Методическая статья

Индукция и характеристика легочной гипертензии у мышей с использованием модели Hypoxia/SU5416

DOI:

10.3791/59252

⸱

3 июня 2020 г.

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает индукцию легочной гипертензии (PH) у мышей на основе воздействия гипоксии и инъекции антагониста рецепторов VEGF. У животных развивается гипертрофия PH и правого желудочка (Р.В.) через 3 недели после начала протокола. Представлена также функциональная и морфометрическая характеристика модели.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легочная гипертензия (ПХ) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним артериальным давлением легких, превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризации правого сердца. Широкий спектр заболеваний может привести к PH, отличающийся в своей этиологии, гистопатиологии, клинической презентации, прогноз, и ответ на лечение. Несмотря на значительный прогресс в последние годы, PH остается непросамых заболеваний. Понимание основных механизмов может проложить путь для разработки новых методов лечения. Модели животных являются важными инструментами исследования для достижения этой цели. В настоящее время существует несколько моделей, доступных для повторного воспроизведения PH. В этом протоколе описывается двухухитовая модель PH мыши. Стимулами для развития PH являются гипоксия и инъекция SU5416, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) антагонист рецепторов. Через три недели после начала Hypoxia/SU5416, животные развивают легочную сосудистую ремоделирование, имитирующее гистопатологические изменения, наблюдаемые в PH человека (преимущественно Группа 1). Сосудистая ремоделирование в легочной циркуляции приводит к реконструкции правого желудочка (Р.В.). Подробно описаны процедуры измерения давления Р.В. (с использованием метода открытой грудной клетки), морфометрический анализ Р.В. (путем вскрытия и взвешивания обоих желудочков сердца) и гистологические оценки ремоделирования (как легочной путем оценки сосудистой ремоделирования, так и сердечной путем оценки гипертрофии и фиброза кардиомиоцитов). Преимуществами этого протокола являются возможность применения как в диком типе, так и у генетически модифицированных мышей, относительно легкая и низкая стоимость реализации, а также быстрое развитие болезни интереса (3 недели). Ограничения этого метода в том, что мыши не развиваются тяжелые фенотип и PH обратима по возвращении к нормоксии. Профилактика, а также исследования терапии, могут быть легко реализованы в этой модели, без необходимости передовых навыков (в отличие от хирургических моделей грызунов).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Легочная гипертензия (PH) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним давлением легочной артерии (ПА), превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризацииправого сердца 1,2. Существует целый ряд заболеваний, которые могут привести к PH. В попытке организовать условия, связанные с PH, было разработано несколько классификационных систем. Текущая клиническая классификация классифицирует множественные заболевания, связанные с PH, в 5 различныхгруппах 1. Это различие имеет важное значение, поскольку различные группы пациентов имеют заболевания, которые отличаются в их клинической презентации, патологии, прогноз, и ответ налечение 2. В таблице 1 кратко излагается нынешняя классификация, дополненная основными гистопатологическими характеристиками каждого заболевания.

figure-introduction-1
Таблица 1: Обзор клинической классификации PH, наряду с основными гистопатологическими особенностями в группах. Пригодность протокола Hypoxia/SU5416 для моделирования PH. Эта таблица была изменена с19. PH: Легочная гипертензия, ПАГ: Легочная артериальная гипертензия

Несмотря на значительные достижения в лечении заболеваний, связанных с PH, PH по-прежнему остается без лечения, с 3-летним коэффициентом смертности в диапазоне от 20% до 80%3. Это указывает на настоятельную необходимость понимания основных механизмов PH и, после этого, развитие новых методов лечения для предотвращения, замедления прогрессирования и лечения болезни. Модели животных имеют решающее значение для этого масштаба. В настоящее время существуют различные модели для изучения PH. Заинтересованный читатель относится к отличным отзывам на эту тему2,,3,,4. Принимая во внимание разнообразие заболеваний, ведущих к PH, очевидно, что различные условия человека PH не могут быть полностью резюмированы в одной модели животных. Доступные модели животных можно классифицировать в i) одноразовых, ii) двух-хит, iii) нокаутом, и iv) модели переэкспрессии3. В одноразовых моделях PH индуцируется одним патологическим стимулом, в то время как двухуголютные модели сочетают в себе два патологических стимула с целью индуцирования более тяжелого PH и, таким образом, более тесно имитируют сложные заболевания человека. Помимо этиологических различий, несколько стимулов приводят к различиям в моделировании PH, которые зависят также от вида и генетического фона животных4.

Один из наиболее часто используемых классических моделей PH грызунов является хроническая гипоксиямодель 2. Гипоксия, как известно, вызывают PH у людей, а также в нескольких видах животных. Гипоксия имеет то преимущество, что физиологический стимул для PH (Таблица 1). Однако, в то время как степень гипоксии, используемой для индуцирования PH у грызунов является гораздо более серьезным, чем у людей, одно оскорбление (гипоксия) приводит только к легкой форме сосудистой ремоделирования. Это не имитирует тяжесть болезни человека. Добавление второго удара, дополнительный стимул для индуцирования PH, показал многообещающие результаты: инъекция соединения SU5416 грызунов в сочетании с гипоксическим стимулом вызывает более тяжелые ФЕНОтип2,5,6. SU5416 является ингибитором сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) рецептора-2. Он блокирует рецепторы VEGF и приводит к эндотелиальной апоптоз клеток. В гипоксических условиях это стимулирует распространение подмножества апоптоз-устойчивых эндотелиальных клеток. Кроме того, SU5416 приводит к гладкой пролиферации мышечных клеток. Сочетание этих эффектов приводит к патологическое сосудистое ремоделирование легочной циркуляции и приводит к повышенному давлению ПА и правого желудочкаремоделирования 2,5,7. Модель была сначала описана у крыс6, а затем применена кмышам 4,,5,,7. Модель мыши демонстрирует менее тяжелую сосудистую ремоделирование по сравнению с крысами. Кроме того, когда возвращается к нормоксия, PH продолжает прогрессировать у крыс, в то время как у мышей это частично обратимым.

В следующем протоколе описаны все шаги по моделированию PH у мышей с использованием метода Hypoxia/SU5416 (планирование, хронология, исполнение). Кроме того, характеристика модели описана в этом протоколе: функционально (путем инвазивного измерения давления правого желудочка (РВ) с использованием открытой техники грудной клетки), морфометрически (путем вскрытия и взвешивания как правого, так и левого желудочков), а также гистологически (путем оценки ремоделирования легочной сосудистой системы, гипертрофии правого желудочка и фиброза).

Все шаги и методы, описанные в этом протоколе, могут быть легко реализованы следователями на любом уровне опыта. Хотя функциональные измерения Р.В. с использованием открытой техники груди (описанный здесь) не является золотым стандартом метода в этой области, он имеет то преимущество, что он может быть быстро изучены и точно воспроизведены даже менее опытный экспериментатор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перед любыми экспериментами на животных получить разрешение местного институционального комитета по уходу за животными. Нынешние эксперименты были проведены после одобрения Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Икан на горе Синай.

1. Индукция PH

  1. Подготовка
    1. Перед началом исследования тщательно спланируйте экспериментальный проект. Убедитесь, что мыши подвергаются гипоксии в то же время, как первая инъекция SU5416. Пример экспериментальной конструкции для индуцирования PH с использованием метода Hypoxia/SU5416 показан на рисунке 1A. Контрольные мыши получили только транспортное средство. Для этой модели, SU5416 будет вводиться мышам один раз в неделю в течение 3 недель подряд.
    2. Используйте восемь-двенадцать недель C57BL/6 мышей для этого исследования. Дом животных на 18-20 градусов по Цельсию в 12-ч светло-темный цикл. Убедитесь, что пища и вода доступны объявление libitum.
    3. Взвесь животных. Назначьте их случайным образом каждой группе: Нормоксия и Гипоксия/SU5416.
    4. Подготовь гипоксическую камеру, как показано на рисунке 1B. Безопасный азот (N2)танки возле камеры. Установите кислород (O2) контроллер в точке 10% O2. Пусть система достигнет стабильного состояния.
    5. Подготовка SU5416 для инъекций (использовать дозу 20 мг/кг массы тела). SU5416 не растворяется в aqueous решениях; таким образом, растворить расчетную сумму в 100 йл DMSO8. Например, для мыши объемом 25 г количество вводимого SU5416 составляет 0,5 мг, растворенного в растворителях 100 л (DMSO). Окончательная концентрация SU5416 для этой мыши, таким образом, 5 мг/мл.
      ВНИМАНИЕ: SU5416 является опасным материалом. Внимательно прочитайте лист данных по безопасности в сопровождении продукта и убедитесь, что принять рекомендуемые меры предосторожности при обработке этого вещества. Носите защитные перчатки и (как для любой инъекции) использовать защиту глаз. Химическая структура SU5416 показана на рисунке 1C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте соответствующее превышение раствора, чтобы компенсировать объем, который будет потерян во время инъекции (например, в шприце, флаконе и т.д.). В зависимости от используемого шприца, мертвый объем составляет около 200 мл. Для группы из 10 мышей, вычислить превышение 2 дозы мыши.
    6. Приготовьте шприцы для инъекций. Используйте шприцы 1 мл с иглами 25 G x 5/8.
  2. Подкожная инъекция SU5416
    1. Сдерживайте животное. Поместите мышь на крышку клетки, чтобы помочь сдержанности. Возьмитесь за кожу и сформив палатку параллельно позвоночнику. Убедитесь в том, чтобы схватиться за затылок плотно, чтобы избежать потенциальной травмы укуса мышью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие двух исследователей делает процедуру быстрее и точнее, как можно держать животное в то время как другой выполняет инъекцию.
    2. Вставьте иглу подкожно над флангом на свободной складке кожи. Убедитесь в том, чтобы вставить иглу параллельно коже. Избегайте проникновения брюшной стенки.
    3. Ввись содержимое шприца (100 МКЛ растворенного SU5416 или транспортного средства).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать утечки после полной доставки, держите шприц около 10 с и слегка поверните иглу под кожей.
    4. Свями иглу и верните животное в клетку. После инъекции SU5416 поместите клетки в вентилируемую гипоксию.
  3. Воздействие гипоксии
    1. Мониторинг вентиляции с течением времени. Убедитесь в том, чтобы поддерживать 10% кислорода. Поддержание нормоксии животных в полу-уплотняемой камере в на 21% O2.
    2. Убедитесь, что камеры оснащены датчиком кислорода для измерения уровня кислорода. Избегайте обширного открытия камер. Для очистки и добавления пищи и воды открыты камеры не более 20 минут каждые 3 дня.
    3. Осматривать животных ежедневно. Рассмотрим стресс сигналы, такие как пилоэрекция или значительная потеря веса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: животные под Гипоксия / SU5416, как ожидается, похудеть5. Это свидетельствует о развитии болезни.
    4. Повторите инъекцию SU5416 еженедельно в течение 3 недель подряд (см. рисунок 1A А для обзора экспериментального дизайна).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение места инъекции может помочь уменьшить раздражение кожи.

2. Функциональная характеристика путем инвазивных измерений давления Р.В.

  1. Подготовка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите режим анестезии. Можно использовать инъекционные или ингаляционные анестезии. Так как небольшая передозировка инъекционных анестезий (особенно от кетамина/ксилазина или пентобарбитала) может существенно повлиять на работу сердца, рекомендуется применение летучих анестетики. Очень важно использовать один и тот же анестетик для всех мышей в рамках исследования.
    1. Используйте испаритель, чтобы обеспечить точную дозу анестезии на животное. Доза для изофлюрана следующая: индукция 3-4%, техническое обслуживание 1% смешивается со 100% кислородом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты и избегайте дыхания пара.
    2. Подготовьте грелку и/или греющие лампы для поддержания температуры тела. Подготовь зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела.
    3. Обеспечь правильную вентиляцию. Подготовь аппарат искусственной вентиляции легких заранее. Подготовь разъем Y-трубки и проверьте функцию вентилятора с помощью ручного режима. Убедитесь, что водрянное давление составляет lt;1 см H2O, чтобы избежать баротравмы. Установите частоту дыхания на 110 вдохов в минуту.
    4. Подготовь эндотрахеаную трубку, разрезая внутрисосудистый катетер 20 Г.
    5. Подготовь необходимые инструменты: небольшие типсы, ножницы, эластичные втягиватели крючка, сосудный прижигатель и ватные тампоны. На ватный тампон настроить небольшой 25 G х 5/8 "игла, которая будет использоваться, чтобы сделать небольшой прокол в правом желудочков.
    6. Подготовьтесь к катетеру давления, блоку контроля громкости давления и инициируем программному обеспечению для сбора данных. Поместите PV катетер в 15 мл трубки заполнены PBS при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут и калибровать в соответствии с протоколом производителя.
    7. Для перфузии и фиксации органов, подготовить PBS и раствор 50% PBS / 50% OCT. Подготовка 2 х 10 мл шприцев (с иглой 25 G): один будет использоваться для perfusing сердца и легких с PBS на месте и второй для введения OCT / PBS (50/50) решение для легких образца, который будет использоваться для еготологического исследования.
  2. Интубации
    1. Взвесить мышь и записать состояние здоровья перед анестезией.
    2. Индуцировать анестезию с 3-4% изофлюраном. Проверьте глубину анестезии, проверяя рефлекс щипать ноги: щепотку ноги одной из конечностей твердо. Если животное выводит конечность, это признак недостаточной анестезии.
    3. После индукции анестезии побрить шею и область грудной клетки.
    4. Поместите мышь на грелку. Поместите зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры тела имеет важное значение для функциональных измерений. Температура тела должна быть примерно 36,5-37 градусов по Цельсию.
    5. С помощью изогнутых тибров прикрепляйте шовную нить к верхним резцами мыши, растягивайте и закрепите на грелке хирургической лентой. Защитите конечности мыши с помощью хирургических лент.
    6. Для интубирования животное делает небольшой разрез примерно на 1 см в медиальной коже шейки матки с помощью маленьких ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устная илюбовь является альтернативным методом, который требует большего опыта.
    7. С хлопчатобумажным аппликатором прямо отделить околоушные и подменные слюнные железы на среднем уровне. Это будет подвергать мышцы чрезмерно трахеи.
    8. Тщательно сократить эти мышцы подвергая трахеи.
    9. С помощью маленьких ножниц сделайте небольшой разрез между трахеевыми хрящами и вставьте подготовленную эндотрахеаную трубку. Вынул металлический направляющий выступ внутрисосудистого катетера.
    10. Подключите катетер к аппарату искусственной вентиляции легких. Проверить положение трахеи трубки вручную осторожно надув легких. Закрети положение лентой.
    11. Поддерживайте 1% изофлюрановую анестезию на протяжении всей процедуры.
    12. Регулярно следите за глубиной анестезии, проверяя рефлекс щепотки нося. Отрегулируйте анестезию соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая скорость сердечных сокращений во время экспериментов, под 1% изофлюран анестезии, составляет около 400 ударов / мин. Поддержание температуры тела и анестезии имеют важное значение для контроля сердечного ритма. Избыток изофлюрана может снизить сердечный ритм. Тем не менее, восстановление может быть достигнуто за счет снижения скорости изофлюрана.
  3. Измерения давления Р.В. (открытый подход к груди)
    1. С небольшими ножницами выполнить разрез кожи примерно на 1 см над процессом xiphoid и верхней части брюшной полости. Отделяйте кожу, покрывающую грудь и брюшную стенку верхних брюшной квадранты: начните с средней линии, дистальной к кифоиду и осторожно двигайтесь боково с обеих сторон. Используйте термокаутерию для контроля кровотечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы иметь доступ к грудной полости через брюшную стенку.
    2. Откройте брюшную полость и тщательно перережьте диафрагму, заботясь о том, чтобы не повредить бьющееся сердце или легкие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы разоблачить вершину и правый желудочек сердца. Хорошее воздействие и вид на сердце имеют решающее значение для правильного размещения катетера. Это имеет большое значение, чтобы избежать кровотечения на протяжении всей процедуры. Даже небольшие изменения внутривазового объема могут изменить нагрузку правого сердца и повлиять на записанные параметры.
    3. Аккуратно удалите перикард с помощью хлопчатобумажного аппликатора.
    4. Перед тем, как поместить катетер давления в сердце, принесите катетер рядом с мышью.
    5. Использование подготовленного хлопчатобумажного аппликатора с иглой наносит колото-резаную рану в апической дистальной части правого желудочка. Аккуратно снимите иглу и вставьте катетер давления в это отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно работать без применения силы. В случае, если это невозможно, попробуйте сделать новое отверстие рядом с первым, чтобы избежать длительной травмы сердца. Игла не должна быть вставлена более глубоко, чем примерно 3 мм.
    6. Вставьте катетер давления параллельно направлению правого желудочка, с кончиком, обращенный к легочной артерии.
    7. Следите за отслеживанием волны давления, чтобы обеспечить правильное позиционирование катетера. Отслеживание представителей продемонстрировано на рисунке 2.
    8. Позвольте сигналу давления стабилизироваться. Пауза дыхания и получить по крайней мере 3 измерения. В период между отдельными измерениями позволяют животному проветриваться.
    9. После того, как все измерения будут записаны удалить катетер и поместить его обратно в PBS заполнены трубки в водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента очистите катетер в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Эвтаназия и перфузия легких
    1. По завершении эксперимента усытворяют мышь путем exsanguination.
    2. Откройте грудь широко. Используя ножницы, разрежьте всю грудину и обратите внимание, чтобы не повредить сердце или легкие.
    3. Использование ножниц радужной оболочки делает небольшой разрез в левом желудочков, чтобы кровь покинуть камеру.
    4. Поместите 25 G иглы шприца, содержащего 10 мл PBS в правом желудочков и вводить раствор PBS, пока легкие не будут очищены от крови.
    5. После того, как этот шаг будет завершен, подтвердить эвтаназии жизненно важных тканей урожая (сердце и легкие): сократить кавы и аорты вложения и удалить сердце и легкие ан блок.

3. Морфометрическая характеристика

  1. Сразу после удаления сердца и легких (шаг 2.4.5), изолировать сердце и удалить оба атрии. С изогнутыми ножницами тенотомии тщательно рассекают правый желудочек (РВ) от левого желудочка (LV), оставляя перегородку (S) с левым желудочковым. Взвешивание Р.В. и LV-S и вычислить индекс Фултона Р.В. / ЛВЗ S (Рисунок 3)5,9.
  2. Возьмите часть правого желудочка и поместите его в OCT предварительно заполненные встраивания формы. Используйте другую часть правого желудочка для анализа РНК и/или белка. Заморозить в сухом льду и хранить при -80 градусов по Цельсию.
  3. Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы изолировать легкие от сердца и любой другой оставшейся ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки легких, перфузия, как описано выше (Шаги 2.4.3-2.4.5) имеет большое значение.
  4. Привязать заморозить часть легких и хранить его для РНК, извлечения белка или других анализов.
  5. Используйте другую часть легких для гистологического анализа. Для этого вставьте шприц, содержащий 50% PBS и 50% OCT в бронхеиспользуемой доли 10,11. Экспериментатор легко видит, что легкое раздувается, когда содержимое шприца проливается в ткани.
  6. Поместите эти кусочки легких в встраивание формы предварительно заполнены с OCT и оснастки заморозить их в сухой лед. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию после того, как они заморожены.
  7. Подготовьте 8 мкм секций Р.В. и легких с помощью криостата машины. Воздух сушит секции при комнатной температуре в течение 30 мин.
  8. Исправить слайды при комнатной температуре с помощью 10% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является известным канцерогеном человека. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь к листу данных о материальной безопасности (MSDS).
  9. Оценка сосудистой ремоделирования гематоксилин/эосин окрашивание
    Примечание: Выполните гематоксилин / Эозин окрашивания для того, чтобы оценить структурные изменения сердца и сосудистой ремоделирования в легких(рисунок 3).
    1. Пятно с раствором гематоксилина в течение 8 мин.
    2. Промыть проточной водопроводной водой в течение 5 минут, а затем быстро промыть в дистиллированной воде.
    3. Промыть в 95% EtOH в течение 1 мин и контр-пятно в растворе эозин в течение 1 мин.
    4. Обезвоживание (80% этанола 10-30 с, 100 этанола в течение 1 мин и 100% Толуол в течение 3 мин).
    5. Гора и крышка с крышкой. Высушите горки на ночь при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
  10. Оценка фиброза правого желудочка Пикросириусом Красным Окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Picrosirius Красное окрашивание, Picrosirius красный, который является кислотой, связывается с коллагеном12. Таким образом, это окрашивание может быть использовано для гистологического исследования содержания коллагена.
    1. Инкубировать горки в разогретом растворе Буина при 58 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    2. Вымойте горки в проточной водопроводной воде, чтобы удалить желтый цвет из секций в течение 10-15 мин.
    3. Пятно в 0,1% Быстрый зеленый в течение 20 мин при комнатной температуре.
    4. Промыть в 1% уксусной кислоты в течение 1 мин.
    5. Промыть в водопроводной воде в течение 5 минут.
    6. Пятно в 0,1% Сириус красный в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим обезвоживанием в Толуол.
      ВНИМАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания, могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
  11. Р. кардиомиоцитов гипертрофии оценки WGA Стейнинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гипертрофия правого желудочка (Р.В.) на клеточном уровне может быть оценена путем выполнения окрашивания зародыша пшеницы (WGA)(рисунок 4).
    1. Исправить слайды в холодном растворе ацетона в течение 15 минут, а затем 3 шага стирки в PBS (5 минут каждый).
    2. Блок с 10% козьей сыворотки в растворе Dako в течение 30 минут при комнатной температуре.
    3. Инкубировать слайды с WGA: Добавить WGA 1:200 и инкубировать в течение 1 1 / 2 ч при 37 градусов по Цельсию в темноте.
    4. Вымойте слайды три раза с PBS.
    5. Инкубировать слайды с нуклеиновой кислоты красителя.
    6. Вымойте слайды три раза с PBS.
    7. Для монтажа снимите избыток жидкости и нанесите монтажные средства и крышку. Высушите горки в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте и храните при температуре 4 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
  12. Выполните иммунохимию легких для дальнейшей и конкретной оценки сосудистой ремоделирования. Например, гладкое окрашивание мышечных клеток может быть использовано для оценки мускулализации сосудов, в то время как окрашивание фактора фон Виллебранда может быть использовано для визуализации эндотелиальных изменений. Эти методы описаны в другомместе 5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе мы подробно описываем создание модели Hypoxia/SU5416 для индуцирования PH у мышей. Кроме того, мы подробно все необходимые шаги для выполнения легочной сосудистой и сердечной оценки в конце периода наблюдения.

Обзор экспериментального дизайна этой модели показан на рисунке 1A13,14. Мыши подвергаются нормобатической гипоксии (10% O2) и подкожно вводят один раз в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как моделировать PH у мышей, сочетая два патологических стимула: хроническая гипоксия и инъекция SU5416 (Hypoxia/SU5416)18. В попытке соотнести эту модель мыши с состоянием PH человека, неизбежно следует взглянуть на текущую классификацию PH, показанную в таблице 1. PH почти во всех формах характеризуется легочной сосудосуживающих и аномальной пролиферации эндотелиальных и гладких мышечных клеток. Это приводит к повышенному давлению в легочных артериях и, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего декларировать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Американской ассоциации сердца (AHA- 17SDG33370112 и 18IPA34170258) и от Национальных институтов здравоохранения NIH K01 HL135474 Y.S. O.B была поддержана Deutsche Herzstiftung.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислота ледниковаяRoth3738.1
Ацетон, гистологическая степеньЛабораторное депоVT110D
ADVantage Система давления-объемаTransonicADV500
Решение БуинаSigmaHt10132
Система прижиганияFine Science Tools18000-00
Соединительные трубки и клапаны
ватными наконечникамиCovidien8884541300
Покровные стекла, 24 x 50 ммRoth1871
Сбор и анализ данныхEmkaiox2
Direct Red 80Sigma365548-5G
DMSO (диметилсульфоксид)Sigma Aldrich276855
Сухой лед
Щипцы Dumont # 5Fine Science Tools11251-10
Dumont # 7 Тонкие щипцыFine Science Tools11274-20
Встраиваемые формыSigma AldrichE-6032
Раствор эозина Водный растворSigma SigmaHT110216
этанол, лабораторный класс CarolinaBiological Supply Company861285
Fast Green FCFSigmaF7252-5G
Тонкие ножницыFine Science Tools14090-09
Сыворотка от козыinvitrogen16210-064
Грелка Гаймар T/Pump
Hematoxylin 2Thermo Scientific7231
Гипоксическая камераBiospherixA30274P
Индукционная камераDRE Veterinary12570
Интубационный катетер (внутривенно катетер SurFlash (20 G x 1") )Terumo SR*FF2025
Ножницы для радужной оболочкиглаза Fine Science Tools14084-08
ИзофлуранBaxterNDC-10019-360-40
Испаритель изофлуранаDRE Veterinary12432
Мыши (C57BL/6)Иглы Charles River
25 G x 5/8"BD305122
OCTTissue Tek4583
PBS (фосфатно-солевой буфер)Corning21-031-CV
Насыщенный раствор пировой кислоты 1,3 %SigmaP6744-1GA
Объемный катетердавления TransonicFTH-1212B-4018
РетракторKent ScientificSURGI-5001
Статический контроллер кислорода ProOx 360BiospherixP360
SU 5416Sigma AldrichS8442
Хирургический шовный материал, черный плетеный шелк, 5.0Surgical Specialties Corp. SP116
Лента хирургическая3M1527-1
Шприц 10 млBD303134
Шприцы с иглой 1 млBD309626
Sytox Green Nuclein Acid StainThermo ScientificS7020
Ножницы для тенотомииPricon60-521
ToluolRoth9558.3
Аппарат искусственной вентиляции легких CWESAR-830/P
WGA Alexa Fluor Thermo ScientificW11261
КсилолРота
Аппликаторы с

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
  2. Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
  3. Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
  4. Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
  5. Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
  6. Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
  7. Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
  8. Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
  9. Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184(2013).
  10. Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167(2018).
  11. Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
  12. Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
  13. Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
  14. Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
  15. van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
  16. Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448(2014).
  17. Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
  18. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
  19. Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
  20. Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
  21. Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
  22. Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942(2015).
  24. Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335(2016).
  25. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810(2016).
  26. Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Pulmonary HypertensionHypoxia SU5416 ModelRight Ventricle PressureVascular RemodelingCardiomyocyte HypertrophyFulton IndexWheat Germ AgglutininOpen Chest MethodHypoxic ChamberSU5416 Injection

Похожие статьи