Изучая РНК посредники РНК активирована во время цикла Mammalian клетки киназы протеина

Протеинкиназа РНК активированный (PKR), также известный как эукариотические инициации фактор 2-альфа киназа 2 (EIF2AK2), является хорошо изученных протеинкиназы, который передает информацию, представленную РНК. Он принадлежит к эукариотических перевод посвящения 2 субъединицы альфа (eIF2α) семейство киназы и фосфорилирует eIF2α на Серин 51 в ответ на инфекцию подавить глобальной перевод¹. В этом контексте PKR активируется вирусный двуцепочечные РНК (двуцепочечных РНК), которые обеспечивают платформу для PKR димеризации и autophosphorylation². В дополнение к eIF2α PKR можно также фосфорилировать p53, субстрат рецепторов инсулина 1, ингибитор κB и c-Jun N-терминальный киназы (JNK) регулировать деятельность многочисленных сигнала трансдукции пути^{3,4,5, 6}.

PKR первоначально была определена как киназы, что фосфорилированных eIF2α во время инфекции полиовируса, признав полиовируса двуцепочечных РНК^7,8. PKR чаще играть многогранной роли за пределами иммунного ответа, и его аномальным активации или неисправности подразумевается в многочисленных заболеваний человека. Активирован/Phosphorylated PKR (pPKR) часто наблюдается во время апоптоз и является общей характеристикой больных дегенеративных заболеваний, особенно нейродегенеративных заболеваний, таких как Хантингтона, Parkinson's и болезнь Альцгеймера^{9 ,10,11,12,13}. Кроме того PKR активируется при различных условиях стресса как метаболический стресс и теплового шока^14,,1516,17. С другой стороны ингибирование PKR приводит к увеличению пролиферации и даже злокачественной трансформации^18,19. PKR функция также имеет важное значение функции нормального мозга и во время цикла клетки как уровень pPKR повышенной во время М этап^20,21,22. В этом контексте pPKR подавляет глобальной перевод и предоставляет подсказки ключевых митотическая сигнальных систем, которые необходимы для надлежащего разделения клетки²⁰. Кроме того длительной активации PKR привела к фазы G2/М, арест клеточного цикла в яичнике китайского хомячка клетки²³. Следовательно PKR фосфорилирование регулируется отрицательной обратной связи для обеспечения быстрого отключения во время М/G1 перехода²¹.

Несмотря на широкий диапазон PKR функция наше понимание PKR активации ограничен из-за отсутствия стандартизированной высок объём экспериментальный подход для сбора и идентификации двуцепочечных РНК, которые можно активировать PKR. Предыдущие исследования показали, что PKR могут взаимодействовать с двуцепочечных РНК, образованный двумя Перевернутый Alu повторяется (IRAlus)^20,24, но возможность существования дополнительных клеточных двуцепочечных РНК, которые можно активировать PKR во время цикла клетки или под условиях стресса в клетках человека был неизученными. Обычный подход при выявлении РНК посредники белок РНК (ОДП) использует УФ свет crosslink РНК-ОДП комплексы^25,,2627. Недавнее исследование применяется этот подход УФ сшивки в системе мыши и определили, что малые ядрышковые РНК может регулировать PKR активации во время метаболический стресс¹⁶. Используя высокие сшивки эффективность формальдегида, мы представили альтернативный метод для определения PKR-взаимодействующих РНК в течение цикла клетки НеЬа клетки²⁸. Аналогичный подход применялся для изучения других dsRBPs например Штауфен и Drosha^29,,30-³¹. Мы обнаружили, что PKR могут взаимодействовать с различными типами некодирующей RNAs такие как короткие перемежаются ядерный элемент (синус), длинные перемежаются ядерный элемент (строка), эндогенного ретровируса элемент (ERV) и даже альфа спутник РНК. Кроме того мы показали, что PKR могут взаимодействовать с митохондриальных РНК (mtRNAs), который формы межмолекулярных двуцепочечных РНК путем дополнительного взаимодействия между стренги тяжелых и легких нить РНК²⁸. Недавние публикации далее поддержали наши данные, что некоторые mtRNAs существуют в дуплексной форме и может активировать dsRNA датчиков, таких как меланома дифференциация связанный белок 5 побудить интерферонов³². Что еще более важно выражение и внутриклеточных локализации mtRNAs модулируются течение клеточного цикла и на различные раздражители, которые могут быть важными в их способность регулировать PKR активации²⁸.

В этой статье, мы представляем подробный протокол для сшивки недавно разработанных формальдегида и иммунопреципитации (fCLIP) метод для захвата и анализа PKR-взаимодействующих РНК в течение клеточного цикла. Мы демонстрируем метод для подготовки образцов арест клеточного цикла с использованием тимидин и Нокодазол. Затем мы представляем fCLIP процесс, чтобы изолировать PKR-прыгните РНК и метод подготовки высокопроизводительного секвенирования библиотеки для идентификации этих молекул РНК. Кроме того мы определить подробные процедуры для анализа PKR-прыгните РНК с помощью qRT ПЦР. В частности мы представляем стренги конкретных обратной транскрипции процедуры для анализа strandedness mtRNAs. Описывается протокол оптимизирован для НеЬа клетки и PKR, но основные шаги, такие, как подготовка образца клеточного цикла, fCLIP и нити конкретных qRT ПЦР-анализа могут быть легко изменены для изучения клеточных двуцепочечных РНК или для определения РНК посредники других dsRBPs.

1. решения и ячейки подготовка

1. Подготовка решения
   1. Для средних культуры клеток Подготовьте среднего для культуры клеток HeLa, добавляя 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) 500 мл Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM).
      Примечание: Антибиотики могут быть добавлены в среде культуры клеток, но мы не использовать антибиотики.
   2. Для параформальдегида 0,1%, растворяют параформальдегида 4% (w/v) 1 x Phosphate-Buffered солевой (PBS) с нагревом на горячей плите и разбавленных сделать 30 мл 0,1% (v/v) параформальдегида, добавив ПБС.
      Предупреждение: Выполнить все шаги в зонта и будьте осторожны, чтобы не кипятите раствор параформальдегида. Защищать от света 0,1% раствор и хранить при 4 ° C. Используйте решение в течение одного месяца.
      Примечание: pH окончательного решения параформальдегида 0,1% (v/v) должна быть около 7.
   3. Подготовка буфера lysis fCLIP: 20 мм трис-HCl (рН 7,5), 15 NaCl, 10 мм ЭДТА, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) X-100 Тритон, лаурилсульфат натрия 0,1% (v/v) (SDS) и Дезоксихолат натрия 0,1% (w/v). Добавьте тройной дистиллированной воды (TDW) 40 мл. Хранить при 4 ° C.
   4. Подготовка fCLIP мыть буфера: 20 мм трис-HCl (рН 7,5), 150 NaCl, ЭДТА 10 мм, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) X-100 Тритон, 0,1% (v/v) SDS и 0,1% (w/v) Дезоксихолат натрия. Добавьте TDW 40 мл. Хранить при 4 ° C.
   5. Подготовка 4 x PK буфера: 400 мм трис-HCl (рН 7,5), 200 мм NaCl, ЭДТА 40 мм и 4% (v/v) SDS. Добавьте TDW 40 мл. Хранить при комнатной температуре.
   6. Подготовка fCLIP Элюирующий буфер: 20 мл 4 x PK буфер, 21 г мочевины и 8,5 мл TDW. Подготовьте свежие.
   7. Подготовить РНК Элюирующий буфер: 0.3 M NaOAc и SDS 2% (w/v). Хранить при комнатной температуре.
   8. 2 x РНК загрузки краситель подготовиться: 0,025% (w/v) бромфеноловый синий, ксилол 0,025% (w/v) cyanol, 5 мм ЭДТА, 0,05% (w/v) SDS и формамид 95% (v/v). Хранить при температуре от-20 ° C.
   9. Подготовка 1 x TBE буфера: 0,089 М трис-боратов и 0,002 М ЭДТА. Подготовка 500 мл буфера КЭ.
2. Подготовка S или M клеток, фаза арестован
   1. Семя 750 000 ~ или ~ 1000000 НеЬа клетки S или M фаза арестован образцы, соответственно. Рост клеток при 37 ° C и 5% CO₂ на 24 часа.
   2. Лечить клетки с тимидина 2 мм и проинкубируйте 18 ч при 37 ° C.
   3. Вымойте клетки два раза с PBS. Добавить свежие СМИ и проинкубируйте 9 ч при 37 ° C.
   4. Для S фазу арестован, ячейками клетки с тимидина 2 мм. Для M фаза арестован клетки лечить клетки с 100 нг/мл Нокодазол. Инкубируйте 15 ч при 37 ° C и хлебоуборка клетки.
      Примечание: Однородности выборок клеточного цикла может быть проверена с помощью СУИМ.

2. формальдегид cross-linking и иммунопреципитации

1. Ячейка урожай
   1. Пример фазы S Соберите клетки с скребок клетки и передачи в коническую пробирку 15 мл. M фазы образец нажмите сторону клетки культуры блюдо для отсоединения M фаза арестован клетки и передачи их в коническую пробирку 15 мл.
      Примечание: Для повышения однородности M фазы арестован клеток, не использовать скребок ячейки.
   2. Центрифуга клетки на 380 x g при комнатной температуре 3 мин удалить супернатант и вновь приостановить с 1 мл холодного PBS и передачи в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
   3. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C за 30 с. удалить супернатант полностью.
2. Сшивки формальдегида
   1. Добавьте 750 мкл параформальдегида 0.1% 10 мин при комнатной температуре, чтобы исправить клетки.
   2. Добавьте 250 мкл 1 М глицин и инкубировать еще 10 мин при комнатной температуре, чтобы утолить реакции. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C за 30 с. удалить супернатант полностью.
   3. Вновь приостановить с 1 мл раствора PBS. Центрифуга клетки на 10000 x g при 4 ° C на 30 s и удалить супернатант.
   4. Вновь приостановить с 400 мкл буфера lysis fCLIP дополнена ингибитор протеазы 0,2% (v/v) и 2% (v/v) АБС битор РНКазы. Инкубируйте на льду за 10 мин и sonicate с помощью ultrasonicator.
   5. Добавьте 11 мкл 5 М NaCl для регулировки концентрации NaCl ~ 150 мм. Вихревой кратко и центрифуги на 21,130 x g при 4 ° C на 15 мин передать предварительно охлажденные 1,5 мл microcentrifuge супернатант.
      Примечание: Сохраните 40 мкл супернатант в новых пластиковых пробирок образца ввода. Храните образца ввода при 4 ° C.
3. Иммунопреципитация
   1. Добавьте 20 мкл белок А бисера в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
   2. Вымойте бусины с 400 мкл буфера lysis fCLIP. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера lysis fCLIP тщательно. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
   3. Мыть Повторите три раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
   4. Вновь приостановите бисер в 300 мкл буфера lysis fCLIP. Добавление 8.3 мкл 5 М NaCl для регулировки концентрации NaCl ~ 150 мм. Добавить 10 мкл антител PKR и Инкубируйте 3 h на вращателе при 4 ° C.
   5. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера мытья fCLIP. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
   6. Повторите шаг мыть два раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
      Примечание: Никогда не использовать вихревой смеситель. Инвертируйте трубку осторожно с руки.
   7. Добавить 300 мкл lysate и Инкубируйте 3 ч при температуре 4 ° C на вращателе.
      Примечание: Длительное время инкубации может привести к увеличению фон привязки.
   8. Центрифуга бусы на 1000 x g при 4 ° C в течение 1 мин удалить супернатант и добавить 400 мкл буфера мытья fCLIP. Аккуратно вновь приостановить бисер, инвертирование 3 ~ 4 раза.
   9. Мыть Повторите три раза. После окончательной стирки полностью удалите супернатант.
   10. Добавьте 300 мкл буфера fCLIP. Инкубируйте в thermomixer 3 часа при 25 ° C до элюировать PKR из бисера.
       Примечание: Подготовьте свежие fCLIP Элюирующий буфер.
   11. Центрифуга на 1000 x g при комнатной температуре и передачи супернатант чистой силицированного трубки.
       Примечание: Пробки microcentrifuge это также нормально, но силицированного трубка предпочтителен для предотвращения испарения во время де сшивки шаг (шаг 2.3.12).
   12. Добавить 300 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и Инкубируйте на ночь на 65 ° C.
       Примечание: Используйте thermomixer с подогревом крышкой, чтобы избежать испарения.
4. Извлечение RNA
   1. Добавьте 580 мкл хлороформ кислота фенола и вихрь 30 s. инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
   2. Вихрь 30 s и центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
   3. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant (например, Glycoblue), и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
   4. Осадок гранулы центрифугированием на максимальной скорости на 4 ° C на 1 час.
      Примечание: Если РНК/ДНК гранулы не наблюдалось, добавьте дополнительные 0,5 мкл coprecipitant и центрифуги для дополнительного 1 ч. продолжить этот шаг до тех пор, пока гранулы РНК/ДНК наблюдаются.
   5. Удалить супернатант и добавить 1 мл 75% этилового спирта. Центрифуга на 12000 x g при 4 ° C за 5 минут повторите шаг мыть еще один раз. Полностью удалить супернатант и сухие гранулы при комнатной температуре.
   6. Добавьте 42 мкл TDW, 5 мкл DNase буфере, 1 мкл битор РНКазы и 2 мкл DNase I. инкубации при 37 ° C в течение 1 ч.
   7. Добавьте 150 мкл TDW и 200 мкл кислота фенола хлороформ. Вихрь 30 s. центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
   8. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant и 1 мл 100% этилового спирта. Инкубируйте на ночь на-80 ° C.
   9. Осадок окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
   10. Вновь приостановите в соответствующее количество TDW.

3. последовательность библиотеки подготовка

1. Удаление рРНК
   1. Вновь приостановите РНК гранулы из шага 2.4.10 с 28 мкл TDW.
      Примечание: Максимальное количество всего РНК должно быть меньше 5 мкг.
   2. Следуйте процедурам, предусмотренным в комплект удаления рРНК справочное руководство для удаления рРНК.
   3. Очистить рРНК истощены РНК, добавив 160 мкл магнитных шариков.
      1. Смешать, закупорить ~ 15 раз и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
      2. Подсоедините трубку на магнитной полосе и удалить супернатант.
      3. Добавить 300 мкл 80% этилового спирта, в то время как бусы по-прежнему придает на магнитный бар и Инкубируйте 30 s.
      4. Замените этилового спирта на свежий раствор 300 мкл. Воздух сухой бусы на магнитный бар для 12 мин при комнатной температуре.
      5. Вновь приостановите бисер в 12 мкл TDW и микс, закупорить 15 раз.
      6. Прикрепите бусы на магнитный бар и переместить супернатант чистой ПЦР-пробирку.
   4. Разрушающим фрагментированных рибосомная РНК (теорией) после процедур, предусмотренных рРНК истощения Kit.
   5. Очистка РНК, добавив 110 мкл магнитных шариков и повторяющиеся шаги 3.1.3.1 для 3.1.3.6.
2. РНК маркировки и адаптер лигирование
   1. На истощенных рРНК РНК добавьте 2 мкл 10 x CIAP буфера, 1 мкл битор РНКазы и 2 мкл Антарктики щелочной фосфатазы. Инкубируйте при 37 ° C для 1 h и затем при 65 ° C за 5 минут, чтобы инактивировать фосфатазы.
   2. Добавьте 3 мкл 10 x PNK буфера, 1.5 мкл битор РНКазы, 1.5 мкл фермента, 0,8 мкл r-СПС и 1.7 мкл TDW T4 ПНК. Инкубируйте при 37 ° C 50 мин.
   3. Добавить 1,5 мкл 10 мм СПС и инкубировать при 37 ° C для дополнительных 40 мин.
   4. Остановите реакции, добавив 170 мкл буфера РНК.
   5. Добавьте 200 мкл хлороформ кислота фенола и вихрь 30 s. центрифуги на 12000 x g при комнатной температуре за 10 мин.
   6. Перевести верхний слой в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant и 1 мл 100% этилового спирта. Инкубируйте на ночь на-80 ° C.
   7. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5. Вновь приостановить в 4,5 мкл TDW и добавить 9 мкл 2 x РНК загрузки красителя.
   8. Тепло образца при 95 ° C за 5 мин и нагрузки на 10% мочевина-страница гель.
   9. Побегите гель на 370 V 40 мин.
      Примечание: Предварительно запустить геля на 370 V 90 мин до загрузки образца.
   10. Вырезать гель в регионе ~ 100 – 500 нуклеотидов и разорвать геля.
   11. Добавить 700 мкл 0,3 М NaCl и инкубировать на ночь при 4 ° C на ротатора.
   12. Передача решения для столбца и центрифуги на максимальной скорости при комнатной температуре в течение 5 мин.
   13. Передача в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл элюата. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant, и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
3. 3' адаптер лигирование
   1. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
   2. Вновь приостановить РНК окатышей в 6,5 мкл TDW и добавить 1 мкл 10 мкм 3' адаптер.
   3. Передача решения в ПЦР-пробирку и Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин.
   4. Добавьте 1 мкл 10 x лигирование буфера, 0.5 мкл битор РНКазы и 1 мкл T4 РНК лигаза 2. Инкубируйте на 28 ° C в течение 1 ч, 25 ° C для 6 h и 22 ° C в течение 6 ч.
   5. Добавьте 12 мкл 2 x РНК загрузки красителя и тепла при 95 ° C за 5 мин.
   6. Гель для очистки 3' адаптер лигируют РНК, как описано в 3.2.9 для 3.2.13.
4. 5' адаптер лигирование
   1. Осадок РНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5.
   2. Вновь приостановить РНК окатышей в 4.2 мкл TDW и добавить 1 мкл 5 мкм 5' адаптер.
   3. Передача решения в ПЦР-пробирку и Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин.
   4. Добавление 0,8 мкл 10 x лигаза буфера, 0.4 мкл битор РНКазы, 0,8 мкл 10 мм АТФ, 0,8 мкл T4 РНК лигаза 1. Инкубируйте на 28 ° C в течение 1 ч, 25 ° C для 6 h и 22 ° C в течение 6 ч.
5. Обратная транскрипция и амплификации PCR
   1. На 5' адаптер перевязаны РНК, добавить 1 мкл 4 мкм грунта обратной транскрипции. Инкубируйте на 70 ° C на 2 мин и Остудите до 4 ° C.
   2. Добавьте 4 мкл 5 x FS буфера, 4 мкл dNTP 2,5 мм, 1 мкл DTT 0,1 М, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Инкубируйте на 50 ° C для 1 h и 70 ° C на 15 мин.
   3. Подготовить амплификации PCR
      1. Смешайте 1 мкл RT продукта, 1 мкл 25 мкм ИРЦ грунтовки, 1 мкл 25 мкм RP1 грунтовки, 10 мкл 5 x ВЧ буфера, 4 мкл dNTP 2,5 мм, 32.5 мкл TDW и 0,5 мкл высокой верности полимеразы.
      2. Запустите программу ПЦР для 11 ~ 13 циклов.
         Примечание: Программа для ПЦР является: 98 ° C за 30 s для горячего старта, 98 ° C 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 45 s для усиления и 72 ° C за 5 мин. Шаг амплификации повторяется для 11-13 циклов.
   4. Очистите продукты PCR используя 40 мкл магнитные бусы и следующие шаги 3.1.3.1 для 3.1.3.6, но с помощью 10 мкл TDW элюировать ДНК.
   5. Добавьте 2 мкл 10 x ДНК загрузки красителя. Загрузить образец на гель акриламида 6% и запустить в 200 V за 30 мин.
   6. Пятно с золотом (0,01% (v/v) в 1 x TBE буфера) Sybr за 5 мин при комнатной температуре.
   7. Снять пятно в 1 x TBE буфер для 5 мин при комнатной температуре.
   8. Вырезать гель в регионе ~ 200 – 700 нуклеотидов и разорвать геля.
   9. Добавить 700 мкл 0,3 М NaCl и инкубировать на ночь при комнатной температуре для элюировать ДНК.
   10. Загрузите все на столбец и центрифуги на максимальной скорости при комнатной температуре в течение 5 мин.
   11. Передача в пробки microcentrifuge чистой 1,5 мл элюата. Добавьте 1/10 объема 3 M NaOAc, 0.5 мкл coprecipitant, и равный объем изопропанола. Инкубируйте на ночь при-20 ° C.
   12. Осадок ДНК окатышей и мыть с 75% этилового спирта, как описано в шагах 2.4.4 к 2.4.5. Вновь приостановите в 20 мкл TDW.
   13. Анализ образца с помощью программы sequencer.

4. анализ PKR-взаимодействующих РНК с помощью qRT ПЦР

1. Метод 1: Случайные hexamer обратная транскрипция
   1. Вновь приостановить РНК гранулы из шага 2.4.10 с 8,5 мкл TDW и передать решение ПЦР-пробирку.
   2. Добавьте 0,5 мкл 100 мкм случайных hexamers и 4 мкл 2,5 мм dNTP смеси.
   3. Тепла раствор при 65 ° C за 5 минут и немедленно инкубировать на льду, по крайней мере 1 мин.
   4. Сделать смесь реакции: 4 мкл 5 x SSIV буфера, 1 мкл, 100 мм DTT, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Добавьте в смесь реакции решение РНК.
   5. Инкубировать смеси при 23 ° C в течение 10 мин, 50 ° C за 10 мин и 80 ° C в течение 10 мин.
   6. Анализируйте cDNA, с использованием системы PCR реального времени.
      Примечание: Программа для ПЦР в реальном времени является: 95 ° C 3 мин для горячего старта, 95 ° C за 5 s и 60 ° C для 10 s для усиления и 95 ° C за 30 s, 65 ° C для 30 s и 95 ° C за 30 s для расплава. Шаг амплификации повторяется для 40 циклов.
2. Метод 2: Strand конкретных обратная транскрипция
   1. Подготовка мастер смесь обратного грунты: смесь равных количеств праймеров конкретных обратной транскрипции гена, содержащие ЦМВ промоутер последовательности следуют ~ 20 нуклеотиды гена специфических последовательностей.
      Примечание: Комбинированные концентрация всех генов конкретных RT грунты-4 мкм.
   2. Вновь приостановить РНК гранулы из шага 2.4.10 с 8,5 мкл TDW и передать решение ПЦР-пробирку.
   3. Добавьте 0,5 мкл 4 мкм мастер смесь праймеров обратной транскрипции и 4 мкл 2,5 мм dNTP смеси.
   4. Тепла раствор при 65 ° C за 5 минут и немедленно инкубировать на льду, по крайней мере 1 мин.
   5. Приготовляют раствор реакции путем смешивания 4 мкл 5 x SSIV буфера, 1 мкл, 100 мм DTT, 1 мкл битор РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Добавьте решение реакции в структуре РНК праймер.
   6. Инкубируйте решение при 50 ° C за 10 мин и 80 ° C в течение 10 мин.
   7. Анализируйте cDNA, с использованием системы PCR реального времени.
      Примечание: Программа для ПЦР в реальном времени аналогично описанному в методе 1.

Схема для ареста НеЬа клетки в S или M фазы клеточного цикла процесса показан на рисунке 1. M фазы арестован пример мы можем четко визуализировать круглой формы клетки под микроскопом (рис. 2A). Для изучения эффективности арест клеточного цикла, ядерных содержимое ячейки могут быть проанализированы с помощью СУИМ (рис. 2B). Рисунок 3 показывает репрезентативных данных для иммунопреципитации эффективности теста, где антитела D7F7 показывает высокая способность immunoprecipitate PKR. Эта разница в эффективности иммунопреципитации возможно отражено в несоответствия в распределении класса высокопроизводительного секвенирования библиотек, подготовлен с использованием двух различных PKR антител (рис. 4). Специфичность Антитела D7F7 далее подтверждается с помощью западных анализа весь пятно PKR immunoprecipitate (Рисунок 5A) и общая lysate (Рисунок 5B). Рисунок 6 показывает радиоизотопные сигнала до и после удаления теорией во время подготовки высокопроизводительного секвенирования библиотеки. Рисунок 7 показывает обогащения mtRNAs РНК co-immunoprecipitated с PKR, но не в РНК co-immunoprecipitated с кроликом IgG или DiGeorge синдром хромосомных региона 8 (DGCR8). На рисунке 8 показана стренги представитель конкретных qRT ПЦР анализ PKR-прыгните mtRNAs S или M-фаза арестованных образцы.

Рисунок 1: схема для образцов арест клеточного цикла подготовки. (A, B) Схема подготовки S (A) или М (B) этап арестован НеЬа клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: анализ клеточного цикла арестованных образцы. (A) фаза контрастность изображения образцов S или M фаза арестованы. Полоски указывают на 250 мкм. (B) СУИМ анализ, показывающий ядерной содержание образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: иммунопреципитации эффективности тест на антитела PKR. Для успешной обогащения PKR-прыгните РНК следует использовать антитело с окончательного иммунопреципитации эффективности таких D7F7 антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: распределение по классам РНК последовательности библиотек, подготовлен с использованием различных антител PKR. С помощью различных PKR антител для fCLIP привели к другой класс распределение сопоставленных последовательности чтения. Несоответствие, вероятно, из-за различия в эффективности иммунопреципитации. Этот рисунок был изменен с Ким et al.28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: специфичность антитела D7F7 PKR. (A, B) Весь пятно Западной анализ PKR immunoprecipitated (A) или всего HeLa lysate (B) показал только один сильный группы, соответствующей размеру PKR, указывающее, что D7F7 антитела является весьма конкретной в признании PKR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: радиоизотопные сигнал для PKR co-immunoprecipitated RNAs. (A) PKR co-immunoprecipitated РНК могут быть обнаружены, снабдив их 5' концы с r СПС. После успешного удаления рРНК наблюдалось снижение (B) в radioistope сигнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: Проверка взаимодействий PKR-mtRNA. Вход2 раза обогащение mtRNAs РНК co-immunoprecipitated с указанных антител. Только в образце РНК PKR co-immunoprecipitated показало сильного обогащения mtRNAs. Антитела IgG кролика и DGCR8 были использованы как негативный контроль. Этот рисунок был изменен с Ким et al.28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: Strand конкретных qRT ПЦР анализ PKR-прыгните mtRNAs. (A, B) Strand конкретных обратной транскрипции был использован для анализа strandedness mtRNAs, которые были со immunoprecipitated с PKR S (A) или М (B) этап арестован клетки. Этот рисунок был изменен с Ким et al.28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.