Рассечение местных Ca2 + сигналов в культивируемых клеток мембрана ориентированных Ca2 + индикаторы

Hiroko Bannai; Matsumi Hirose; Fumihiro Niwa; Katsuhiko Mikoshiba

doi:10.3791/59246

Методическая статья

Рассечение местных Ca^{2 +} сигналов в культивируемых клеток мембрана ориентированных Ca^{2 +} индикаторы

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59246

⸱

22 марта 2019 г.

Hiroko Bannai¹^,² , Matsumi Hirose² , Fumihiro Niwa²^,³ , Katsuhiko Mikoshiba²

¹Japan Science and Technology Agency, PRESTO, ²Laboratory for Developmental Neurobiology, RIKEN Center for Brain Science, ³École Normale Supèrieure, Institut de Biologie de l'ENS (IBENS), Institut national de la santè et de la recherche mèdicale (INSERM), Centre national de la recherche scientifique (CNRS), École Normale Supèrieure, PSL Research University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем собой протокол для Ca^{2 +} изображений в нейронов и глиальных клеток, который позволяет рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции. Этот процесс применяется для всех типов клеток, которые позволяют выражение генетически закодированный Ca^{2 +} показателей.

Аннотация

Ион кальция (Ca^{2 +}) молекула универсальный внутриклеточным messenger диски несколько сигнальных путей, приводит к различных биологических материалов. Координация двух Ca^{2 +} источников сигнала — «Ca^{2 +} приток» из вне ячейки и «Ca^{2 +} освобождение» от внутриклеточного Ca2 + хранить эндоплазменный ретикулум (ER) — считается лежат в основе различных пространственно временные закономерности Ca ^{2 +} сигналы, которые вызывают несколько биологических функций в клетках. Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы описать новый Ca^{2 +} изображения метод, который позволяет осуществлять мониторинг самого момента «Ca^{2 +} приток» и «Ca^{2 +} выпуск». ООР-GCaMP6f это генетически закодированный Ca^{2 +} индикатор (ГЕЧИ) состоит из GCaMP6f, который предназначен для внешней мембраны ER. ООР-GCaMP6f может контролировать Ca^{2 +} выпуска с более высоким временным разрешением чем обычных GCaMP6f. В сочетании с таргетингом на плазматической мембране GECIs, пространственно временной Ca^{2 +} сигнал шаблон может быть описана в субцеллюлярные резолюции. Субцеллюлярные таргетингом Ca^{2 +} индикаторы, описанные здесь в принципе, доступны для всех типов клеток, даже для в-vivo изображений Caenorhabditis elegans нейронов. В этом протоколе мы представляем Ca^{2 +} изображения в ячейках от линий клеток, нейронов и глиальных клеток в диссоциированных первичных культур и описывают подготовку замороженных запас корковых нейронов крысы.

Введение

CA^{2 +} сигналы представляют собой повышение концентрации внутриклеточного Ca^{2 +} . CA^{2 +} является универсальной второй messenger для эукариотических клеток. С помощью Ca^{2 +}, клетки функционировать через различных внутриклеточных сигнальных путей и побудить различных биологических материалов. Например в нейронах, релиз синаптических пузырьков на пресинаптическом терминале, экспрессии генов в ядро и индукции синаптической пластичности в postsynapse регулируются собственный Ca^{2 +} сигналы, которые точно активировать соответствующий вниз по течению ферментов в правильные сайты и с точного времени¹.

Определенных пространственно-временных закономерностей Ca^{2 +} сигналов активировать специфических ферментов вниз по течению. CA^{2 +} сигналы, генерируемые координацию между двумя различными Ca^{2 +} источники: Ca^{2 +} приток из внеклеточного пространства и Ca^{2 +} освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER), который служит в качестве внутриклеточного Ca^{2 +}магазин. Значимые пространственно-временных Ca^{2 +} сигнализации шаблон вызвать функцию определенную ячейку также поддерживается nanodomains 10 – 100 мкм Ca^{2 +} созданных вблизи Ca^{2 +} каналов на плазматической мембраны или ER мембраны². Важно отметить, что источником Ca^{2 +} сигналов является одним из наиболее важных факторов, определяющих течению биологической вывода. В нейронах Ca^{2 +} приток и Ca^{2 +}выпуска имеют противоположный эффект на кластеризации гамма - аминомасляная кислота (ГАМК)_A рецепторов (ГАМК_AR) на ГАМК синапсы, который отвечает за торможение ³возбудимости нейронов. CA^{2 +} приток сопровождается массовым возбуждения нейронов индуцирует дисперсии синаптических ГАМК_AR кластеров, тогда как постоянные Ca^{2 +} освобождение от ER способствует кластеризации синаптических ГАМК_ARs. Другие группы также сообщил, что тюнинг направление конусы роста зависит от источника Ca^{2 +}сигнала: Ca^{2 +} приток вызывает отвращение, в то время как Ca^{2 +} выпуск руководства притяжения нейрональных роста ⁴конус. Таким образом чтобы полностью понять Ca^{2 +} сигнальные пути, лежащих в основе определенных клеточных выходов, важно определить источник Ca^{2 +} сигналов, описывая Ca^{2 +} сигналы на субклеточном резолюции.

В этом протоколе мы описываем Ca^{2 +} изображения метод, позволяющий сообщить Ca^{2 +} сигналы на субклеточном резолюции, которая позволяет оценки Ca^{2 +}источников сигнала (рис. 1). CA^{2 +} microdomains только под плазматической мембраны успешно контролируются генетически закодированный Ca^{2 +} индикаторов (GECIs) ориентированы на плазматической мембране через вложение плазматической мембраны локализация сигнала Lck в Src Киназа N-Термини GECIs⁵. Чтобы обнаружить Ca^{2 +} шаблон сигнала вблизи ER с лучше пространственным и временным разрешением, мы недавно разработали ООР-GCaMP6f, в котором GCaMP6f⁶ целей ER внешней мембраны, используя белка трансмембранного ER. ООР-GCaMP6f чутко могут сообщать Ca^{2 +} освобождение от ER лучше пространственно-временных разрешением, чем обычные неадресных GCaMP6f в клетки COS-7⁷ и HEK293 клетки⁸, избегая распространения Ca^{2 +} и GECIs . Мы также подтвердили, что спонтанное Ca^{2 +} высота в культивированный гиппокампа астроциты, сообщает ООР-GCaMP6f показало различных пространственно-временных шаблон по сравнению с наблюдением ориентированные на плазматической мембране GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)⁷ ^,⁹, указав, что Ca^{2 +} изображений с ООР-GCaMP6f в сочетании с Lck-GCaMP6f способствует рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции для выявления их источников.

В настоящее время мы подробно протокол для Ca^{2 +} сигнал вскрытия НеЬа клетки и нейрон экзоцитоз смешанных культур, покрытие на coverslips стекла. Ca^{2 +} Тепловизионная техника с GECIs указано здесь, Lck-GCaMP6f, плазма мембраны ориентированных RCaMP2¹⁰ (Lck-RCaMP2), и ООР-GCaMP6f (рис. 1), применимы ко всем ячейкам, в которые могут быть выражены эти GECIs.

Протокол

Все эксперименты, описанные здесь были утверждены RIKEN безопасности Комитет и Комитет животных эксперимент, по мнению руководства, выданное японским Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологии.

1. Подготовка клеток

Подготовка поли (ethyleneimine)-с покрытием coverslips
Примечание: Покрытие Poly(ethyleneimine) (PEI) рекомендуется для стекла аппарата, как это позволяет нейронов и астроциты плотно приложить к coverslips, не препятствуя их развития. Однако другие покрытия (например, поли орнитина, поли-L-лизин, Ламинин покрытие) доступны методы также, при необходимости, для стекло дно блюда.
1. Место coverslip стекла 18 мм в диаметре в каждой скважине 12-ну плиты. Готовят раствор PEI 0,04% (12,5 мл/12-ну плита) с помощью стерилизации воды.
2. Добавьте 1 мл раствора PEI 0,04% в каждой скважине. Убедитесь, что существует никаких пузырей под coverslips.
3. Инкубировать пластины в инкубатор CO₂ на ночь при 37 ° C.
4. Следующий день, мыть с покрытием coverslips 3 x с 1 мл стерилизации воды. Удаление решения Пей с аспиратором, добавьте 1 mL стерилизации воды для каждой скважины и поколебать пластину 12-Ну так что Пей решение между coverslip и пластину можно промыть тщательно. Как оставшиеся PEI токсичны для клеток, убедитесь, что вода после окончательного мыть придыханием полностью.
5. Сухие и стерилизовать coverslips внутри вытяжки с ультрафиолетового (УФ) света для по крайней мере 15 минут. Пей покрытием блюдо может храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев. Осветить блюда с УФ-излучения для 15 мин непосредственно перед использованием.
6. Добавьте 5 мл стерильной дистиллированной воды в пространстве между скважин для предотвращения испарения питательной среды.
Гальванических линий клетки
Примечание: Этот протокол обеспечивает лишь один из примеров трансфекции в клетки от линий клеток млекопитающих, таких как НеЬа клетки и клетки COS-7. Пользователи могут применять другие протоколы трансфекции, которые оптимизированы для своих экспериментов. В этом разделе мы опишем протокол культуры клеток HeLa, который также применима к клетки COS-7.
1. За день до трансфекции культура клетки в культуре блюдо 10 см до тех пор, пока они достигают 70%-90% слияния.
2. Prewarm питательной среды (см. Таблицу материалы) до 37 ° C.
3. Вымыть клетки 2 x с фосфат амортизированное saline без Ca^{2 +} и Mg^{2 +} (PBS [-]).
4. Аспирационная PBS(-), добавляют 1 мл 0,5% раствора трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и инкубации клеток при 37 ° C 90 s до тех пор, пока они достигают круглой формы.
5. Добавьте 9 мл подогретую питательной среды, чтобы остановить trypsinization. Разбавьте клетки с питательной среды в соотношении 1:6.
6. Семя 1 мл разбавленной клеток на ОПЭ покрытием coverslips в 12-ну пластины.
Подготовка гиппокампа нейрон экзоцитоз смешанные культуры от крыс и мышей
Примечание: Секции 1.3 и 1.4 сначала должны быть рассмотрены и одобрены институциональный уход за животными и использовать Комитета и должны следовать официально утвержденными процедурами для ухода и использования лабораторных животных. Блок-схема протокола нейрональных культуры показан на рисунке 2.
1. Подготовьте все реагенты под капотом ламинарного потока. Средний (DMEM) место Дульбекко модифицированных орла на два 100 мм культуры блюда (примерно 20 мл/блюдо), которые находятся в Набегу.
2. Подготовка 50 мл рассечение среды состоит из DMEM и 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES) (см. Таблицу материалы) и отказаться от среднего в три блюда культуры 60 мм (примерно 7 мл/блюдо) и восемь 35 мм блюда культуры (примерно 2 мл/блюдо). Место блюда в другой Набегу.
3. Подготовка 50 мл физраствора инкубации, состоящий из Hanks сбалансированного солевого раствора, дополнены 20 мм HEPES (см. Таблицу материалы) и место 8 мл физиологического раствора в 15 мл конические пробки на льду.
4. Подготовьте покрытия среды с минимальным необходимым среднего (MEM) дополнена B-27, глютамин и пенициллин стрептомицином (см. Таблицу материалы). Сохранить это средство при комнатной температуре (20-28 ° C).
5. Стерилизуйте хирургические инструменты с 70% этиловом спирте.
6. Поместите бумажное полотенце в стеклянную банку с крышкой и 1 мл изофлюрановая. Пусть изофлюрановая испариться за 1 мин.
7. Поместить в банку, подготовленный в соответствии с шагом 1.3.6 беременная крыса или мыши и держать животное в банке до тех пор, пока она находится глубоко под наркозом (около 30 s в 1 мин).
8. Возьмите наркотизированных животное из опарника и лечить животных и оборудования рассечение, поливая их с 70% этиловом спирте. Вырезать вентральной срединной линии с стандартным рассечения ножницы и щипчики и извлечь матка беременная крыса или мыши.
9. Экстракт зародышей E18 – 19 из матки наркотизированных женского пола крыса или мыши, используя тонкие рассечения ножницы и место извлечения эмбрионов с щипцами кольцо в ледяной DMEM в 10 см блюдо для холодной анестезии.
10. Обезглавить эмбриона с тонкой Рассечение ножницами и голову в ледяной DMEM в 10 см блюдо.
11. Экстракт мозг от каждого эмбриона с 13 см Изогнутый пинцет Semken и щипцы с тонкой советы. Держите мозга в среде ледяной рассечение в блюдо 60 мм.
12. Удаление гиппокампах, используя два щипцы с тонкой советы, в среде ледяной рассечение в 35 мм блюда и поддерживать изолированных ткани в солевых инкубации, помещены в 15 мл конические пробки на льду.
13. Вымойте гиппокампах с инкубации физиологического раствора и проинкубируйте с трипсина (1,25 мг/мл) и DNase I (0,25 мг/мл) в инкубации физиологического раствора для 5 минут при 37 ° C. Рекомендуется инкубации объем составляет 2,7 мл физраствора инкубации, 150 мкл 20 x запасов трипсина и 150 мкл акций 20 x DNase (см. Таблицу материалы).
14. Вымойте гиппокампах 3 x с ледяной инкубации физиологического раствора.
15. Аспирационная инкубации солевой раствор и добавить 1 мл среды покрытия, содержащие DNase I (10 мкл Стоковый раствор; см. Таблицу материалы). Приостановить ткани, дозирования не более 20 x и измерить плотность жизнеспособных клеток, используя счетчик соматических клеток и пробирного Трипановый синий.
16. Разбавьте гиппокампа клетки к плотности 1,4 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл для крыс и 2,5 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл для мышей. Семян 1 мл разбавленной клеточных суспензий на ОПЭ покрытием coverslips в 12-ну культуры пластин.
17. Сохранить клетки при 37 ° C в СО2-инкубатор для 2-3 дней.
18. Удалите средство покрытия. Не дайте высохнуть клетки. Аккуратно и быстро добавлять подогретую обслуживания средней (см. Таблицу материалы).
Подготовка крыса корковых нейронов экзоцитоз смешанные культуры и замороженных клеток и возрождение замороженных культур
Примечание: Метод криоконсервирования корковых клеток был описан previously11. Здесь приводится измененный Протокол, в котором корковых клеток может храниться при температуре-80 ° C для по крайней мере 3 месяцев. Блок-схема для этого протокола будет показано на рисунке 2.
1. Подготовьте DMEM, рассечение среднего, солевых инкубации и обшивка среднего, как указано в 1.3.1–1.3.4 шаги и Таблица материалов.
2. Подготовьте мыть среды, представляет собой DMEM, тепло инактивированная плода бычьим сывороточным и пенициллин стрептомицином (см. Таблицу материалы), при необходимости.
3. Экстракт зародышей E18 – 19 из матки наркотизированных женского пола крыса или мыши, используя тонкие Рассечение ножницами и использовать кольцо щипцы для размещения каждой извлеченной эмбриона в ледяной DMEM для холодной анестезии.
4. Удаление мозги из эмбрионов и держать их в ледяной рассечение среде. Удаление кор и поддерживать их в солевых инкубации, помещены в 15 мл конические пробки на льду.
5. Вымойте кор с инкубации физиологического раствора и инкубировать кор с трипсина (1,25 мг/мл) и DNase I (0,25 мг/мл) в инкубации физиологического раствора для 5 минут при 37 ° C. Рекомендуется инкубации объем для 12 Кор-5.4 мл физраствора инкубации, 300 мкл 20 x запасов трипсина и 300 мкл акций 20 x DNase I.
6. Вымойте Кор 3 x с ледяной инкубации физиологического раствора.
7. Удалить супернатант и добавить 2 мл обшивка среднего дополнены с 150 мкл DNase складе. Разбить ячейки, закупорить менее 20 ударов и отфильтровать ячейки с помощью стрейнер ячейки с порами размером 70 мкм.
8. Вымойте клетки ситечко с 20 мл среды, покрытие для обшивки. Для приготовления замороженных клеток складе, вымыть клетки с 20 мл среды, мыть (см. Таблицу материалы)
9. Измерьте плотность жизнеспособных клеток, используя счетчик соматических клеток и метод Трипановый синий.
10. Разбавить корковых клеток к плотности 1,4 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл с напылением среднего и добавьте 1 мл суспензии клеток разреженных Пей покрытием coverslips в 12-ну культуры пластин.
11. Сохранить клетки при 37 ° C в инкубатор CO₂ на 2-3 дней и изменить питательной среды для обслуживания среды.
12. После шага 1.4.9 готовить замороженные корковых клеток фондовой центрифугированием клетки на 187 x g на 3 мин, с использованием swing ротора.
13. Аспирационная супернатант и добавьте криоконсервирования среднего (см. Таблицу материалы) хранится при температуре 4 ° C, для получения клеток плотность составляет 1 x 10-⁷ кл/мл. Аликвота 1 мл суспензии клеток в криогенных трубы.
14. Поместите трубки в ячейку замораживания контейнер с частотой замораживания-1 ° C/мин., пока не будет достигнута температура-80 ° C и передавать морозильник-80 ° C заморозки контейнера. Клетки могут храниться в течение по крайней мере 3 месяцев при температуре-80 ° C.
15. Чтобы оживить замороженный клетки, prewarm мыть среднего (примерно 13 мл для каждой криогенных трубы) и обслуживания среды для замороженных корковых клеток (см. Таблицу материалы).
16. Разморозить замороженные клетки быстро при 37 ° C на водяной бане.
17. Разбавьте талой клеток нежно с подогретую мыть среднего. Центрифуга клетки на 187 x g на 3 мин, с использованием swing ротора.
18. Приостановить гранулы в 1 мл среды мыть и измерить плотность жизнеспособных клеток.
19. Разбавьте клетки с среднего обслуживания для замороженных корковых клеток приносить плотность клеток 3,0 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл и семена 1 мл суспензии клеток в Пей покрытием 12-ну пластины.

2. выражение мембраны целевой GECIs

Transfection клеток
1. Добавить 250 нг ГЕЧИ плазмида (то есть, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 или ООР-GCaMP6f с ЦМВ промоутер)^7,8,9 до 100 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) в колодец. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f, использование 250 нг каждого плазмида в 100 мкл сокращение сыворотке среды в каждой скважине.
2. 0.5 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) в колодец в средних смесь плазмида сокращение сыворотке. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f добавьте 0,5 мкл Реагента трансфекции за хорошо.
3. Инкубируйте смесь для 30 мин при комнатной температуре (20-28 ° C).
4. Добавьте 100 мкл смеси для каждого coverslip в drop-wise манере.
5. Инкубируйте клетки для 48-72 ч в инкубатор CO₂ при 37 ° C разрешить выражение GECIs.
Трансфекция и аденоассоциированный вирус гиппокампа или корковых нейронов
Примечание: Трансфекция для 3-5 дней в пробирке (DIV) приводит к трансфекции показатель для нейронов. Трансфекция на 6 – 8 DIV является предпочтительным для оптимального выражение GECIs в астроциты. Для выражения GECIs в культуре диссоциированных нейронов после 9 DIV инфекции векторов аденоассоциированный вирус (AAV) обеспечивает лучшую эффективность выражения. Векторы AAV для выражения Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f под EF1a, промоутеров были подготовлены, как описано ранее, с помощью HEK293 клетки¹² (см. Таблицу материалы).
1. Для transfection 3-8 дней после покрытия лейбл две трубы, один для плазмида ДНК и другой для transfection реагента.
2. Добавьте 50 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) за хорошо к каждой трубе.
3. Добавьте 0,5 мкг плазмидной ДНК в coverslip и 1 мкл дополнения в сопровождении трансфекции реагент для нейронов (см. Таблицу материалы) за хорошо плазмида ДНК трубки. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f 0,5 мкг каждая плазмиды и 1 мкл дополнения смешиваются в 50 мкл сокращение сыворотке среднего за хорошо.
4. 1 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) за хорошо в трансфекции реагент трубки. То же самое количество реагента transfection используется для cotransfection.
5. Вихревой обе трубки для 1-2 секунд.
6. Добавьте смесь трансфекции реагента (из шага 2.2.4) в ДНК смесь (из шага 2.2.3). Смешайте нежно закупорить и инкубировать смесь (100 мкл в coverslip) за 5 мин при комнатной температуре.
7. Загрузите эту смесь на клетки в drop-wise манере.
8. Инкубируйте клетки в инкубатор CO₂ на 2-3 дня до тех пор, пока белки маркер выражаются.
9. Для AAV инфекции мкл 3 AAV за хорошо смешанных нейрон экзоцитоз культуры. Смешайте нежно покачиваясь на блюдо. Для двойной инфекции Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f 3 мкл каждого AAV вводится в колодец. В случае, если количество клеток, выражая GECIs недостаточно, следует определить оптимальный объем AAV для инфекции.
10. Поддерживать культуру для 1 – 2 недели до тех пор, пока выражаются в GECIs.

3. Ca^{2 +} изображения

Одновременные снимки клеток, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f
Примечание: Чтобы одновременно записывать требуются Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f сигналов, разделение изображений оптика. Оптика включить разделение RCaMP2 и GCaMP6f и их проекции на тот же кадр фотографические камеры (рис. 3A). Одновременных изображений также требует источники (1) света, которые могут одновременно испускают возбуждения света в синий (450-490 Нм) и спектры Грин (500 – 560 Нм), фильтр (2)-Двухленточная и дихроичное зеркало устанавливает в Микроскоп, и (3) выбросов фильтры для RCaMP2 и GCaMP6f. Для подробной информации обратитесь к Таблице материалов.
1. Включите устройства обработки изображений и компьютеры по крайней мере 30 минут до записи. Prewarm Микроскоп, Отопление камеры до 37 ° C. Настроить образ расщепление устройства, фильтры и источник света. Выравнивание изображения расщепление Оптика, так, что же поле зрения появляется на камеру. Выберите соответствующий объектива (см. Таблицу материалы).
2. Гора coverslip, содержащие клетки transfected с Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в камере записи, добавьте соответствующие изображений среднего или буфера (400 мкл для 18 мм coverslips) в палате и поместите его на сцене микроскопа. Поместите крышку на запись камеры чтобы избежать испарения среды.
3. Поиск ячеек, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f флуоресцентных изображений. Минимизируйте возбуждение интенсивности света для предотвращения Фотообесцвечивание и Фототоксичность.
4. Снимите крышку и начать запись отснятого на 10 Гц. Во время этой записи, добавьте агониста в палату вызвать Ca^{2 +} ответы (например, гистамин для клеток HeLa, СПС для клетки COS-7).
5. Сохраните данные промежуток времени в жесткий диск (HDD).
6. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Запись спонтанной деятельности астроциты, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f
Примечание: Без разделения изображений оптика Ca^{2 +} сигналов на плазматической мембраны и тех, кто вокруг ER может контролироваться в той же ячейке. Здесь описывается последовательной записи Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в том же астроциты. Цель нефти погружения с числовой апертуры, больше, чем 1.3 настоятельно рекомендуется для спонтанной Ca^{2 +} активности.
1. Включите Микроскоп, камеры, источник света и нагрева Микроскоп камеры по крайней мере 30 минут до начала записи.
2. Маунт coverslip, содержащие клетки transfected с Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в зале звукозаписи и 400 мкл изображений среды. Поместите крышку на верхней части камеры.
3. Выберите фильтр для GCaMP6f и источника света (синий свет возбуждения, например 470– 490 Нм; см. Таблицу материалы). Найдите астроциты, выражая ООР-GCaMP6f.
4. Выберите набор фильтров и источником света для RCaMP2 (зеленый свет возбуждения, например, 510 – 560 Нм; см. Таблицу материалы) и подтвердите ли Lck-RCaMP2 выражается в том же астроциты. Избегайте длительного воздействия источника света для предотвращения Фотообесцвечивание.
5. Запись отснятого изображения Lck-RCaMP2 в 2 Гц на 2 мин сохранить визуализации данных на жестком диске.
6. Измените фильтр установить это для GCaMP6f. Запись отснятого изображения ООР-GCaMP6f в том же поле зрения, в 2 Гц в течение 2 мин сохранить данные на жестком диске.
7. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображения.
Запись спонтанной активности нейронов и индуцированных Ca^{2 +} высота в нейроны
Примечание: Микроскоп установки для нейронов изображений является таким же, как описано в разделе 3.2. Здесь описан изображений спонтанное Ca^{2 +} высота благодаря Lck-GCaMP6f и Ca^{2 +} высота индуцированных mGluR активации вследствие ООР-GCaMP6f.
1. Для записи спонтанной активности нейронов, Маунт coverslip, содержащие клетки, выражая Lck-GCaMP6f в зале звукозаписи и 400 мкл изображений среднего. Поместите крышку на верхней части камеры.
2. Установите фильтр и источника света (синий возбуждения, например 470 – 790 нм; см. Таблицу материалы) для тех, для GCaMP6f. Найти нейронов, выражая Lck-GCaMP6f и спонтанной активности.
3. Получение изображений частотой 2 Гц или выше. Сохраните данные на жестком диске.
4. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображения.
5. Чтобы записать индуцированных Ca^{2 +} высота, Маунт coverslips, содержащие клетки, выражая ООР-GCaMP6f с 400 мкл изображений среднего. Поместите крышку на верхней части камеры.
6. С помощью фильтра для GCaMP6f, найти нейронов, выражая ООР-GCaMP6f.
7. Снимите крышку. Начало покадровой записи частотой 2 Гц или выше. Во время записи, добавьте агонисты для Gq белка сочетании рецепторов (например, mGluR5 агонист [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [ДХПГ]) вызывают Ca^{2 +} освобождение от ER.
8. Сохранить покадровой изображения на жестком диске и анализировать данные.

Результаты

LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были выражены в клетки HeLa, и оба сигналы были записаны одновременно, используя изображение расщепление Оптика, 24 ч после трансфекции (Рисунок 3А и 1 видео). Изображения были приобретены в 10 Гц. гистамина (его, 1 мкм), который индуцирует Ca^{2 +} освобождение от ER, был добавлен во время записи. По его заявлению увеличить интенсивность сигнала Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f, как показано в псевдоцветном отображение ΔF/F0, который представляет изменение от первоначального флуоресценции интенсивности (рис. 3B). Время курсы Ca^{2 +} высота (ΔF/F0) сообщил Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были сопоставлены в том же регионе интереса (ROI) (рис. 3 c). ΔF/F0 значения были нормализованы к их максимальные значения для включения времени курс сравнение между двумя различными GECIs, которые имеют различные выражения уровня и распределения. Оба датчика сообщили Ca^{2 +} высоте колебаний как. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f показал тот же курс время для Ca^{2 +} высота в двух клетках среди типов пяти клеток изучены (рис. 3 c, ROI 1 и 3). Однако Ca^{2 +} фасады, проявленная Lck-RCaMP2 оставалась на более высоком уровне, по сравнению с проявленной ООР-GCaMP6f (рис. 3 C, ROI, 2, 4 и 5). Результаты показывают, что Ca^{2 +} высота затягивается вблизи плазматической мембраны, в то время как он завершается раньше вокруг ER, который является источником этого Ca^{2 +} сигнала, вызванных его стимуляции.

Спонтанное Ca^{2 +} сигналы от астроциты в нейрон экзоцитоз смешанной культуре от крыс гиппокампах (Рисунок 4A) и Кор (рис. 4B) были продемонстрированы Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f (рис. 4, 2 видео видео 3 , 4и 5 видео). Корковых культур были возрождены из замороженных запас, который был подготовлен, как описано в настоящем Протоколе. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f сигналов последовательно были записаны на 2 Гц от тех же ячейках. В районе, который показал Ca^{2 +} высота каждой ГЕЧИ были отобраны три ROIs, и время курс ΔF/F_базы (т.е., интенсивность флуоресценции) изменен с интенсивность средняя флуоресценции в период всей записи (F_база). Когда базовые флуоресценции является стабильным и Ca^{2 +} высотах менее часты, F_{базовый} становится полезным базовых обнаружить Ca^{2 +} высота события. Спонтанное Ca^{2 +} фасады были видны только в рамках Астроцитарная процесса, а не в клетки тела. Этот результат согласуется с предыдущими докладами по Астроцитарная спонтанные Ca^{2 +} сигналы других GECIs визуализация в пробирке¹³ и в естественных условиях¹⁴. В гиппокампе и корковые астроциты Ca^{2 +} фасады, проявленная Lck-RCaMP2 (вверху) были более частыми, чем те показали ООР-GCaMP6f. Этот результат согласуется с нашей предыдущей демонстрации, что Ca^{2 +} фасады в астроциты благодаря Lck-GCaMP6f обнаружены чаще, чем те из-за ООР-GCaMP6f⁷ и свидетельствует о том, что это понятие распространяется также на Одноместный клеточном уровне.

Спонтанное Ca^{2 +} фасады по Lck-GCaMP6f в незрелых крыса гиппокампа нейронов (10 DIV) были замечены в 2 Гц (рис. 5А и 6 видео). Время курсы ΔF/F0 в пяти различных ROIs предполагают, что эти Ca^{2 +} фасады локально ограничиваются субцеллюлярные доменов. Рисунок 5B (7 видео) показывает Ca^{2 +} ответы в зрелых мыши гиппокампа нейронов (30 DIV) инфицированных векторы AAV ООР-GCaMP6f-выражение. Нейроны были стимулируется с 100 мкм ДХПГ, который является агонистом рецепторов глутамата Метаботропные, вызывая Ca^{2 +} выпуска. Был обнаружен ДХПГ индуцированной Ca^{2 +} выпуска ООР-GCaMP6f.

figure-results-1
Рис 1: диаграмма, показывающая мембраны ориентированных GECIs. Принципиальная схема ориентированные на плазматической мембране GECIs (Lck-GCaMP6f и Lck-RCaMP2) и внешняя ER мембраны целевой GCaMP6f (ООР-GCaMP6f).

figure-results-2
Рисунок 2: схема для подготовки гиппокампа и корковых клеток, плазмида transfection и инфекции AAV. Микроскопических изображений являются представительными, свежезаваренным покрытием DIV-6 корковых клеток (слева) и возродил клетки из замороженных запасов (справа). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: пример одновременные снимки Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. (A) схематическое представление разделения сигнала изображения расщепление оптикой. Же поле зрения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f одновременно проецируется на камеру. В видео 1представитель записи, приобретенные на 10 Гц CMOS камера, и один кадр этой записи отображается в панели A (справа). (B) псевдо-цветных изображений ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Гистамин (его, 1 мкм) был добавлен на 0 с. (C) представитель нормированное время ΔF/F0 курс Lck-GCaMP2 (пурпурный) и ООР-GCaMP6f (зеленый). Данные были нормализованы максимальное значение ΔF/F0 для каждого участка. Серые линии показывают сроков его применения. Данные были проанализированы с программного обеспечения TI Workbench¹⁵. Шкалы бар = 50 мкм (микроскопических изображений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Спонтанное Ca^{2 +} высота в астроциты, мониторинг для выражения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f. (A) представитель гиппокампа и (B) корковых астроциты transfected с Lck-RCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Корковых клеток были возрождены из замороженных запасов культур. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f изображения последовательно были приобретены в той же ячейке, 2 Гц, с Эм-ПЗС-камеры. Участки на левой шоу время курсы ΔF/Fbase, измеряемая в ROIs указывается в микроскопических изображений. Данные были проанализированы с TI Workbench. В 2 видео, видео 3, видео 4и 5 видеопредоставляются фактические фильмы. В баре шкалы = 20 мкм (микроскопических изображений). Базовые дрейф предлагает изменения в глобальном Ca^{2 +} уровне в ячейке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Примеры Ca^{2 +} изображений в нейронах с Lck-GCaMP6f и ООР-GCaMP6f. (A) представитель крыса гиппокампа нейронов, выражая Lck-GCaMP6f на 10 DIV (слева) и участки, указанием времени курсы ΔF/F0 измеряется в ROI (желтые круги) были указаны в изображении (справа). Номера в курсе времени соответствуют номерам ROI в изображении. Обратите внимание, что временная модель Ca^{2 +} высота отличается между различными регионами интереса. Базовые дрейф предполагает увеличение уровня глобальной Ca^{2 +} в этот нейрон. (B) пример зрелых мыши гиппокампа нейронов (DIV 30) инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (слева). Время курса участок ΔF/F0 измеряется показывает Ca^{2 +} ответ до 100 мкм (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на сроки, проявленная на серой панели. Желтые круги показывают положение ROIs где время курс был получен. Изображения были приобретены 2 Гц с охлаждением ПЗС-камеры (группа A) или Эм-CCD камеры (группа B) и проанализированы с TI Workbench. Шкалы бар = 20 мкм (микроскопических изображений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6
Видео 1: пример одновременного отображения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. Представитель запись приобрела на 10 Гц и представлен на рисунке 3. Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-7
Видео 2: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в гиппокампе экзоцитоз. Представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4A), записан в том же поле зрения как 3 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-8
Видео 3: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в гиппокампе экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4A), в том же поле зрения как 2 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-9
Видео 4: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в корковых экзоцитоз представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4B), записан в том же поле зрения как 5 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-10
Видео 5: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в корковых экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4B), в том же поле зрения как 4 видео. В баре шкалы = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-11
Видео 6: Пример Ca^{2 +} изображений в нейрон гиппокампа крысы (DIV 10) по Lck-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca^{2 +} сигналы записаны в 2 Гц (рис 5A). Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

figure-results-12
Видео 7: Ca^{2 +} релиз в мыши гиппокампа нейрон (DIV 30), выражая ООР-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca^{2 +} сигналы записаны в мыши гиппокампа нейрон инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (Рисунок 5B). Нейрон была простимулирована с 100 мкм dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на 30 s вызывают Ca^{2 +} освобождение от ER. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Обсуждение

Разнообразные биологические выходы инициируются Ca^{2 +} сигналов. CA^{2 +} является универсальным внутриклеточных сигнальных messenger. Декодирование Ca^{2 +} сигналы вызывают конкретные мероприятия был фундаментальный вопрос биологического, и Ca^{2 +} методы для описания многообразия Ca^{2 +} сигналов визуализации не требуется. В настоящее время подробный протокол позволяет обнаружение собственный Ca^{2 +}сигналов на плазматической мембраны и ER (рис. 3 и рис. 4) и местные Ca^{2 +} microdomains в ячейку (рис. 4 и 5). Это способствует описания самых различных внутриклеточных Ca^{2 +} сигналов. Временное разрешение Ca^{2 +} сигналов, также была улучшена путем ориентации GECIs в плазматической мембраны и ER, потому что это может избежать эффекта трехмерного диффузии Ca^{2 +} и GECIs себя, и она имеет потенциал, чтобы обнаружить момент Ca^{2 +} приток или Ca^{2 +} релиз, в котором происходит на мембране.

Протокол имеет некоторые ограничения. Пользователи должны иметь в виду, что обнаруженные сигналы являются суммирование «момент Ca^{2 +} приток или освобождения» и «Ca^{2 +} рассеянный от первоначального Ca^{2 +} источника», особенно для больших Ca^{2 +} сигналов. Например хотя его стимуляции клеток HeLa вызывает Ca^{2 +} освобождение от ER, его результирующей Ca^{2 +} сигналы обнаруживаются не только ER-целевой ООР-GCaMP6f, но и плазмы мембраны ориентированные Lck-RCaMP2 (рис. 3). Другое ограничение состоит, что пространственно-временных шаблон Ca^{2 +} сигналов не может быть единственным определяющим фактором вывода Ca^{2 +} сигналов. Распределение по течению эффекторных белков (например Ca^{2 +}-зависимые киназы и фосфатаз) также может быть определяющим фактором². Полностью расшифровать внутриклеточные сигналы Ca^{2 +} , анализ поведения течению фермента, который не рассматривается в настоящем Протоколе, является абсолютно необходимым.

Одним из наиболее важных аспектов для успешного Ca^{2 +} изображений является изображения установки и изображения приобретение условия, а также как другие исследования жить изображений. Ранее мы показали, что Ca^{2 +} ответы в ячейке сильно зависит от продолжительности и интенсивности возбуждения и на условиях приобретения изображений, включая воздействия времени и приобретение частот¹⁶. Мощность освещения возбуждения является самым важным фактором, как это может вызвать токсическое воздействие света и Фотообесцвечивание GECIs. Запись условия время экспозиции, запись частоты, интенсивности света возбуждения и продолжительность записи должны быть оптимизированы согласно цели эксперимента. Мы рекомендуем сократить время экспозиции и возбуждения света, насколько это возможно избежать Фотообесцвечивание и фототоксичности на ячейку. Запись частоты и продолжительности записи должно быть достаточно для покрытия Ca^{2 +} высота события, представляющие интерес, но должны храниться как низкий, как можно избежать Фотообесцвечивание и Фототоксичность также. Мы рекомендуем сначала определить запись частоты и продолжительности и оптимизации интенсивности света и времени экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание GECIs. Еще одним важным фактором является уровень экспрессии GECIs. GECIs у Ca^{2 +}-буферизация эффект, поскольку они Ca^{2 +}-привязка белков. Таким образом гиперэкспрессия GECIs приводит к буферизации Ca^{2 +}, который является физиологически необходимых для клеток. Чтобы избежать визуализации ячеек, выражая большое количество GECIs следует минимизировать количество ГЕЧИ выражения.

В заключение рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции является одним из наиболее важных шагов для декодирования внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы, которые определяют биологические явления вывода. Этот протокол обеспечивает новый метод для рассечения Ca^{2 +} сигналов для описания многообразия среди этих сигналов. В настоящее время этот метод ограничен для экспериментов в пробирке. Однако уже Lck-GCaMP6f используется для в-vivo Ca^{2 +} изображений в мышей¹⁷, и ООР-GCaMP6f было подтверждено следить Ca^{2 +} сигналов in vivo в VD двигательных нейронов в C. elegans7. Таким образом ориентация GECIs в отсеке субцеллюлярные имеет потенциал, чтобы расширить в естественных условиях изображений в будущем, таким образом благоприятные Ca^{2 +} рассечение в естественных условиях.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается следующие гранты: Япония науки и техники Агентство (JST) / Precursory исследования эмбриональных науки и технологии (PRESTO) (JPMJPR15F8, Япония); Японское общество содействия развитию науки (JSP) / гранты в помощи для научных исследований (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Фонд Такэда. Авторы благодарят Haruhiko Бито (Университет Токио) за предоставление RCaMP2 и Артур Д.Ю Huang и Томас Макхью (RIKEN CBS) для предоставления векторы AAV и инструкции в отношении подготовки AAV. Авторы хотели бы также поблагодарить редакторов в журнал визуализировать эксперименты за их помощь с видео съемки и редактирования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(RS)-3,5-дигидроксифенилглицин (DHPG)	Tocris	#0342
0,5% раствор ДНКазы I	Sigma-Aldrich	#11284932001	Приготовьте 0,5% ДНКазу I (w/v) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с добавлением 120 мМ MgSO₄. Подготовьте 160 & микро; L aliquots и хранить при -30 °C.
0,5% раствор трипсина-ЭДТА	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 мМ L-глютамина (× 100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	Приготовление небольших аликвот 250-750 &микро; L и хранить при -30 °C.
100 мМ пирувата натрия (× 100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 мл) можно хранить при температуре -20 °C. После оттаивания раствор можно поддерживать при температуре 4°°; С в течение 2 месяцев.
12-луночные мультилуночные планшеты для культивирования с крышкой с низким уровнем испарения	Falcon	#353043	Крышка с низким уровнем испарения имеет решающее значение для культивирования смешанной культуры нейрон-глия. Для клеток клеточной линии можно использовать альтернативные питательные чашки.
Круглые покровные стекла диаметром 18 мм	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Толщина 1,18 мм диаметр круглые покровные стекла; можно использовать альтернативные покровные стекла.
1 м HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7,2-7,6
2,5% стоковый раствор трипсина (× 20 stock)	Sigma-Aldrich	#T4674	Prepare 150 µ L aliquot и хранить при -30 °C.
50% раствор поли(этиленимина) (ПЭИ)	Sigma-Aldrich	#P3143	Приготовьте 2% (v/v) исходный раствор PEI (× 50) с дистиллированной водой, стерилизованной фильтрацией. Складской раствор при -30 °° C После приготовления небольших аликвот по 250-750 &мкм. Приготовьте 0,04% раствор PEI с дистиллированной водой в день покрытия покровного стекла.
70% этанол			Хранится в пульверизаторе для использования для дезинфекции поверхностей.
Аденоассоциированный вирус (AAV) для экспрессии Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 и OER-RCaMP2 под руководством промотора			AAV может быть получен с использованием AAV Helper Free System (Agilent Technologies) и клеток HEK293 или альтернативными методами. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 и pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f доступны по запросу.
Дополнение к B-27 (× 50 stock)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	Это может быть заменено на добавку B-27 plus (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) или MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	Япония SLC, Inc.
Камера для записи			Для использования были доступны следующие камеры: охлаждаемая ПЗС-камера (например, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD камера (например, Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) или CMOS-камера (например, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Контейнер для заморозки ячеек	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Можно использовать альтернативный контейнер для заморозки ячеек.
Сетчатый фильтр для клеток	Falcon	#352350
CO₂ инкубатор			Поддерживать на уровне 37 ° C, 5% CO₂.
Криогенная трубка	Corning	#430661	Можно использовать альтернативные криогенные трубки.
Среда для криоконсервации	Zenoaq		"CELLBANKER1"Культуральная
среда (для клеток HeLa)			Модифицированная среда Дульбекко Eagle's Media (DMEM) с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки и раствором пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация: пенициллин 100 Ед/мл и стрептомицин 100; г/мл)
Среда для вскрытия			Один миллилитр 1 М ГЕПЭС (конечная концентрация 20 мМ) до 49 мл ДМЭМ
DMEM	Nacalai	#08456-65	Можно использовать альтернативный DMEM.
DMEM	Nacalai	#08456-65	Реагент
трансфекции ДНК	Sigma-Aldrich	#6366244001	X-tremegene HP реагент для трансфекции ДНК" Можно использовать альтернативные реагенты для трансфекции.
Стеклянная банка с крышкой			500 мл (для мыши) или 1 500 мл (для крысы) для обезболивания животного
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS без кальция и магния
Термоинактивированная бычья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	#10100147
Клетки HeLa	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Гистамин	Сигма-Олдрич	#H7125
Программное обеспечение для			анализа изображенийТакие как Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH) и TI Workbench14 (изготовленный на заказ)
Расщепляющая изображение оптика	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Расщепляющая изображение оптика дихроичное зеркало	Semrock	#FF560-FDi01-25× 36	Для разделения зеленого флуоресцентного белка / красного флуоресцентного белка (GFP/RFP) сигнал
Расщепление изображения оптика фильтры излучения	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	Для излучения сигнала GFP/RFP, соответственно
Среда визуализации и буфер			Используйте оптимальную среду или буфер для эксперимента. При использовании среды желательно использовать среду без фенольного красного для снижения фоновой флуоресценции. Добавьте 20 мМ HEPES для поддержания pH за пределами CO₂ инкубатора.
Инкубационный физиологический раствор			Добавьте 1 мл 1 М HEPES (20 мМ) к 49 мл HBSS
Инвертированный флуоресцентный микроскоп,			такой как IX73 (Olympus) или Eclipse TI (Nikon Instech)
Изофлуран	Pfizer		Используется для анестезии
Поддерживающая среда (на 4 & 12 лунок посуды)			48,5 мл Нейробазал-А среда с добавлением 1 мл B-27, 500 &; L запаса L-глютамина и 25 & микро; L Пенициллин-стрептомицин раствор.
Поддерживающая среда для замороженных клеток коры головного мозга (на 1 & 12 луночных посуд)			12,2 мл Нейробазал плюс медиум с добавкой 250 & микро; L B-27, 125 & L L-глютамина и 6,2 & микро; L Пенициллин-стрептомицин раствор.
MEM (Minimum Essential Medium)	Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific	#11090-081
Набор фильтров микроскопа для визуализации			Подходящий фильтр для GFP (возбуждение, 480 ± 10 нм; излучение, 530 ± 20 нм)
Набор фильтров микроскопа для визуализации			Подходящий фильтр для RFP (возбуждение, 535 ± 50 нм; излучение, длина пропускания 590 нм)
Наборы фильтров для микроскопа для двойной визуализации RCaMP2 и GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25× 36, #FF01-512/630-25	Двойной фильтр возбуждения, двойное дихроичное зеркало и фильтр излучения для визуализации GFP/RFP.
		нагрева под микроскопом	Система нагрева для поддержания ячеек при температуре 37°°; C во время визуализации. Чтобы избежать дрейфа, вызванного тепловым расширением, рекомендуется использовать системы нагрева, охватывающие весь микроскоп (например, Tokai Hit, Thermobox).
Микроскоп Источник света для возбуждения			Ртутная лампа (100 Вт), Ксеноновая лампа (75 Вт), Светодиодная (LED) система освещения (например, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-волновый светодиодный источник; Lumencor, световой модуль SPECTRA X). В случае ртутной комовой и ксеноновой лампы используйте нейтральный фильтр для снижения интенсивности возбуждения.
		микроскопа	План-Апохромат масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой выше 1,3 настоятельно рекомендуется для регистрации спонтанной активности Ca²⁺ в нейронах и астроцитах.
Нейробазал плюс средний	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Нейробазал-А средний	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Нейробазал плюс средний (Thermo Fisher, A3582901) можно использовать вместо нейробазального-А medium.
PBS(-): Фосфатно-солевой буфер без Ca²⁺ и Mg²⁺	Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation	#164-23551	Отсутствие Ca²⁺ и Mg²⁺ имеет решающее значение для того, чтобы не ингибировать активность трипсина. Можно использовать альтернативу PBS(-).
		для ПК и получения изображений	, такое как Metamorph (Molecular Devices); Микроменеджер; Верстак TI¹⁴.
Пенициллин-стрептомицин раствор	Thermo Fisher Scientific	#15140122	пенициллин 10,000 Ед/мл и стрептомицин 10,000 &микро; г/мл
Плазмида для экспрессии Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 и OER-RCaMP2 под действием промотора цитомегаловируса ^7-9			Доступно по запросу
Гальваническая среда (для 4 &; 12 лунок)			48 мл MEM с добавлением 1 мл добавки B-27, 500 &; L L-глюкозы в запасе (конечная концентрация: 2 мМ), 500 и микро; Л запаса пирувата натрия (1 мМ) и 25 & микро; L Раствор пенициллин-стрептомицина (пенициллин 5 Ед/мл, стрептомицин 5 и микро; г/мл). Такая концентрация пенициллина-стрептомицина, которая составляет 1/20 от Концентрация, рекомендованная производителем, имеет решающее значение для выживания нейронов.
Записывающая камера	Elveflow	Ludin Chamber	Эта записывающая камера предназначена для круглых покровных стекол диаметром 18 мм.
Уменьшенная сывороточная среда	Thermo Fisher	#11058021	Стереомикроскоп
			Используется для препарирования гиппокампа. Доступны стереомикроскопы Olympus SZ60 или аналогичные.
Хирургические инструменты			Стандартные препарирующие ножницы для разреза живота мыши или крысы, пинцет для ущипывания матки, тонкие препарирующие ножницы для разреза матки и головки эмбриона, кольцевые щипцы для ущипывания эмбрионов, 13 см изогнутые щипцы Семкена (Fine Science Tools #11009-13) для извлечения мозгов, 3 щипца с тонкими наконечниками (Дюмон Инокс #5)
Реагент для трансфекции нейронов	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	Lipofectamine 3000" реагент. Он состоит из "добавки (P3000)", которую следует смешать с плазмидной ДНК на шаге 2.2.3, и "реагента для трансфекции (липофектамина 3000)", используемого на шаге 2.2.4.
Трипан синий (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
Промывочная среда для замороженных клеток коры головного мозга			25 мл DMEM, дополненный 250 & микро; Л инактивированная теплом фетальная бычья сыворотка + 12,5 &; L Пенициллин стрептомицин.
Крысы Wistar	Japan SLC, Inc		Беременные крысы (E18)

EF1a микроскопических изображений для с низким содержанием глюкозы " GCaMP6f RCaMP2 Система Объектив Программное обеспечение Opti-MEM "

Ссылки

Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение