Методическая статья

Мозг человека кровь интерфейс модель для изучения пересечения барьера патогенов или лекарства и их взаимодействия с мозгом

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол, описывающие настройку в cellulo BBB (гематоэнцефалический барьер)-Minibrain полиэстер пористые мембраны культуры вставить системы для того чтобы оценить перевозки биомолекул или инфекционных агентов через человека BBB и их физиологическое влияние на соседние клетки головного мозга.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раннего скрининга нервной системы лекарственных средств на соответствующие и надежной в cellulo BBB модели для их проникновения и их взаимодействие с барьером и паренхимы мозга все еще неудовлетворенных потребностей. Чтобы заполнить этот пробел, мы разработали 2D в cellulo модели, BBB-Minibrain, комбинируя полиэстер, пористые мембраны культуры Вставка человека BBB модель с Minibrain образованные tri культура клеток мозга человека (нейроны, астроциты и Микроглии клеток). BBB-Minibrain позволила нам для проверки транспорта нейропротекторной наркотиков кандидата (например, Неуровита), через BBB, чтобы определить конкретные ориентации этой молекулы нейронов и показать, что свойство нейропротекторной препарата была сохранена после препарата пересекли BBB. Мы также продемонстрировали, что BBB-Minibrain представляет собой интересную модель обнаружить проход вирусных частиц через барьер эндотелиальных клеток и контролировать инфекцию Minibrain neuroinvasive вирусных частиц. BBB-Minibrain является надежной системы, прост в обращении для исследователя, подготовленных в технологии культуры клеток и прогнозирования фенотипов клетки мозга после лечения или оскорбление. Такой интерес к cellulo тестирования будет двоякой: представляя доходностью шаги в начале разработки лекарственных средств, с одной стороны и сокращения использования животного тестирование с другой стороны.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозг отделена от кровообращения не проницаемой структуры, которая ограничивает обмены между паренхимы мозга и крови, называемый гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Главным образом состоит из церебральный эндотелиальных клеток, BBB динамически взаимодействует с астроциты, периваскулярной Микроглия и нейроны соседних паренхимы мозга. Три основные функции BBB являются создание и поддержание ионного гомеостаза нейрональных функций, снабжение мозга с питательными веществами и защиты от токсичных травм или вступлению патогенов1,2, которые способствуют поддержание гомеостаза головного мозга и его функции3. Этот барьер является настолько эффективным, что только некоторые препараты могут пересекать BBB4,5. В настоящее время доступные методы прогнозирования ли молекулы будет пройти BBB и диффундируют в мозг состоят из ex vivo исследований на вскрытие материала, изображение слежения в мозге человека добровольцев МРТ (магнитно-резонансная томография) или ПЭТ (координата выбросов томография) или фармакодинамики и фармакокинетические доклинические исследования на животных6,,78. Эти методы и модели имеют некоторые ограничения, такие как ограниченное разрешение PET и низкая чувствительность МРТ6,8, трудно подсчитать молекул (т.е., антитела на основе молекул, например), что плохо проникают в мозг7и для доклинических исследований их высокой стоимости и курорт животных испытаний.

Последний пункт имеет важное значение потому, что, согласно правилам 3R, (замена, сокращение и уточнение животных испытаний) регулирования администраций спросил что исследователи срочно разработать научно обоснованной альтернативы животных эксперименты в9,10,11,12,13,14,15.

За последние десятилетия, несколько моделей в пробирке BBB были предложены16,17,18 , культивируя на фильтр мембраны вставляет эндотелиальных клеток из разных видов, таких как мыши, крысы, крупный рогатый скот и свиньи. Что касается человеческого вида, дефицитных и сложных наличие первичных элементов побудило исследователям развивать человека модели, основанные на эндотелиальных клеток увековечен мозга или стволовых клеток человека производные19,20, 21. Эти барьеры являются надлежащим в пробирке суррогаты BBB, при том условии, что они выражают эндотелиальных клеток маркеры, маркеры жесткой перехода, измеряем транспортеры, вещества перевозчиков, рецепторы и реагировать на эндотелиальных раздражители 20. Несколько моделей BBB, с помощью вставки мембраны фильтра покрытием с эндотелиальных клеток и другие типы клеток (то есть, астроциты, нейроны или pericytes22,23,24) в дубликатах. Цель этих совместно культур было увеличить физические характеристики BBB, воспользовавшись секрецию растворимых факторов астроциты/нейронов или pericytes.

Тем не менее ни одна из этих моделей включает паренхимы мозга для изучения и предсказать судьбу кандидата наркотиков после того, как он прошел барьер. Таким образом, нашей целью было построить в cellulo кровь/мозг интерфейс, BBB-Minibrain, объединяя модель BBB и культуры клеток головного мозга, смешанных в один комплект. BBB-Minibrain использует систему культуры, состоящий из пористых фильтр вставляется в хорошо плиты культуры multiwell клеток. Фильтр покрыта hCMEC/D3 клеток, человеческий мозг эндотелиальных клеток линии, которая оказалась весьма надежным для BBB наркотиков испытания25,26,27, сформировать BBB. Minibrain, которая является совместно дифференцированной культура человека нейронов и астроциты, производный от NTera/Cl2.D1 клеток линии28,29 смешанные вместе с линией клеток человека микроглии ЧМЭ/Cl530 в соответствующий коэффициент Микроглии vs. нейрон астроциты соотношения мозга31, выращивается в нижней части пластины хорошо.

Помимо изучения проход наркотиков через BBB и их судьба в паренхиме, кровоснабжение мозга интерфейс в cellulo модели может быть мощным инструментом для решения вступлению патогенов в мозг (neuroinvasiveness), дисперсия в мозг (neurotropism) и токсичность (нейровирулентности), они могут оказать на клетки паренхимы мозга. Нейровирулентности и neuroinvasiveness исследования будет выгоду от развития эффективного в cellulo модели и целесообразно заменить Животные модели. Используя комплект BBB-Minibrain32, мы продемонстрировали neuroinvasive фенотип редких вирусный мутантов, которые накапливаются в французский нейротропные штамм вируса вируса желтой лихорадки (т.е.,33,ФНВ-YFV34) используется для подготовки прекращено живые YFV вакцины и прохождение neuroregenerative и нейропротекторной биомолекулы, называется Неуровита (именуемая NV отныне в рукописи)35. Потому что NV ни естественно пересекает клеточной мембраны, ни BBB, NV была сливается с переменной части (VHH) из одной цепи антитела ламы, который пересекает биологических мембран, включая BBB и функционирует как ячейки проникающего молекулы (CPM)36. CPM свойство VHH, как представляется, зависит от изоэлектрической точке и длину VHH37.

Это в cellulo тесте должно сделать его можно отсортировать молекулы, которые потенциально могут пересекать BBB до проведения фармакокинетические и фармакодинамика анализа в животных, а в идеале в то же время иметь возможность предсказать их поведение в нервной паренхимы. Эта система является биологически актуальной и легко создать и обработать профессионалами, хорошо подготовленных в ячейку культуры26,,2930,38. Такой интерес к cellulo тестирования будет два раза: сокращение издержек доклинических испытаний с одной стороны и сокращения использования животных испытаний с другой стороны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. клетки культуры работы Ntera/CL2. D1 подготовить совместное культуры пост митотическая hNeurons и hAstrocytes (NT2-н/д)

Примечание: Это компонент Minibrain (рис. 1).

  1. Выращивание Ntera/Cl2.D1
    1. Удаление флакон замороженных клеток из бака жидким азотом. Держите на льду.
    2. Оттепель клетки быстро в ванну воды 37 ° C.
    3. Передачи ячеек в 15 мл, содержащие 10 мл полного среднего DMEM F12 (Дульбекко изменение Eagle средний: питательной смеси F-12 Средний) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), глютамин 2 мм, 100 МЕ пенициллина и стрептомицина 100 мкг (то есть, полный Средний DMEM F12).
    4. Центрифуга на 200 x g 5 мин при комнатной температуре (RT). Отделить Пелле в 2 мл полного среднего DMEM F12.
    5. Передача в колбе T75 тканевой культуры в полистирол с специфического лечения для чувствительных адэрентных клеток (T75Cell+) содержащий 13 мл полного среднего DMEM F12.
    6. Культура клетки в инкубаторе, поддерживается при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности до 90% слияния (то есть, около 5 дней). Изменение среднего каждые 2-3 дня.
  2. Subculturing Ntera/Cl2.D1 и усилители
    1. Удалите носитель из колбы.
    2. Промойте монослое клеток с 10 мл фосфатный буфер (PBS) дополнены Ca2 + и Mg2 +.
    3. Промойте монослое клеток с 10 мл раствора ЭДТА (сдержано в RT).
    4. Добавить 3 мл раствора (0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА) трипсина ЭДТА и проинкубируйте 2 мин на RT.
    5. Встряхните флакон и убедитесь, что клетки отсоединяются от пластиковой поверхности.
    6. Добавить 10 мл полного среднего DMEM F12 инактивирует трипсина, передачи в 15 мл трубки и центрифуги для 5 минут при 200 x g на RT.
    7. Отделить лепешка с 10 мл полного среднего и использовать 1 мл для прививок каждой новой колбу, содержащий 14 мл полного среднего DMEM F12.
      Примечание: Тридцать T75 клеток+ колбы требуются для каждого дифференциации.
    8. Инкубируйте фляги при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности до 90% слияния.
  3. Дифференциация NTera/Cl2.D1 в человека нейрон экзоцитоз Сопредседатель культуре
    Примечание: Это основной компонент Minibrain.
    1. В день 0 разбить ячейки с трипсина ЭДТА, как описано в шаге 1.2 и разбить ячейку Пелле каждый флакон с 2 мл полного среднего DMEM F12.
    2. Добавьте 1 мл суспензии клеток (что соответствует 5 х 106 клеток) в 60 пластиковых чашек Петри диаметром 85 мм, содержащий 11 мл полного среднего DMEM F12.
      Примечание: Клетки не будут придавать пластик и будет объединять формы псевдо neurospheres (см. фотографию в нижней панели рис. 1). Инкубируйте 60 Петри при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности на один день.
    3. В день 1 добавляют 1 мл полного среднего DMEM F12, дополнена 130 мкм all-Trans ретиноевой кислоты (ATRA) в чашку Петри (конечная концентрация ATRA 10 мкм) и вернуть блюда при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности за 24 ч.
    4. На 2 день очень тщательно перенесите носитель, содержащий ячейки сферы каждого Petri Dish в 50 мл трубки и центрифуги для 10 мин на 50 x g и RT. Dissociate тщательно сыпучих гранул с 13 мл полного среднего DMEM F12, дополнена 10 мкм ATRA и добавьте th e 13 мл в новой диаметром 85 мм Петри.
      Примечание: За различные ходы, это чрезвычайно важно для поддержания плотности сферах, как высокие, как плотность, полученные на 2 день (то есть, вокруг плотность 70%). Поэтому если снижение плотности сфера, уменьшить общее количество чашек Петри по количеству клеток.
    5. Повторите выше (шаг 1.3.4) на 4, 6 и 8 дней.
    6. В день 10 Повторите описанную выше процедуру, но добавить сферах колбы T75 клеток+ вместо Петри. Добавьте клетки от одной чашке Петри один флакон T75 клеток+ .
    7. На 11 дней 13, 15 и 17, измените используемые среды с 14 мл полного DMEM F12 с 10 мкм ATRA.
    8. В день 19 изменения среды с 14 мл полного среде DMEM F12 без ATRA за флакон.
    9. В день 20 разъединять нежно клетки с трипсина/ЭДТА следующим.
      1. Для каждой ячейки T75+ колбу промойте клетки с 10 мл PBS, дополненная Ca2 + и Mg2 +; Инкубируйте клетки с 4 мл ЭДТА на 5 мин на RT.
      2. Тщательно удалить ЭДТА и добавить 2 мл трипсина-ЭДТА и инкубировать 7 мин на RT. Shake очень аккуратно колбу и добавить тщательно 8 мл полного среднего DMEM F12.
      3. Центрифуга 10 мин на 160 x g и RT. отмежеваться Пелле клеток в 13 мл полного среднего DMEM F12 и передачи в колбе T75 клеток+ .
        Примечание: Очень нежный диссоциации с трипсина ЭДТА позволит восстановление ATRA дифференцированной клетки от оригинального teratocarcinoma клеток, которые сильно прикреплены к пластиковой посуды.
    10. На 21 день удалите среды и мертвые клетки. Добавить 14 мл полного среднего DMEM F12, дополнена 5% FBS, глютамин 2 мм, 100 МЕ пенициллин, стрептомицин 100 мкг и 0,5 мкм AraC (цитозина β-D-arabinofuranoside) (полное 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. В дни 23, 25 и 28, заменить используется средний с 14 мл 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. На 29 дней до 49 (каждые два дня), заменить используется носитель с 14 мл полного среднего DMEM F12, дополнена плода бычьим сывороточным 5%, глютамин 2 мм, 100 МЕ пенициллин, стрептомицин 100 мкг, 5 мкм FudR (5-фтор-2' дезоксиуридина) и 10 мкм Urd (уридина) (полное 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. В день 50, заменить используется носитель с 14 мл полного среднего DMEM F12, дополнена 5% FBS, глютамин 2 мм, пенициллин 100 МЕ, 100 мкг стрептомицина и 10 мкм Urd (полное 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. В 51 дней до 95 (два раза в неделю), заменить используется средний с 14 мл 5% полной FBS DMEM F12-Urd.
      Примечание: Клетки можно использовать для экспериментов с дня 51, но не позднее чем за день 95. Использование последовательного лечения ингибиторами митоз позволяет восстанавливать чисто населения совместно культуры после митотическая hNeuron и hAstrocytes (NT2-н/д).
    15. Заполнение ячеек, как описано за день 20 приступить нежный trypsinization.

2. клетки культуры работы человека Микроглии клеток ЧМЭ/Cl5

Примечание: Это компонент микроглии Minibrain (рисунок 1).

  1. Культивирование человеческий Микроглии клеток ЧМЭ/Cl5
    1. Удаление флакон замороженных клеток из бака жидким азотом. Держите на льду.
    2. В ванну воды 37 ° C, оттепель быстро.
    3. Передача ячеек в 15 мл, содержащие 10 мл полного среднего DMEM F12, дополнена плода бычьим сывороточным 5%, глютамин 2 мм, 100 МЕ пенициллина и стрептомицина 100 мкг (то есть, полный 5% FBS DMEM F12 средний).
    4. Центрифуга на 200 x g 5 мин на RT. Dissociate лепешка с 2 мл полного среднего FBS DMEM F12 5%.
    5. Передача в колбе T75 клеток+ , содержащий 13 мл полного среднего FBS DMEM F12 5%.
    6. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности до 90% слияния. Изменение среднего каждые 2-3 дня.
  2. Subculturing человека Микроглии клеток ЧМЭ/Cl5
    1. Удаление среды из колбу.
    2. Промойте монослое клеток с 10 мл PBS, дополненная Ca2 + и Mg2 +.
    3. Промойте монослое клеток с 10 мл раствора ЭДТА (сдержано в RT).
    4. Добавить 3 мл раствора ЭДТА трипсина и проинкубируйте 2 мин на RT.
    5. Встряхните флакон и убедитесь, что клетки отсоединяются от пластиковой поверхности.
    6. Добавить 10 мл полное 5% FBS DMEM F12 средних инактивирует трипсина, передачи в 15 мл трубки и центрифуги для 5 минут при 200 x g и RT.
    7. Отделить лепешка с 10 мл полного среднего и использовать для прививок каждой новой колбу, содержащий 14 мл полного среднего FBS DMEM F12 5% 1 мл.
    8. Инкубируйте фляги при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности до 90% слияния.

3. культура работы с hCMEC/D3 пальто пористые вставки и подготовить BBB

  1. Культивирование эндотелиальных клеток человека hCMEC/D3 (рис. 2)
    1. Разбавьте тип я крыса коллаген до 1:30 чистой стерильной водой (класс культуры клеток).
    2. Передача 10 мл в колбе T75 клеток+ и проинкубируйте 2 h 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности инкубатора.
    3. Удаление решения коллагена и заменить его с 15 мл среды эндотелиальных клеток, дополнена 10 мм HEPES (упоминается как средний полный эндотелиальных клеток).
    4. Удаление крио флакон клеток из бака жидким азотом. Держите на льду.
      Примечание: Клетки были выращены, и много семян была сделана как описано заводом-изготовителем. Линия клеток покрыта соглашением о передаче биологического материала. Клетки получены на проход 25 и не должен использоваться дальше, чем прохождение 35.
    5. В ванну воды 37 ° C, оттепель быстро.
    6. Передача ячеек в колбу T75 клеток+ и вернуть настой при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности для 2-4 ч.
    7. Осторожно извлеките носитель без потери или удаления клеток. Промойте клетки один раз с 10 мл среды полной эндотелиальных клеток.
    8. Добавляют 15 мл среднего полного эндотелиальных клеток.
    9. Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2 и влажность 95% до 100% слияния (не менее 4 дней) без изменения среды.
  2. Subculturing hCMEC/D3 подготовить Вставка BBB
    1. Пальто нового T75 клеток+ колбу или вставляет с типом я крыса коллагена как описано выше (шаг 3.1).
    2. Удалите носитель из колбы. Промойте монослое клеток с 10 мл PBS, дополненная Ca2 + и Mg2 +.
    3. Добавить 2 мл раствора ЭДТА трипсина и инкубировать 5 минут при 37 ° C.
    4. Встряхните флакон и убедитесь, что клетки полностью оторванными от пластиковой поверхности.
    5. Добавьте 4 мл среднего полного эндотелиальных клеток для инактивации трипсина.
    6. С 5 мл Пластиковые пипетки механически отделить клетки аспирационных и промывка суспензию клеток при сохранении 5 мл пипетку в нижней части колбы по крайней мере 5 раз.
    7. Подсчитать количество ячеек и использование 5 х 104 клетки/вставка для культуры 12 хорошо полиэстер мембраны вставляет insert и 2 х 106 клеток для T75 клеток+ колбу. Подготовка также три фильтры без клетки для PELy (т.е., эндотелиальные клетки проницаемость для Люцифера желтый см. ниже пункт 4.2) эксперименты с вставками культуры мембраны полиэстер.
    8. Инкубируйте колбы или вставки при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности до 100% слияния.
    9. Не изменяйте средством T75 клеток+ колбу до нового прохода. Напротив для BBB по культуре полиэстер мембраны вставляет: изменение средних в дни 2 и 4, используйте BBB для экспериментов на 6 день.

4. Строительство и контроль качества BBB-Minibrain (рис. 2)

  1. Настройка BBB-Minibrain полиэстер мембраны культуры вставить устройство (рис. 2B)
    1. Расти на 12 hCMEC/D3 ячейки хорошо полиэстер мембраны культуры вставьте фильтры для 6 дней на эндотелиальных клеток носителе перед их использованием для эксперимента.
    2. Покройте 12 хорошо пластины с поли D-Лизин (1 мл/хорошо, 10 мкг/мл, 4 ч в РТ) и затем Ламинин (1 мл/хорошо, 1 мкг/мл, ночевка в RT).
    3. Ламинин удалить и добавить 1 мл среды эндотелиальных клеток, дополнена 5% FBS (средний 5% эндотелиальных клеток).
    4. Инкубируйте 1 час при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    5. Аккуратно trypsinize NT2-не применимо (как описано в шаге 1.3.9) и ЧМЭ/Cl5 (как описано в шаге 2.2) и разбить ячейку окатышей с полным эндотелиальных клеток средних.
    6. Граф клетки, микс 3.6 x 105 NT2-не применимо и 0,4 x 105 ЧМЭ/Cl5 клеток/Ну и семян 12 хорошо пластины.
    7. При T = 24 ч (24 ч после посева): изменить используемые среды с среднего свежий полный эндотелиальных клеток (клетки Minibrain и эндотелиальных клеток) и передача hCMEC/D3 полиэстер мембраны культуры вставка фильтра на вершине Minibrain клеток. Инкубируйте BBB-Minibrain при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
      Примечание: BBB-Minibrain затем будет состоять из слоя эндотелиальных клеток человека hCMEC/D3 на фильтр, изолируя Люминал салон (или «кровь») и смешанные культуры клеток человека hNT2-не применимо и hCHME/Cl5 (Minibrain) в нижней части хорошо определение Салон abluminal (или «мозг») (рис. 2B).
  2. Проверка эндотелиальной проницаемости BBB-Minibrain (контроль качества) (рис. 2 c)
    1. Подготовка транспортного буфера (ТБ), которая является HBSS (Hanks сбалансированного солевого раствора) буфер с Ca2 + и Mg2 + дополнены пируват натрия HEPES и 1 мм 10 мм.
    2. Подготовка 12 хорошо пластины с 1,5 мл транспортного буфера в колодец.
    3. При T = 0, сделать свежий транспортного буфера дополнена 50 мкм Люцифер желтый (LY-ТБ).
    4. Обратный каждый фильтр вверх дном, чтобы тщательно удалить носитель, не затрагивая барьер эндотелиальных клеток.
    5. Установите фильтр на пластину заполненные 12 хорошо и добавить 0,5 мл LY-ТБ.
    6. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    7. T = 10 мин передачи фильтры на новых ТБ заполнены 12 хорошо пластины и держать в abluminal отсек первой пластины для чтения ОД.
    8. При T = 25 мин, повторите шаг 4.2.7.
    9. T = 45 мин, остановку транспорта, удаляя фильтры из пластин. Держите abluminal и просветный отсеков для ОД меры.
    10. Передача в темный 96 хорошо плиты образцы: 10 мкл с 190 мкл ТБ для LY-ТБ и просветный отсеков, 200 мкл пример для abluminal отсеков.
    11. Измерения флуоресценции LY-ТБ в различных образцах λ428 Нм λ535 Нм (возбуждения и выбросов длина волны соответственно).
    12. Вычислите проницаемость эндотелия (Pe) к LY-ТБ (PeLY) согласно Siflinger-Birnboim, A et al. (1987)39 и да Кошта,34 А et al. (2018) по формуле:
      1/PSe = (1/PSt)-(1/PSf) и PeLY= PSe/S.
      Примечание: ПСФ проницаемость фильтра без клетки, PSt является проницаемость фильтр с ячейками, PSe — проницаемость эндотелия монослоя время поверхности монослоя, S на поверхности монослое (для 12 хорошо фильтра = 1.12 см2 ), PeLY выражается в см/мин. Для hCMEC/D3 PeLY должно быть от 0,7 до 1,2 х 10-3 см/мин в зависимости от главным образом FBS используется в экспериментах. Важно: PeLY выше чем 1.2 означает, что BBB не является достаточно жесткой и может наблюдаться некоторые утечки. Отказаться от этих барьеров.

5. Использование BBB-Minibrain подчеркнуть присутствие нейро инвазивных вирусных частиц в образце вакцины вирус желтой лихорадки, французский нейротропные вирус, YFV-ФНВ 34 (рис. 3)

  1. BBB пересечения и размножение вируса желтой лихорадки в Minibrain
    1. Используйте BBB-Minibrain, подготовленный, как описано в шаге 4.1.7 24 h перед добавлением этого вируса; Замените средний средой 2% FBS эндотелиальных клеток.
      Примечание: Очень важно избежать изменения среды перед добавлением вирус. Изменение среднего может активировать эндотелиальных клеток человека и временно открыть барьер, который позволит прохождения вирус. Здесь средство меняется 24 ч до начала эксперимента.
    2. При T = 0 добавьте 3500 единиц формирования в налета (ОРП) из YFV-ФНВ разводят в 50 мкл 2% среднего FBS эндотелиальных клеток очень тщательно на вершине Люминал отсека. Элемент управления BBB-Minibrain прививки с 50 мкл 2% FBS эндотелиальных клеток средних без вируса. Определите PeLY на компаньон хорошо.
    3. Инкубируйте BBB-Minibrain в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    4. После 24 часов удалите устройство фильтра Полиэстер мембраны культуры вставок и определяют PeLY, пример 1 мл abluminal отсека и титровать вирус, как описано в A. да Коста et al. (2018)34. Замените носитель свежие среднего эндотелиальных клеток FBS 2%.
    5. Инкубируйте BBB-Minibrain при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    6. После 72 ч образец среднего отсека abluminal и титровать вирус, или извлечь РНК из Minibrain клеток для анализа выражения гена, как описано в A. да Коста et al. (2018)34.
  2. Усиление нейротропные вариантов YFV-ФНВ на Minibrain клетки последовательным переходами
    1. Использование Minibrain клетки покрыты 12 хорошо пластины (то есть, шаги 4.1.6 и 4.1.7).
    2. Во время точка 0 h, добавьте 3500 налета формирования подразделений из YFV-ФНВ разводят в 50 мкл 2% FBS эндотелиальных клеток средних очень тщательно на верхней части клетки (люминал отсека).
    3. Через 1 ч извлеките носитель с посевным материалом вируса и заменить свежие среднего эндотелиальных клеток FBS 2%.
    4. После 48 ч образец 500 мкл питательной среды и заразить свежие Minibrain клетки
    5. После 120 h образец 500 мкл питательной среды и заразить свежие Minibrain клетки.
    6. После 192 h сохранение культуры среднего (= вирус запасов обогащенного) и извлечь РНК из Minibrain клеток для анализа выражения гена, как описано в A. да Коста et al. (2018)34.

6. Использование BBB-Minibrain для изучения BBB пересечения и нападения на клетки мозга биомолекулы

  1. Перевозки через BBB ориентации биомолекулы нейрона
    1. Используйте Minibrain-BBB, подготовленных как описано шаг 4.1.7.
    2. В момент времени 0 h, добавьте биомолекулы (в примере условии в разделе результат 58.75 нг/BBB клетки permeant NeuroTag-NV молекулы были добавлены на BBB-Minibrain вставки.
    3. Инкубируйте BBB-Minibrain при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    4. После 24 часов удалите устройство фильтра Полиэстер мембраны культуры вставок и определяют PeLY, затем запятнать клетки Minibrain для hNeurons neurofilament Nf200 и обнаружить присутствие биомолекулы в Minibrain (в этом примере, в результате Секция, NeuroTag-NV был обнаружен используя антитела направленные против Strep-тегов, что он содержит35,40).
  2. Перевозки через BBB биомолекулы neuroregenerative и последующие нейропротекторной пробирного в Minibrain после биомолекулы пересек BBB
    1. Используйте Minibrain-BBB, подготовленный, как описано в шаге 4.1.7.
      Примечание: Для ориентации нейронов только молекулы, Minibrain клетки могут быть заменены нейронов клетки (NT2-N) лишь38.
    2. В момент времени 0 h добавьте 58.75 нг/BBB-Minibrain хорошо молекул клетки permeant NV (активная форма CPM-NeuroTag-NV, неактивная форма CPM-NeuroTag-NVΔ) характеризуется C. Prehaud et al. (2014)35.
    3. Инкубируйте BBB-Minibrain в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    4. После 4 ч, сделать индивидуальный раны с инъекционной иглы (26GX1/2», 12-4.5, Terumo Бельгия) на Minibrain клетки. Хорошо сделайте по крайней мере 10 царапины на каждого человека. Также определите PeLY на спутник.
    5. Инкубируйте BBB-Minibrain в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    6. После 8 h замените средний в abluminal отсеке средой свежий полный эндотелиальных клеток.
      Примечание: Важно заменить средство на этот шаг, поскольку ранения Minibrain клеток может привести к гибели клеток, а затем освобождение цитотоксических соединений.
    7. Инкубируйте BBB-Minibrain в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности.
    8. После 48 ч окрашенные клетки для регенерации аксона hNeurons как описано в с. Prehaud et al. (2013)40.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain находится в cellulo Экспериментальная модель интерфейса кровоснабжение мозга.

BBB-Minibrain устанавливается на системе Вставка культуры полиэстер мембраны для имитации крови отсека на верхнем уровне и мозг отсек на нижнем уровне гематоэнцефалический интерфейса (рис. 2AB). Он состоит из Люминал отсек с hCMEC/D3 эндотелиальных клеток на фильтр, образуя B...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы показали, как построить в cellulo кровь/мозг интерфейс, BBB-Minibrain, объединяя модель BBB и культуры смешанных мозга головного мозга клетки (Minibrain) в единый комплект. Эта система является биологически актуальной, легко настроить и обрабатывать для экспериментаторов, хорошо подготовленных в клеточной культуре.

Что касается любых других в пробирке модель BBB были бы получены надежные результаты если резкое контроль герметичности барьер применяется. Вставки следует тщательн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интеллектуальной собственности системы был патентов, на которые ссылается 32, 35 и 38.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано за счет внутренних субсидий Пастера, включая Incitative Грант (PTR 435) и гранта «Contrat де поддержки à la Recherche» предоставляемых Санофи Пастер до Пастера. A. да Коста было поддержано Санофи Пастер Грант и Florian Bakoa является получателем PhD субсидии, предоставляемые ANRT (Национальная ассоциация de la Recherche et de la Technologie). Мы в долгу перед Pr Пьер-Оливье Couraud и д-р Флоренс Миллер за полезные дискуссии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночные планшетыCorning3336
5-fluoro-2' дезоксиуридинMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri DishSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-ethanolMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleПо запросу к доктору Лафону
CMCCalbiochem217274
Цитозин &бета;-D-арабинофуранозидMerck-Sigma AldrichC1768
Dark 96 луночных планшетовCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004эндотелиальная клеточная среда
ЭтанолCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
ФормальдегидMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Goat-Anti MouseJackson Immuno Research115-545-003
Goat-Anti RabbitThermofisher ScientificR37117
HBSS с Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes1M Thermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-глутаминThermofisher Scientific25030-024
Люцифер желтыйMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия науки15714
PBS без Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Pen/StreppingEurobioCXXPES00-07
Поли-d-лизинMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Rat Collagen ICultrex3443-100-01
Ретиноевая кислота All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Набор для очистки РНКQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Бикарбонат натрия 5,6%EurobioCXXBIC00-07
Пируват натрияThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FlaskSarstedt83-1813-302Тканевая культура полистирольная колба со специфической обработкой поверхности (Cell+) для чувствительных адгезивных клеток
TranswellCorning3460полиэфирная пористая мембранная культура вставки
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Ультра чистая водаThermofisher Scientific10977-035
UridineMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP Флаконс вакциной Dakar

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Neurovita

Похожие статьи