Митохондриальное дыхание имеет решающее значение для выживания Организменное; Таким образом норма потребления кислорода является отличным показателем митохондриального здоровья. В этом протоколе мы описывают использование коммерчески доступных респирометра измерить базальную и максимальной кислорода расхода в жить, нетронутыми и свободно подвижные Caenorhabditis elegans.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оптимальные функции митохондрий имеет решающее значение для здорового клеточную активность, особенно в клетках, которые имеют высокие энергетические потребности как в нервной системы и мышц. В соответствии с этим, митохондриальной дисфункции был связан с множеством нейродегенеративных заболеваний и старения в целом. Caenorhabditis elegans были мощной модели системы для выяснения многих тонкостях митохондриальной функции. Митохондриальное дыхание является сильным показателем митохондриальной функции и недавно разработанных respirometers предлагают состояние искусства платформу для измерения дыхания в клетках. В этом протоколе мы предоставляем технику для анализа живой, нетронутыми C. elegans. Этот протокол охватывает период ~ 7 дней и включает в себя шаги для синхронизации C. elegans, (2) подготовка соединений для инъекций и гидратации зонды, уравновешивания загрузки и картридж (3) наркотиков, (4) подготовка анализа червя и выращивания (1) пластины и пробирного запуска и анализ данных (5) после эксперимента.
Введение
Аденозинтрифосфат (АТФ), основным источником клеточной энергии, производится в митохондриях ферментами в электрон-транспортной цепи (и т.д.), расположенный в внутренней митохондриальной мембраны. Пируват, метаболита ключа используется для митохондриального производства АТФ, импортируется в митохондриальной матрицы, где это декарбоксилировали производить ацетил коэнзима A (CoA). Впоследствии ацетил CoA вводит цикл лимонной кислоты, в результате чего образуются Никотинамидадениндинуклеотид (NADH), ключевых электронов молекулы перевозчик. Поскольку электроны от NADH передаются кислорода через и т.д., протонов накапливаться в митохондриальной межмембранное пространства, ч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: На рисунке 2 обеспечивает Схематический обзор полного протокола.
1. рост и синхронизации нематоды населения9,10
- Переноса личинок L4 желаемого генетических особенностей (например, N2 [дикого типа] и sel-12 животных) на нематод роста СМИ (НГМ) плиты (см. таблицу 1 рецепт) свеже семенами с газоном Escherichia coli (ОР50)11. Используйте по крайней мере два 100 мм или три пластины 60 мм для каждого штамма. Инкубируйте червей на соответствующий рост температуры (между 15-25 ° C), для 3-4 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью протокола описаного, OCR дикого типа животных и три различных sel-12 мутантных штаммов были определены. SEL-12 кодирует ortholog C. elegans Пресенилин17. Мутации в человека Пресенилин являются наиболее распространенным генетическим аберрации, связанные с развитием семейная болезнь Альцгеймера18. Наши исследования показали уровень повышенной митохондриальной кальция в sel-12 мутанта животных, по с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Митохондриальное дыхание является показателем глубокий митохондриальной функции; Поэтому будучи в состоянии измерить уровень потребления кислорода в биологической системе, будь то в лабораторных условиях или в естественных условиях весьма ценным. Respirometers смысле кислорода с помощью на основе порфирина светомассами, которые получают закаленном кислорода или через растворенного в воде кислорода датчики, которые полагаются на поколения электрического текущего пропорциональна давления кислорода. Кларк электрода попадает.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы хотели бы признать за его руководство в создании Seahorse XFp в лаборатории д-р Кевин Bittman. Национальные институты здравоохранения грант, что GM088213 поддерживает эту работу.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашки Петри 100 мм, 60 мм | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1,5 мл центрифужные пробирки | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 мл конические пробирки | Corning | 430791 | |
| 22 &22 мм покровное стекло | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 мл конические пробирки | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto пептон | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto триптон | BD, Bacto | 211705 | |
| дрожжей Bacto | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic Кальция | ||
| хлорид дигидрат (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Холестерин | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Деионизированная вода (dH2O) | |||
| Диметилсульфоксид (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Стеклянные пастеровские пипетки | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Магния сульфат гептагидрат (MgSO4· 7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Фосфат калия двухосновной (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Моноосновной фосфат калия (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Гидроксид натрия (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Фосфат двухосновной безводный (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Анализатор Seahorse XFp | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent 103022-100 | ||
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S2002 |
Ссылки
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
