Методическая статья

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 апреля 2019 г.

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем простой цитогенетических техника, с помощью 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для определения частоты оплодотворения и первичного соотношение инвазивных вредитель haplodiploid Bemisia tabaci.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько видов роста сокососущих белокрылки являются одними из наиболее разрушительных наземных вредителей во всем мире благодаря урожая ущерба, который они наносят и вирусов растений, которые они вектор. Несмотря на многочисленные исследования биологии этих видов в различных средах параметра ключа истории жизни, потомство соотношения полов, уделялось мало внимания, но имеет важное значение для прогнозирования динамики народонаселения. Основной секс отношение (соотношение полов в откладки яиц) Bemisia tabaci никогда не сообщалось, но можно найти путем определения скорости оплодотворение яйца это насекомое haplodiploid. Этот метод предполагает dechorionation яйца с отбеливателем, ряд шагов фиксации и применение общего ДНК флуоресцентные пятна, DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole, ДНК связывающих Люминесцентную краску), для привязки к мужского и женского pronuclei. Здесь мы представляем технику и пример его применения, чтобы проверить ли облигатно бактерии, риккетсии sp. nr. bellii, влияние первичной соотношение полов B. tabaci. Этот метод может помочь в демографических исследований белокрылки, или определения, если распределении секс существует с некоторых экологических раздражителей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение распределения секс, или относительно инвестиций в мужские и женские потомство, является краеугольным камнем поведенческой экологии1,2,3. В дополнение к своей власти для тестирования адаптивные модели поведения зная стратегию распределения секс организма может улучшить модели динамики его населения. У многих видов распределение секса контролируется матерей. Чтобы определить распределение секса, важно определить основной соотношение полов или доля женщин в то время яйцо осаждения. Хотя соотношение полов в взрослых с появлением могут предоставлять ключи для секса выделения, дифференциального развития смертности между мужской и женской несовершеннолетних часто может наклонить взрослых соотношение полов существенно. В некоторых видов перепончатокрылых, порядок насекомых, содержащий муравьи, пчелы и осы, основной соотношение полов было определено с цитогенетических анализов, окрашивание эмбрионов для просмотра генетическим ДНК. Потому что перепончатокрылых haplodiploid, зарождающегося мужской яйцо гаплоидным и содержит только женского пронуклеусами (n), а зарождающегося женского яйца диплоидных и содержат как мужчин, так и женский pronuclei (2n). Хотя Aleyrodidae, sap питание семьи клопы (полужесткокрылые) известен как белокрылки, также являются haplodiploid, не было установленной assay найти основной соотношение полов в этих насекомых. Это может быть удивительно, учитывая интенсивность изучения нескольких космополитичный серьезных вредителей в этой семье и важное значение соотношения полов в конкурентных взаимодействий белокрылки4,5,6,7 ,8,9,10 и в динамике народонаселения в целом. В haplodiploid насекомых, соотношения полов непринужденно секс определение систем, позволяя возможность селективного оплодотворение и лабильных соотношения полов, которые зависят от окружающей среды2. Здесь мы представляем технику, чтобы определить основной секс соотношение видов комплекса белокрылки, вместе известные как sweetpotato белокрылки, B. tabaci. Это один из видов имя охватывает более чем 28 видов во всем мире11и включает в себя некоторые из наиболее разрушительных глобальной инвазивных вредителей12,13. Применение этого метода для определения шаблонов выделения секс в B. tabaci и другие Aleyrodidae позволит более тщательное расследование переменных, включая температуру, растения-хозяина, облигатно бактерий или завод/белокрылки патогены, которые могут повлиять белокрылки первичной соотношения полов и динамикой народонаселения белокрылки.

Мы не знают о каких-либо сопоставимых яйцо окрашивание методы B. tabaci. Протокол является удобным по сравнению с пятная методы, используемые для других насекомых яйца14 , как он опускается ночь фиксации шаг и, таким образом, может быть завершена в течение 3 ч. В качестве примера приложения, облигатно бактерии, риккетсии sp. nr. bellii, связан с женской предвзятости в нашей лаборатории линии B. tabaci Ближний Восток Азия незначительные 1 (MEAM1)15,16. В одной линии B. tabaci MEAM1 лаборатории («MAC1, «собранные от Марикопа сельскохозяйственного центра), мы проверить ли риккетсии-инфицированных женщин (R+) оплодотворить больше яиц, чем неинфицированных женщин (R–).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Убедитесь, что вся работа выполняется при комнатной температуре в хорошо проветриваемом помещении или под вытяжного шкафа. Все «капли» в этом протоколе определены как 5 – 20 мкл, в зависимости от предпочтений оператора.

1. Начальная настройка

  1. Разрешить женского белокрылки к разведению на чистые листья. Для откладки яиц Аренас примерами клип клетки или листья, вырезать под размер на агаре в чашке Петри. Сделайте покрываемых отверстие в клетке клип или Петри Обложка для вставки и удаления взрослых. Кроме того, быстро поместить сосуд собранных взрослых на льду и, затем, хранение их на лист. Ограничить время между откладки яиц и яичных фиксации до не более чем 60 мин, для обеспечения наблюдения за переход спермы в отцовской пронуклеусами в яйцах.
    Примечание: Яйца, не удаляются из листьев может воспитываться до совершеннолетия для записи взрослых соотношения полов.
  2. До или во время откладки яиц белокрылки Подготовьте микроскопа, очищая его с мылом и водой, сушки, ну, а затем растяжение кусок парафина фильм за один конец, убедившись, что поверхности пленки парафин не ломаются (рис. 1).
    Примечание: Парафин фильм гидрофобных и полу opaque, позволяя жидкости в виде капель и яйца более легко увидеть.

2. Dechorionation

  1. С бокалом Пастер Пипетка, добавить капель раствор отбеливателя (0,83% гипохлорита натрия) в фильме парафина.
    Примечание: Это проще для отслеживания яйца если только 2-3 яйца в каждой капле. Кроме того чтобы управлять числом большое яйцо, Соберите яйца в капель 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Отбеливатель коррозионные; Надевайте перчатки при обращении с отбеливателем и не вдыхать.
  2. Удалите из листьев взрослых белокрылки.
  3. Поместите лист под микроскопом, чтобы ясно видеть яйца и самостоятельно собирать яйца и тщательно с тонкий зонд. Чтобы сделать зонд, вставьте штифт Надель minuten на 45° или в комфортабельный рабочий угол в кончик расплавленный пипетки (рис. 2).
  4. Передавать яйца отбеливатель или ПБС. При использовании ПБС, удалите 1 x PBS с бокалом Пастер однажды Пипетка все яйца собраны и, затем, добавить отбеливатель яйца.
    Примечание: Когда собирать яйца, медленно поднимите яйцо из своей базы до тех пор, пока стебельков удаляется из листьев. Стебельков липкие, и яйца обычно будет придерживаться кончик зонда до тех пор, пока он погружается в отбеливателя.
    Примечание: Рекомендуется использовать отдельный стекла, которую пипетки Пастера для всех реагентов, и дозаторы могут быть изменены с тепла, чтобы сузить советы и снизить риск случайного аспирационных белокрылки яйца. Чтобы предотвратить остатков и загрязнение, очистите пипетки с дейонизированной водой после каждого использования.
  5. Подождите 10 минут. Если есть интерес в эмбриогенезе в яйцах старше 1 h, оставьте яйца в Отбеливатель для до 15 мин.
    Примечание: Для яйца, которые до 1 ч старый 10 минут вполне достаточно.

3. Фиксация

Примечание: Эти шаги, взяты из Hymenopteran протокол17.

  1. Снимите отбеливатель (содержащие фрагменты Хорион) с стеклянной пипетки Пастера и выбросьте его. Добавьте капли уксусной кислоты кристаллизированной с бокалом Пастер Пипетка и ждать 3 мин.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Продолжите этот шаг под вытяжного шкафа. Ледниковая укусная кислота коррозионные; носить защитные перчатки при обработке Ледниковая укусная кислота и не вдыхать, особенно в сочетании с остаточной отбеливатель.
  2. Удаление Ледниковая укусная кислота с стеклянной пипетки Пастера и добавить капель раствора Кларка (3:1 абсолютного этанола: Ледниковая укусная кислота) с бокалом Пастер Пипетка. Подождите, пока большая часть решения испарится (или 10 мин макс).
  3. Добавьте яйца с стеклянной пипетки Пастера и ждать, пока большая часть этанола испарится (или 10 мин макс) капель на 70% спирте.

4. Окрашивание

  1. Удалите любые остаточные этанола с стеклянной пипетки Пастера и добавить капель ПБС яйца с стеклянной пипетки Пастера получить pH рядом 7.0. Установите микроскопа в камере влажности для предотвращения высыхания, например, в поле Подсказка пустой пипетку с влажной салфеткой внутри (рис. 3). Подождите, по крайней мере 30 мин.
    Примечание: Это лучший момент, если необходима пауза, пока влажность палата может предотвратить усыхание.
  2. Удаление ПБС с стеклянной пипетки Пастера и добавить капель 0,1 мкг/мл DAPI, флуоресцентные пятна ДНК, с бокалом Пастер Пипетка. Установите микроскопа в камере темно влажность и подождите по меньшей мере 15 мин.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: DAPI вызывает раздражение, так что справишься с перчатками.

5. мытье

  1. Удаление DAPI с стеклянной пипетки Пастера.
  2. Добавить капель 1 x TBST (5 x раствор из 30г Tris, 43.8 г NaCl, 5 мл Полисорбат 20 и 1,0 г НАН3 [pH 7.5] и доведены до 1 Л с ПЦР класс воды) на яйца с бокалом Пастер Пипетка. Подождите 5 минут перед удалением 1 x TBST с бокалом пипетка Пастера. Повторите этот шаг 2 раза.

6. Монтаж

  1. После окончательной стирки тщательно Пипетка все яйца из парафина фильма на чистой части микроскопа. Удалите избыток 1 x TBST; Затем, добавить 20 мкл монтажа СМИ (80% глицерина и 20% 1 x TBST с 2% n пропил эпигаллокатехина) и место слайда чистого покрытия поверх яйца.
  2. Для длительного хранения уплотнение крышки слайд с четкой лак и, затем, хранить слайд в темноте на 2 ° C или сразу его просмотра под микроскопом флуоресцентные.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проверить ли риккетсии влияет на скорость Оплодотворение самок MEAM1 B. tabaci , мы воспитал риккетсии-инфицированных (R+) или неинфицированных (R–) B. tabaci вигны растений (Vigna unguiculata) в отдельные клетки на 27 ° C, относительная влажность 70% и 16 h свет/8 h темные фотопериода. + R и R– , четвертый instar белокрылки были тщательно удалены из листьев и изолированных в 200 мкл газа трубы....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол является первым, чтобы захватить оплодотворение ставки или первичной соотношение полов B. tabaci. Задача настоящего Протокола является, что она требует исследователей научиться обрабатывать белокрылки яйца быстро, обеспечить не более, чем 1 час прошло с тех пор яйца были oviposited до тех пор, пока они являются фиксированными. Во время предварительных экспериментов яйца, которые были исправлены в 3 ч или более postoviposition были слишком стар, чтобы наблюдать за оплодотворение, syngamy имели место...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось NSF Грант (DEB-1020460) для М.Ш.Х и USDA AFRI Грант (2010-03752) для М.Ш.Х Авторы благодарят Brennan зер для окрашивания белокрылки яйца с большим мастерством и Дзэн. Авторы благодарят Майка Рихль за разрешение использовать его флуоресцентный микроскоп для изображений. Авторы благодарят Сюзанн Келли и Марко Gebiola за яйца изображений. Авторы благодарят за помощь в решающие моменты в ходе экспериментов Сюзанн Келли и Джимми Конвей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSAny
1x TBSTAny5x раствор, изготовленный из 30 г Tris, 43,8 г NaCl, 5 мл Tween-20 и 1,0 г NaN3 pH 7,5, и доведенный до 1 л с водой для ПЦР
ОтбеливательCloroxЛюбой бытовой отбеливатель будет работать, если его можно разбавить до 0,83% Гипохлорит натрия
Прозрачный лак для ногтейЛюбой
DAPI дилактатSanta Cruz Biotechnologysc300415
ЭтанолЛюбойразбавленный до 70% EtOH
Флуоресцентный микроскопNikonNikon Eclipse 50i был использован в этом эксперименте, но любой флуоресцентный микроскоп с фильтром возбуждения 340/380 нм и увеличением не менее 4-10x можно использовать
Ледяная уксусная кислотаMallinckrodtUN2789
ГлицеринДля
микроскопWildМикроскоп Wild M5A, но любой микроскоп, где оператор может четко видеть яйца белокрылки, может быть использован
Микроскоп Крышки слайдовЛюбыеметоды предназначены для крышек слайдов размером 18 мм х 18 мм. Для больших крышек слайдов потребуется добавить больше монтажных носителей.
Предметные стекла для микроскопаЛюбые
штифты Minuten NadelBioQuip1208SAPins Minuten nadel опциональны для изготовления в качестве зондов с наконечниками для пипеток
NaClAny
NaN3Any
n-пропилгаллатSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmBemis
Pasteur пипеткиFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Одноразовые боросиликатные стеклянные пипетки Пастера 5,75 дюйма. Горелка Бунзена также может потребоваться, если оператор хочет удлинить и сузить пипетки
Вода для ПЦРЛюбые
наконечники для пипетокЛюбыенаконечники для пипеток необязательны для изготовления в виде зондов с минутными штифтами
Надель Маленькая лампа-капельницаЛюбаяДолжна быть установлена на пипетке Пастера
TrisAny
Tween-20Any
этого эксперимента использовался любой

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DAPIRickettsia

Похожие статьи