Zoppino et al.49 и был использован в нескольких исследованиях6,7. Что касается Ca2 +-сигнализации пробирного, этот assay Акросома реакция может также использоваться для оценки доза реакция кривых, ингибирование, аддитивности и синергизм соединений, представляющих интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сбор и анализ образцов человеческой спермы в протоколах соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований столицы региона Дании. Все образцы спермы были получены после информированного согласия от безвозмездных доноров. После родов образцы были полностью анонимными. Для их неудобства каждый донор получил гонорар в размере 500 датских крон (около $75 долларов США) на сэмпл. Образцы были проанализированы в день доставки и затем уничтожены сразу же после лабораторных экспериментов.

Примечание: Средняя пропускная способность Ca2 +-сигнализации пробирного описан в шаги 4-5 и пробирного реакции Акросома средней пропускной способности в шаги 6-7. Протокол для подготовки среднего человека трубной жидкости (HTF+) описано в шаге 1, и очищению клеток спермы для анализов это описано в шагах 2-3.

1. Подготовка среднего человека трубной жидкости (HTF+)

Примечание: Использование объемных колбы соответствующих размеров, 1 Л Измерительный цилиндр, Магнитная мешалка, соли, перечисленных в таблице 1 и таблице 2, вода очищенная, 0,2 мкм поры фильтра и 50 мл пластиковых труб.

  1. Подготовка запасов растворов солей в очищенной воде (таблица 1).
    1. Добавьте количество соли, перечисленных в таблице 1 для объемной колбу соответствующего размера, добавить немного ниже желаемого объема очищенной воды и смеси хорошо с использованием магнитной мешалкой.
    2. Когда соль полностью растворяется, удалите магнит и заливки очищенной водой для желаемого конечного объема.
  2. Передача акций решения к бутылке и хранить до использования.
    Примечание: Запасов решения могут храниться и повторно для более длительных периодов времени: глюкозы и HEPES при-20 ° C и других запасов решения при комнатной температуре (RT).
  3. Подготовка 1 Л HTF+ среды из запасов растворов (таблица 2).
    1. Убедитесь, что все акции решения полностью растворяются и хорошо перемешать перед использованием.
    2. Добавьте количество Стоковый раствор и соли, перечисленные в таблице 2 к 1 Л, Измерительный цилиндр и добавьте 900 мл очищенной воды.
    3. Смеси хорошо с использованием магнитной мешалкой и скорректировать рН до 7,35 с растворе NaOH.
    4. Удалите магнит и добавьте очищенную воду до 1000 мл.
  4. Стерильный фильтрат HTF+ средний через 0,2 мкм поры фильтра, аликвота средних HTF+ 50 мл пластиковых труб и хранить при 4 ° C до использования.
  5. Как раз перед запуском эксперимент, мкл 165 Na пирувата в 50 мл Алиготе получить окончательный концентрации Na пируват 0,33 мм.
    Примечание: Человека трубной текучей среды также можно получить из различных коммерческих поставщиков. При использовании 4 мм HCO3– средний, образцы можно инкубировали с закрытой крышкой в инкубаторе без дополнительных CO2 в воздухе без большие сугробы в pH. Если доступен CO2 инкубатора, соответствующее количество CO2 может рассчитываться с помощью уравнение Henderson Hasselbalch и используется. Если используется 25 мм HCO3– средний, образцы следует инкубировали с открытой крышкой в инкубаторе2 CO с воздухом, содержащий соответствующее количество CO2 (в зависимости от атмосферного давления, обычно между 5-10%) чтобы избежать дрейф в pH. Точное количество CO2 могут рассчитываться с использованием уравнения Henderson Hasselbalch.

2. Очистка подвижных сперматозоидов через Swim-up (рис. 1)

Примечание: Используйте чистый широкий громкий пластиковый контейнер для образца спермы, пластиковые трубы 50 мл, инкубатор, стойку для размещения 50 мл пластиковых труб на угол 45°, HTF+ среднего (подготовленные в шаг 1 или полученные от коммерческого провайдера), центрифуги и сыворотку крови человека Альбумин (HSA).

  1. Получите образец свежезаваренным донорской человеческой спермы производится путем мастурбации и произнес в масштабах громкий чистый пластиковый контейнер. Используйте только образцы спермы, которые выполняют параметров, установленных руководством лаборатория ВОЗ по проверке и обработке человеческой спермы.
  2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C на 15-30 минут, чтобы позволить ему для разжижения.
  3. Нагреть до 50 мл среды HTF+ с 4 мм HCO3– – 37 ° C.
  4. Место чистой 50 мл трубки пластмассовые в стойку под углом 45° (для увеличения площади поверхности между жидкости). Используйте 1 тюбик на мл сырой спермы.
  5. Добавьте 4 мл разогретой средних+ HTF каждой из трубок.
  6. Тщательно Пипетка 1 мл образца сжиженного спермы в нижней части каждой трубы, содержащих 4 мл разогретой HTF+. Избегайте выпуска воздушных пузырьков.
  7. Закройте крышки и инкубировать трубы при 37 ° C в течение 1 ч.
  8. Аккуратно аспирационная и передать столько верхней дроби (HTF+ с подвижные сперматозоиды) максимально новой пластиковой трубки 15 мл, при уделении внимания, что ничего из нижней часть (Семён с сперматозоидов и мертвых клеток) включен. Как правило это безопасно для передачи 3,5 мл Топ фракции, не нарушая нижней доли. Чтобы избежать всасывания турбулентности, отрезать внешний 1-2 мм кончика пипетки под углом 45° для получения большего открытия.
  9. Заполните вверх пластиковой трубки 15 мл с HTF+ мыть клетки и центрифуги трубки на 700 x g 10 мин на RT.
  10. Аккуратно аспирационная и удалить супернатант и Ресуспензируйте сперматозоид Пелле в 2 мл+HTF.
  11. Передать две небольшие пластиковые трубы для оценки концентрации сперматозоидов 20 мкл суспензии спермы (см. шаг 3).
  12. Заполните вверх пластиковой трубки 15 мл с HTF+ мыть клетки и центрифуги трубки на 700 x g 10 мин на RT.
  13. Аккуратно аспирационная и удалить супернатант и Ресуспензируйте сперматозоид гранул до 10 x 106 клеток/мл (основанный на концентрации клеток, начисленных на шаге 2.11).
    1. Для экспериментов с использованием снимите capacitated сперматозоиды (обычные Ca2 +-сигнализации пробирного)
      1. Ресуспензируйте клетки в HTF+ с 4 мм HCO3–.
      2. Мкл 30 человеческого сывороточного альбумина (HSA) (100 мг/мл) на мл HTF+ для получения конечной концентрации 3 мг/мл.
      3. Закройте крышкой и инкубировать ≥1 ч при 37 ° C.
    2. Для экспериментов с использованием полномочия сперматозоиды (Акросома реакции проба)
      1. Ресуспензируйте клетки в HTF+ с 25 мм HCO3–.
      2. 30 мкл HSA (100 мг/мл), мл HTF+ для получения конечной концентрации 3 мг/мл.
      3. Слегка прикрепите крышки и проинкубируйте ≥3 ч при 37 ° C с соответствующее количество CO2 (см. шаг 1, обычно между 5-10% CO2).

3. Подсчет клеток спермы

Примечание: Сперматозоиды могут либо учитываться вручную50 или с использованием изображения цитометр51, как описано здесь. Использовать изображения цитометр, вортекс, С100 буфера, SP1-кассету, кромки очищенного сперматозоиды (подготовленных на шаге 2).

  1. Разбавьте 20 мкл аликвота фактор 10, 20, 30, 50 или 90 С100 буфера, используя 2-мл пробирку круглым дном согласно ожидаемой концентрации (оценены ручной проверки гранул в шаге 2.10). Использование разрежения, которая ближе всего к концентрации ожидается (то есть, если концентрация 15 х 106 клеток спермы на мл после того, как ожидается, кромки затем разбавить 20 мкл образца спермы с 380 мкл буфера S100 [коэффициент разбавления 20]).
  2. Смесь хорошо для 10 s с помощью вихревой смеситель на максимальные 700 об/мин, погрузите SP1-кассета в образце и нажмите белый поршень полностью вниз аспирата Алиготе образца в кассету.
  3. Открыть изображение цитометр, место кассеты в лоток и запустите пробирного Фото из PI витражи человеческих клеток спермы Assay согласно прикладной разрежения фактор (выбран на шаге 3.1).
  4. Повторите шаг 3.1-3.3 с еще 20 мкл пример, используя коэффициент разрежения, ближе всего к измеренная концентрация, полученные из первых 20 мкл пример.
  5. Вычислите среднее сперматозоид концентрации от двух измерений.
  6. Умножение означает спермы концентрации клеток с исходной громкости для получения числа общей сперматозоид (на шаге 2, этот исходный объем-2 мл).

4. измерение изменений в свободной внутриклеточных Ca2 +-концентрация ([Ca2 +]я) с помощью Ca2 +- флуориметрия (рис. 2)

Примечание: Использовать флуоресценции пластины читатель, 384 несколькими хорошо пластины, Fluo-4 утра, кромки очищенный сперматозоиды (подготовленные в шаг 2), соединения интереса а также позитивные и негативные элементы, автоматический репитер пипетки и 12-канальный дозатор.

  1. Готовить 2 мм Fluo-4 утра складе, добавив 22.7 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флаконе 50 мкг Fluo-4 утра и хорошо перемешайте трубки.
  2. Добавьте новый тест трубки Алиготе 700 мкл восстановленные спермы кромки подвески (полномочия или ООН capacitated, как об этом говорится в шаг 2). 700 мкл пример спермы является сумма, необходимая для анализа одной строке 24 скважин в 384-микрорезервуар пластины (используется для проверки 3 управления и 9 соединений в Дуплеты).
  3. 3.5 мкл Fluo-4 AM Fluo-4 утра Стоковый раствор для 700 мкл суспензии спермы для получения конечной концентрации 10 мкм.
  4. Инкубируйте образца для 45 минут при 37 ° C, защищать от света.
  5. Центрифуга для образца на 700 x g 10 мин, аспирационная и удалить супернатант удалить избыток Fluo-4.
  6. Ресуспензируйте окрашенных гранул в HTF+ до 5 х 106 клеток/мл (т.е., использование 2 x объем суспензии клеток, сделанной в шаге 4.2)
  7. Приготовляют разведения соединений и элементов управления (может быть сделано в периоды инкубации и центрифугирования в шаге 4.4 и 4.5, соответственно).
    1. Ослабить соединения, а также отрицательный контроль (буфер с транспортного средства) и положительный контроль (Прогестерон) в+HTF. Разбавьте соединений и элементов управления для 3 x желаемой конечной концентрации, как они являются разбавленных 1:3, когда они добавляются в сперматозоиды в шаге 4.16.
    2. Место труб с разведения в стойку с расстоянием между трубами, соответствующее расстояние между пипетки Советы 12-канальный дозатор на шаге 4.16.
  8. Используйте автоматический репитер пипетки (24 этапа 50 мкл).
    1. Mix Fluo-4 запятнана спермы нежно закупорить всю сумму вверх и вниз один раз.
    2. Добавьте аликвоты 50 мкл 24 скважины строки в 384-микрорезервуар пластины.
  9. Место пластину микрорезервуар на читателя пластины флуоресценции при 30 ° C и закройте ящик.
  10. Выберите нужный протокол для Fluo-4. Возбуждения флуоресценции 480 Нм и записи выбросов на 520 Нм. Используйте быстрый цикл сроки с параметром.
    Примечание: Используйте по крайней мере 10 вспышек в колодец и нижней Оптика, если это возможно.
  11. Выберите хорошо в строке и Отрегулируйте усиление целевое значение 20%.
  12. Старт измерения.
  13. Управление базовой линии в течение первых 5 циклов.
    1. Если флуоресцентные индикации увеличивается или уменьшается с течением времени, остановить эксперимент, скорректировать коэффициент усиления и снова начать эксперимент.
    2. Если базовый существенно отличается между отдельными скважин в ряд, либо дозирование в шаге 4.8 был неточным или образец был не смешиваются перед достаточно хорошо закупорить. Выбросите эксперимент.
    3. Если флуоресцентный индикация сопоставимых между скважинами в строке и устойчивый в течение первых 5 циклов, перейдите к следующему шагу.
  14. После 10 циклов (используется для базовых) паузы эксперимент.
  15. Извлечь ящик с микрорезервуар пластины.
  16. Использование 12-канальный дозатор (2 шагов 25 мкл), быстро 25 мкл готовые решения соединений и элементов управления (от шага 4.7) 12 хорошо дубликаты (24 скважины) строки. Решения будут разбавленных 1:3, как скважин уже содержат 50 мкл окрашенных спермы.
  17. Продолжения измерений как можно быстрее (ящик будет автоматически закрыта) чтобы не пропустить флуоресцентные сигналов индуцированных соединений добавил и элементов управления. Изменения в флуоресцировании (ΔF) после добавления элементов управления и соединений теперь быть захвачены.
  18. Запустите эксперимент пока флуоресцентные сигналы были зарегистрированы от позитивного управления и соединения интереса.
  19. Остановить эксперимент и экспорта сырья флуоресценции данные для анализа как в шаге 5.
    Примечание: Как правило Fluo-4 утра был использован как Ca2 +-чувствительных Флюорофор в assay, но другие Ca2 +-чувствительных флуорофоров могут также использоваться, если возбуждения и выбросов спектры подходят с фильтрами в reader пластины флуоресценции. В зависимости от выбора Флюорофор убедитесь, что уровень усиления устанавливается на «безопасные» уровне, где индуцированные флуоресцентные вершины находятся в пределах диапазона измерений документа. Это можно проверить путем добавления одной скважине на конкретные выгоды параметр ionomycin. Если это побудило флуоресцентного сигнала выше порога, ниже прирост и повторите попытку. Некоторые использовать плюрониевого F-127 для помощи загрузки Fluo-4 в1,13, но выяснилось, что это не необходимое2. Максимальное количество строк, измерены одновременно зависит от двух факторов. 1) время цикла документа: Если время цикла является слишком длинным, индуцированная пик [Ca2 +]я могли бы пропустил. Измерить максимум двух строк одновременно, чтобы снизить время цикла; 2) скорость дозирование в шаге 4.16: использование 12-канальный дозатор, это можно быстро добавить 12 различных решений для 12 повторяющиеся скважин (24 скважины) 1 или 2 строк (например, одна строка, предварительно инкубировали с автомобиля и одна строка, предварительно инкубировали с ингибитором) , не пропуская индуцированных Ca2 + пиков. Однако это не рекомендуется пытаться добавить 24 различных решений в две строки для одновременного измерения, как дозирования советы должны быть заменены между двух последовательных шагов дозирования, whereby индуцированных Ca2 + пики могут быть пропущены.

5. анализ данных от Ca2 +- флуориметрия

  1. Откройте сырье флуоресценции полученных данных и экспортированы в шаге 4.
  2. Вычислить среднее из повторяющихся скважин. Если существуют большие различия между дубликатами, отказаться от данных из конкретных скважин.
  3. Определите базовые как первые 10 циклов.
  4. Рассчитать ΔF/F0 (%) как процент изменения в флуоресцировании (ΔF) со временем после добавления элементов управления в отношении средней базальной флюоресценция (0F) в течение 10 циклов первой (базовой) и соединений.
  5. При использовании данных для составления кривых доза реакция, вычтите индикация отрицательного контроля от других скважин, для удаления артефактов дозирования.

6. измерение реакции Акросома

Примечание: Используйте изображения цитометр, инкубатор, флуоресцентных красителей: PI, FITC-PSA и Hoechst 33342, соединения, интерес, а также позитивные и негативные элементы, застывший раствор, содержащий 0,6 М NaHCO3 и 0,37% (v/v) формальдегида в дистиллированной воде, A2 слайд и полномочия кромки очищенный клетки спермы (подготовленных на шаге 2).

  1. Подготовить окрашивание раствора, содержащего PI (5 мкг/мл), FITC-PSA (50 мкг/мл) и Hoechst 33342 (100 мкг/мл) в HTF+, смесь хорошо с помощью вихревой смеситель и защитить его от света до использования.
  2. Готовить растворы соединений и элементов управления в 10 x желаемой конечной концентрации, как они разбавленным 1:10 на шаге 6.5. Всегда включать элемент управления отрицательной (автомобиль) и два положительных управления: конечная концентрация прогестерона 10 мкм и ionomycin 2 мкм конечная концентрация.
  3. Передавать аликвоты 240 мкл полномочия сперматозоидов (подготовленных на шаге 2) пластиковые трубы.
  4. 30 мкл окрашивания решение каждой трубы. Конечная концентрация пятна будет: 0,5 мкг/мл PI, FITC-PSA 5 мкг/мл и 10 мкг/мл Hoechst 33342.
  5. 30 мкл решения с элементами управления или соединений для каждой трубы (1:10 разрежения).
  6. Осторожно перемешать образцы, закупорить вверх и вниз несколько раз или мягкий vortexing. Из-за механического стресса Избегайте чрезмерного смешивания.
  7. Инкубируйте при 37 ° C за 30 мин.
  8. Подготовьте новые пластиковые трубы с 100 мкл застывший раствор, содержащий 0,6 М NaHCO3 и 0,37% (v/v) формальдегида в дистиллированной воде, по одному на пробирку.
  9. После инкубации mix образцы хорошо закупорить и добавьте 50 мкл испытуемого образца трубки с 100 мкл раствора иммобилизации.
  10. Перед загрузкой камеры слайд A2, смешайте образец хорошо закупорить. Тщательно заполните камер с приблизительно 30 мкл без создания пузырьков воздуха.
    Примечание: Во время инкубации, количество подвижных сперматозоидов, как правило, в совокупности. Скопления клеток может нарушить измерений (даже если они исключены). Таким образом очень важно тщательное смешивание, закупорить после инкубации. Аналогичным образом пузырьков воздуха в камерах может нарушить измерения. Таким образом заполните камеры медленно и изменить угол пипеткой, если края жидкости собираются встретиться и создать воздушный пузырь.
  11. Поместите загруженные слайд на лоток цитометр изображения и закрыть лоток.
  12. Выберите протокол FlexiCyte и тиража.
    1. Выберите следующие параметры для протокола FlexiCyte: количество аналитических каналов: 2; Маскирование канал: UV (LED365), это канал, используемый для сегментации изображений; Канал 1: Синий (LED475), время экспозиции 3000 МС, фильтра выбросов 560/35; Канал 2: Зеленый (LED530), воздействие время 500 мс, фильтра выбросов 675/75; Минимальное количество анализируемых клеток: 5000; Исключить агрегированных ячейки: Да.
  13. Повторите шаг 6,9-6.12 до тех пор, пока все образцы были измерены.

7. анализ данных из образа цитометрии

  1. Открытые данные, полученные на шаге 6.
  2. Создайте два следующих участков для оценки измерений.
    1. Создание точечной Hoechst 33342 интенсивности против Hoechst 33342 области на biexponential весах. Этот участок может быть использован для ворот Hoechst 33342 позитивные объекты, которые являются либо слишком мал или слишком велик, чтобы быть человеческих клеток спермы.
    2. Создание точечной из FITC-PSA интенсивности и PI на biexponential весах. Этот участок может быть использован для ослов количество Акросома отреагировали сперматозоидов путем использования квадранта ворот, которая отделяет четыре группы на участке (рис. 3): 1) PI позитивные и положительные группы FITC-PSA: Акросома отреагировали нежизнеспособных клеток спермы; 2) PI отрицательные и положительные группы FITC-PSA: Акросома отреагировали жизнеспособных клеток спермы; 3) PI положительные и FITC-PSA негативных Группа: Акросома нетронутыми нежизнеспособных клеток спермы; и 4) PI отрицательной и FITC-PSA негативных Группа: Акросома нетронутыми жизнеспособных клеток спермы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель результаты эксперимента, тестирование эффект 4 соединений (A, B, C и D) вместе с положительным (Прогестерон) и отрицательной (буфер) управления на [Ca2 +]я в человеческой спермы с использованием средне-пропускная способность Ca2 +-сигнализации пробирного можно увидеть в рисунке 4a. В рисунке 4Вкривой отклика доза прогестерона показано, который был получен от пика ΔF/F0 (%)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Средняя пропускная способность Ca2 + сигнализации что проба основана на измерениях флуоресценции от одного microwells содержит около 250.000 клеток спермы. В среднем захваченного сигнала от всех отдельных клеток спермы в колодец. Assay таким образом обеспечивает что никакой пространственной информации о том, где конкретно в сперматозоид [Ca2 +]я изменилась, в как значительная часть клеток спермы, изменения в [Ca2 +]i занимает место, или как гетерогенной ответ являетс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы признать лаборатории Timo Strünker по надзору за AR и DLE во время их пребывания в его лаборатории. Кроме того мы хотели бы поблагодарить наших коллег в Департаменте рост и размножение, Копенгагенской университетской больницы, Rigshospitalet за их помощь в создании этих двух анализов. Эта работа была поддержана субсидии от Дании инновационный фонд (Грант № 005-2010-3 и 14-2013-4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m поровый фильтрThermo Fisher Scientific, США296-4545
Измерительный цилиндр 1 лThermo Fisher Scientific, США3662-1000
1, 4 и 2 мл пластиковые трубкиEppendorf, Германия30120086 и 0030120094
12-канальный дозаторEppendorf, Германия4861000813
384 многолуночных планшетаGreiner Bio-One, Германия781096
15 и 50 мл пластиковые пробиркиEppendorf, Германия0030122151 и 30122178
A2-slideChemoMetec, Дания942-0001
Автоматический репетир пипеткаEppendorf, Германия4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide mouthed пластиковый контейнер для образца
спермы Диметилсульфоксид (ДМСО)
FITC-связанный лектин Pisum sativum (FITC-PSA)Sigma-Aldrich, ГерманияL0770
Fluo-4 AMThermo Fisher Scientific, СШАF14201
FLUOstar OMEGA флуоресцентный микропланшетный ридерBMG Labtech, Германия
Глюкоза безводная
HEPES
Hoechst-33342ChemoMetec,Дания 910-3015
Сывороточный альбумин человека (HSA)Irvine Scientific9988Для добавления к HTF+
Иммобилизующий раствор, содержащий 0,6 М NaHCO<суб>3 и 0,37% (v/v) формальдегида в дистиллированной воде
Инкубатор
KCl
KH2PO4
Магнитная мешалка
MgSO4
Na-лактат
NaCl
NaHCO3
NC-3000 ЦитометрChemoMetec, Дания970-3003
Пипетки и наконечники
пропидия йодида (PI)ChemoMetec, Дания910-3002
Штатив для очищенной воды
для размещения пластиковых пробирок объемом 50 мл под углом
S100 буферChemoMetec, Дания910-0101
SP1-кассетаChemoMetec, Дания941-0006
Мерные колбы соответствующих размеров
Vortexer
для пипеток 45°

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157 (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33 (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31 (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. , (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. , Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9 (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21 (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471 (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471 (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352 (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40(2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21 (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7 (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28 (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288 (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29 (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10 (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61 (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60 (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14 (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30 (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60 (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11 (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33 (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33 (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84 (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18 (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11 (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542 (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13 (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3 (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142 (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48 (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140 (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99 (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29 (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27 (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. , Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97 (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344(2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1 (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CatSper

Похожие статьи