Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изоляция, распространения и прионных белков во время нейрональных дифференцировки стволовых клеток человека пульпы зуба

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59282

⸱

18 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для человека зубной пульпы стволовые клетки изоляции и распространения для того, чтобы оценить прионных белков процессе нейрональных дифференциации.

Аннотация

Биоэтические вопросы, связанные с манипуляции эмбриональных стволовых клеток затрудняли прогресс в области медицинских исследований. По этой причине очень важно для получения стволовых клеток из различных тканей, таких как жировая, пуповины, костного мозга и крови. Среди возможных источников пульпы зуба, особенно интересно, потому что это легко получить отношении биоэтических соображений. Действительно зубной пульпы стволовых клеток (hDPSCs) представляют собой тип взрослых стволовых клеток, способный к различать в нейрональных подобных клеток и могут быть получены из третьего моляра здоровых пациентов (13-19 лет). В частности пульпы зуба была удалена с помощью экскаватора, разрезать на мелкие кусочки, относились с коллагеназы IV и культивировали в колбу. Чтобы побудить нейрональных дифференциации, hDPSCs были стимулируется с EGF/bFGF за 2 недели. Ранее мы показали, что во время процесса дифференцировки содержание сотовой прионных белков (ОТРC) в hDPSCs увеличено. Cytofluorimetric анализ показал выражение ранних ОТРC , усилилось после нейрональных дифференциации процесса. Абляция ОТРC помощью siRNA PrP помешали нейрональных дифференциации, вызванных EGF/bFGF. В этой статье мы показываем, что как мы усиленной изоляции, разделения и в пробирке методы культивирования hDPSCs с несколько легко процедур, более эффективным клеток клоны были получены и крупномасштабного расширения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) было отмечено. Мы также показывают, как hDPSCs, полученных с помощью методов, подробно изложены в протоколе, являются отличным экспериментальной модели для изучения процесса нейрональных дифференциация MSCs и последующие процессы на клеточном и молекулярном.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки были изолированы от нескольких тканей, включая костный мозг, пуповинная кровь, человека пульпы зуба, жировой ткани и крови1,2,3,4,5 , 6. Как сообщили несколько авторов, hDPSCs Показать пластиковые присоединения, типичный фибробластоподобных морфологии. Они представляют собой весьма разнородных населения с различных клонов и различия в пролиферативных и отличительные способности7,,8. hDPSCs Экспресс определенных маркеров для мезенхимальных стволовых клеток (то есть, CD44, CD90, CD73, CD105, УВСР-1), они являются негативными для некоторых гемопоэтических маркеров (например CD14 и CD19) и способны в пробирке мультилинейного дифференциация9, 10,11.

Некоторые авторы показали, что эти клетки способны дифференцироваться в нейроноподобных клеток с использованием различных протоколов, которые включают добавление ФРН, bFGF, EGF в сочетании с конкретных средств массовой информации и дополнения7,12. Кроме того многие белки участвуют в процессе дифференциации нейронов, и среди них несколько документов Показать соответствующую роль и значительное проявление сотовой прионных белков (PrPC), оба в эмбриональных и взрослых стволовых клеток13, 14. PrPC представляет плейотропный молекулы, способные выполнять различные функции внутри клетки как медный метаболизм, апоптоз, и сопротивление Оксидативный стресс15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

В наших предыдущих бумаги23мы исследовали роль ОТРC в процессе hDPSCs нейронов дифференциации. В самом деле hDPSCs express благосклонностью PrPC и, после нейрональных дифференциации, было можно наблюдать увеличение дополнительных. Другие авторы предположили возможной роли ОТРC в процессах нейрональных дифференцировки стволовых клеток. Действительно ОТРC диски дифференциация человеческих эмбриональных стволовых клеток в нейронах, олигодендроциты и астроциты24. Целью данного исследования было подчеркнуть методологии для получения стволовых клеток из пульпы зуба, его процесс дифференциации и роль ОТРC во время нейрональных дифференциации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Третьи моляры, используемые в исследовании были иссечена от больных (13-19 лет) без предварительного история наркотиков или алкоголя, все номера для некурящих и с соответствующей гигиены полости рта. В день объяснение, на Департамент науки стоматологии и челюстно-лицевой, университета «Сапиенца» Рима осознанного согласия был получен от пациентов или родителей. Информированное согласие было получено на основе этических соображений и одобрения Комитета по этике.

1. зуб и пульпы зуба добычи

  1. Подготовка соответствующего носителя для сохранения или транспорт.
    1. Подготовьте Дульбекко изменение Eagle средних низкой концентрации глюкозы (DMEM-L) с L-глютамин (494.5 мл).
    2. Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%) и 0,5 мл амфотерицин (0,1%).
  2. Извлечения третьего моляра от пациента, быстро промойте его с PBS, положить в 15 мл пробирку со средой и перенести его в лабораторию в менее чем 2 ч.
  3. Под капотом биологической откройте зуб с резцом, корональных резки проходят параллельно и касательной через крышу пульпарной камеры.
  4. Аккуратно удалите мякоть с небольшой экскаватор и поместите его в пробирку.
  5. Вымойте с PBS три раза и центрифуги на 2500 x g 10 мин на RT.

2. обработка пульпы зуба и выпуск стволовых клеток

  1. Удалить супернатант, Ресуспензируйте гранул в растворе Хэнка и поместите его в чашку Петри. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C в 5% CO2.
  2. Тип IV коллагеназы раствора препарата.
    1. Подготовить 0,8 мл DMEM-L.
    2. Расплавьте 1 мг типа IV коллагеназы в 0,8 мл DMEM-L и вихревые за несколько минут.
    3. Добавить DMEM-L до 1 мл иметь окончательный концентрации 1 мг/мл.
    4. Фильтр решение с 0,22 мкм фильтром.
  3. Удалить решение Хэнка центрифугированием в 2500 x g 10 мин на RT и разделить пульпы на мелкие кусочки около 1 мм каждый из которых скальпель одноразовый.
  4. Поместите кусочки мякоти в чашку Петри и проинкубируйте с 1 мл раствора типа IV коллагеназы 15 минут при 37 ° C в 5% CO2.
  5. Подготовка среднего культуры (500 мл).
    1. До 445 мл DMEM-л с L-глютамина.
    2. Добавьте 50 мл плода бычьим сывороточным (ФБС) (10%).
    3. Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%).
  6. Центрифугуйте образцы на 2500 x g 10 мин на RT, удалить супернатант, Ресуспензируйте гранулы в среде (шаг 2.5) и культуры в T25 колбу для стволовых клеток при 37 ° C в 5% CO2.

3. стволовых клеток культуры и распространения

  1. Каждый день проверить культуры и после 3 дней роста, наблюдать различные клоны адэрентных клеток внутри колбы.
  2. Каждые 3 дня изменить питательной среды.
  3. От 7 до 12 дней после того как адэрентных клеток достичь слияния, отсоедините их лечение клетки с 1 мл раствора трипсина ЭДТА на 3 мин при 37 ° C или аккуратно с помощью скребка ячейки.
  4. Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина.
  5. Центрифуга суспензию клеток для 6 мин на 259 x g, удалить супернатант и место клетки в колбе T25 для распространения.
    Примечание: Каждые 3 дня клетки достичь слияния.
  6. Распространять клетки до 21 или 28 дней (примерно 6-8 ходов) чтобы избежать присутствия не стволовых как клетки в культуре.
  7. Отсоедините клетки с 1 мл трипсина-ЭДТА за 3 мин при 37 ° C или мягко очищая. Центрифуга суспензию клеток для 6 мин на 259 x g.
  8. Удалить супернатант и испытание клеток для cytofluorimetric анализа (шаг 6).

4. Переходное PrPC глушителя на малых интерферирующих РНК

  1. Культура hDPSCsin 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2,5) за 24 ч.
  2. На следующий день после, подготовить siRNA PrP среднего (400 мкл).
    1. В стерильные пробирки, 384 мкл DMEM-L.
    2. 1 мкл метки для каждого типа siRNA PrP DMEM-l иметь окончательный концентрации 5 Нм (4 siRNA ОТР были использованы и проверены поставщиком гарантировать нокдаун эффективность ≥70%).
    3. 12 мкл transfectionreagent в среде DMEM-L.
    4. Вихревой смеси и проинкубируйте втечение 10 мин на RT, чтобы позволить образование комплексов transfection.
  3. Добавить 400 мкл siRNA PrP среднего для каждой выборки и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° C.
  4. Без отбрасывания малых интерферирующих РНК PrP среднего, добавьте 1,6 мл (отношение от 1 до 5) питательной среды (шаг 2.5).
  5. Оставьте клетки для 72 ч при 37 ° C.
  6. Удалить супернатант и мыть 3 раза с 2 мл PBS на RT.
  7. Добавьте 2 мл нейрональных питательной среды на 7 или 14 дней (шаг 5.1).
  8. Изменение нейрональных питательной среды каждые 3 дня.
    Примечание: Замените siRNA PrP решение заменить каждый раз нейрональных питательной среды.
  9. В конце времени мыть 3 раза с 2 мл PBS в RT и испытания для нейронов поверхностных антигенов на западной помарке анализа.

5. нейронной индукции процесс hDPSCs

  1. Подготовка нейрональных питательной среды (500 мл).
    1. Подготовьте 444.7 мл базальной СМИ, сформулированы в нейрональных клеток.
    2. Средний добавьте 50 мл сыворотки бесплатные дополнения, используемые для поддержки долгосрочной жизнеспособности эмбрионов и взрослых нейрональных стволовых клеток (10%).
    3. Добавьте 200 мкл из основной фактор роста фибробластов (bFGF) (конечная концентрация 40 нг/мл) и 100 мкл эпидермального фактора роста (EGF) средний (конечная концентрация 20 нг/мл).
    4. Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (1%) в среду.
  2. Культура hDPSCs в 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) до 28 дней от разделения пульпы и стимулировать их с 2 мл нейрональных питательной среды.
  3. Каждые 3 дней отбросить супернатанта, мыть 3 раза с 2 мл PBS на RT и заменить 2 мл нейрональных питательной среды.
  4. После 7 или 14 дней отсоедините клетки с 1 мл раствора трипсина ЭДТА на 3 мин при 37 ° C или аккуратно скребком.
  5. Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина.
  6. Проверить наличие нейрональных поверхностных антигенов (шаг 6) или прионных белков (шаг 7), анализ цитометрия потоков.

6. характеристика hDPSCs, поток цитометрии

  1. Выберите мезенхимальных стромальных (MSC)-конкретных или нейронов поверхностных антигенов.
  2. Культура hDPSCs в 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2.5).
  3. Отсоединение hDPSCs в 28 дней от разделения пульпы зуба или после 14 дней нейрональных питательной среды (шаг 5.1) с 1 мл раствора трипсина ЭДТА за 3 мин при 37 ° C или слегка скребок.
  4. Добавьте 4 мл (соотношение 1:5) из питательной среды (шаг 2,5) прекратить действие трипсина и центрифугировать на 259 x g 6 мин на RT. мыть еще 2 раза с 2 мл PBS на RT.
  5. Исправить hDPSCs необработанных или обработанных с параформальдегида 4% в PBS 10 мин при 4 ° C.
  6. Разрушения hDPSCS с 0,1% (v/v) неионных ПАВ в PBS для дополнительных 10 мин на RT.
  7. Выполнять блокирование с 5% обезжиренное сухое молоко в 1 мл PBS для 1 h на RT.
  8. Вымойте 3 раза с 1 мл раствора PBS и инкубировать клетки с анти CD105 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD44 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD90 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти CD73 (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клетки), анти β3-тубулина (масштаба 1: 100 / 5 x 105 клеток), анти NFH (1: 100 / 5 x 105 клеток) и анти GAP43 (1: 100 / 5 x 105 клеток) МАБ 1 h на RT.
  9. Вымыть клетки 3 раза с 1 мл раствора PBS и проинкубируйте с анти мыши PE (1:50 / 5 x 105 клеток) или анти кролик CY5 МАБ (1:50 / 5 x 105 клеток) для дополнительного 1 ч на RT.
  10. Используйте вторичные антитела для стробирования immunopositive клетки (анти мыши PE или анти кролик CY5 МАБ) и анализировать все образцы с проточный цитометр и приобрести по крайней мере 20 000 событий.

7. Оценка выражения ОТРC в hDPSCs, поток Cytometry анализ

  1. Культура hDPSCsin 6-ну пластины (2 x 105 клеток/мл) с 2 мл питательной среды (шаг 2.5).
  2. Отсоединение hDPSCs на 21 и 28 дней от пульпы зуба разделения и после 7 или 14 дней с нейронов питательной среды (шаг 5.1) с 1 мл раствора трипсина ЭДТА и остановить действие трипсина, как описано в пункте 6.4. Исправить образцы с параформальдегида 4% в PBS 10 мин при 4 ° C.
  3. Разрушения с 0,1% (v/v) неионных surfactantin PBS 10 мин на RT. удалить супернатант и запятнать клетки с кролик анти PrP МАБ EP1802Y (1:50 / 5 x 105 клеток) МАБ 1 h на RT. инкубировать с анти кролик CY5 (1:50 / 5 x 105 клеток) МАБ для Дополнительные 1 ч на RT.
  4. Анализировать все образцы с проточный цитометр и приобрести по крайней мере 20 000 событий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изоляции и разделение процедуры hDPSCs из пульпы зуба, полученные из третьего моляра, являются сложные процессы, в которых небольшие изменения могут вести губительный результат. В этой статье мы используем протокол Артур et al. 12 с несколькими улучшениями. Представитель схема процедур показана на рисунке 1.

hDPSCs представляет собой разнородные популяция клеток с ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой работе мы сосредоточились на методологии для изоляции и нейрональных дифференцировки hDPSCs; Кроме того мы оценивали роль ОТРC в этот процесс. Существует несколько способов изолировать и дифференцировать hDPSCs в нейроноподобных клеток и критические шаги во время процесса. hDPSCs возможность дифференцировать в несколько линий, таких как chondroblasts, адипоциты, остеобластов и нейронов. В нашей работе мы исследовали механизмы нейрональных дифференциации и присутствие ОТРC. Как указывалось выш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана «Fondazione Варроне» и Риети университета хаб «Sabina Universitas» для Vincenzo Mattei.

Рисунок 5 (A, B) перепечатана с разрешения издателя Тейлор & Фрэнсис Ltd от: роль китовая птичка белка EGFR мультимолекулярных комплекс в нейрональных дифференциация зубной пульпы производные стволовых клеток человека. V. Martellucci, S., Manganelli, Santacroce C., Santilli ф, Piccoli л, м. Sorice, Mattei V. китовая птичка. 4 марта 2018. Тейлор и Фрэнсис Ltd.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор амфотерицина BSigma-AldrichA2942Используется для дополнения клеточных культуральных сред, это полиеновый противогрибковый антибиотик от Streptomyce
Anti-B3tubulinCell Signaling Technology #4466Один из шести изоформ В-тубулина, он высоко экспрессируется во время внутриутробного и постнатального развития, оставаясь высоким в периферической нервной системе
Anti-CD105 BD Biosciences611314Эндоглин (CD105), основной гликопротеин эндотелия сосудов человека, представляет собой интегральный мембранный белок I типа с большой внеклеточной областью, гидрофобной трансмембранной областью и коротким цитоплазматическим хвостом
Anti-CD44MilliporeCBL154-20ulPositive cell markers антитела, направленные против мезенхимальных стволовых клеток
Anti-CD73 Технология клеточной сигнализации 13160CD73 представляет собой гликозилфосфатидилинозитол-якорный, мембранный гликопротеин с массой 70 кДа, который катализирует гидролиз внеклеточных нуклеозидмонофосфатов в биоактивные нуклеозиды
Anti-CD90MilliporeCBL415-20ulПоложительные клеточные маркеры антитела, направленные против мезенхимальных стволовых клеток
Anti-GAP43 Технология клеточной сигнализации #8945Специфичный для нервной системы, ассоциированный с ростом белок в конусах роста и областях высокой пластичности
Anti-mouse PE Abcamab7003- это антитело, используемое в проточной цитометрии или анализе FACS
Anti-NFH Технология клеточной сигнализации #2836Антитело, которое обнаруживает эндогенные уровни общего белка Neurofilament-H
Anti-PrP mAb EP1802Y Abcamab52604Кролик моноклональный [EP 1802Y] к прионному белку PrP
Anti-rabbit CY5 Abcamab6564- это антитело, используемое в проточной цитометрии или анализе FACS
Anti-STRO 1MilliporeMAB4315-20ulPositive cell markers антитела, направленные против мезенхимальных стволовых клеток
B27 Supp XF CTSGibco by life technologiesA14867-01B-27  может быть использовано для поддержки индукции нейрональных стволовых клеток человека (hNSCs) из плюрипотентных стволовых клеток (PSCs), расширения hNSCs, дифференцировка гНСК и поддержание зрелых дифференцированных нейронов в культуре
проточного цитометра BD Accuri C6 BD BiosciencesAC6531180187Проточный цитометр оснащен синим лазером (488 нм) и красным лазером (640 нм)
BD Accuri C6 Software BD BiosciencesУправляет системой проточных цитометров BD Accuri C6 с целью сбора данных, создания статистики и анализа результатов
bFGFPeproThec, DBA100-18BBasic Fibroblast Growth Factor 
Центрифуга CL30RTermo fisher Scientific11210908это устройство, которое используется для разделения жидкостей, газов или жидкостей, на основе плотности
CO2 инкубатор 3541Termo fisher Scientific317527-185это обеспечивает оптимальные и воспроизводимые условия роста для клеточных культур
коллагеназы, типа IV Life Technologies17104019Коллагеназа – это протеаза, которая расщепляет связь между нейтральной аминокислотой (Х) и глицином в последовательности Pro-X-Glyc-Pro, которая с высокой частотой встречается в коллагене
Одноразовый скальпель.Swann-Morton501Используется для разрезания тканей
DMEM-LEurocloneECM0060LDulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose с L-глутамином с пируватом натрия
EGFPeproThec, DBAAF-100-15Эпидермальный фактор роста 
Фетальная бычья сывороткаGibco от life technologies10270-106FBS является популярной медиадобавкой, поскольку она обеспечивает широкий спектр функций в клеточной культуре. FBS доставляет питательные вещества, факторы роста и прикрепления и защищает клетки от окислительного повреждения и апоптоза с помощью механизмов, которые трудно воспроизвести в системах бессывороточных сред (SFM)
Filtropur BT50 0,2,500 мл Бутылочный фильтрSarstedt831,823,101это устройство, которое используется для фильтрации растворов
Flexitube GeneSolution для PRNPQiagenGS56214 миРНК для гена Entrez 5621. Целевая последовательность N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Решение Хэнка 1xGibco by life technologies240200083Основная функция Hanks′ Сбалансированный раствор соли предназначен для поддержания pH, а также осмотического баланса. Он также обеспечивает клетки водой и незаменимыми неорганическими ионами
HiPerFect Transfection Reagent Реагент Qiagen301705HiPerFect Transfect представляет собой уникальную смесь катионных и нейтральных липидов, которая обеспечивает эффективное поглощение миРНК и эффективное высвобождение миРНК внутри клеток, что приводит к высокому нокдауну генов даже при использовании низких концентраций миРНК
Нейробазальный A Gibco by life technologies10888022Neurobasal-A Medium – базальная среда, предназначенная для долгосрочного поддержания и созревания чистых постнатальных и взрослых нейронов головного мозга.
ПараформальдегидSigma-Aldrich30525-89-4Параформальдегид был использован для фиксации клеток и участков тканей во время процедур окрашивания
пенициллином/стрептомицином ЕвроклонECB3001D Он используется в качестве дополнения к питательным средам для клеточных культур для контроля бактериального загрязнения
Фосфатно-солевой буфер  (ПБС)ЕвроклонECB4004LX10 PBS — это сбалансированный солевой раствор, используемый для обработки и культивирования клеток млекопитающих. PBS используется для орошения, промывки и разбавления клеток млекопитающих. Фосфатная буферизация поддерживает pH в физиологическом диапазоне
TC-Platte 6 well, Cell+,FSarstedt833,920,300Это поверхность роста для адгезивных клеток
Колба для культуры тканей T-25,Cell+,Vented CapSarstedt833,910,302Колба для культуры тканей T-25, полистирол, Поверхность роста Cell+ для чувствительных адгезивных клеток, например, первичных клеток, скошенная шейка, вентиляционный колпачок, желтый, стерильный, без пирогенов, нецитотоксический, 10 шт./мешок
Triton X-100 Sigma-Aldrich9002-93-1Широко используемое неионогенное поверхностно-активное вещество для восстановления компонентов мембраны в легких неденатурирующих условиях
Трипсин-ЭДТА ЕвроклонECB3052D Трипсин расщепляет пептиды на С-концевой стороне остатков аминокислот лизина и аргинина. Трипсин используется для удаления адгезивных клеток с поверхности культуры
ПробиркаSarstedt62,554,502Пробирка 15 мл, 120 мм x17 мм, PP
VBH 36 C2 CompactSterilST-003009000Обеспечивает полную защиту окружающей среды и работника
ZEISS Axio Vert.A1 – Инвертированный  МикроскопZeiss3849000962ZEISS Axio Vert.A1 предлагает уникальную цену начального уровня и может обеспечить все методы контрастирования, включая светлое поле, фазовый контраст, PlasDIC, VAREL, улучшенный модуляционный контраст Хоффмана (iHMC), DIC и флуоресценцию. Встроенная светодиодная подсветка для мягкой визуализации флуоресцентно меченых клеток. Axio Vert.A1 имеет эргономичный дизайн для рутинной работы и достаточно компактен, чтобы помещаться внутри вытяжек для культуры тканей.

Ссылки

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34(2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571(2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Обработка коллагеназой IVанализ методом проточной цитометриивестерн-блот-анализотсоединение с помощью трипсина-ЭДТАстимуляция EGF и bFGFсайленсинг PrP с помощью siRNAкультивирование клеток
Изоляция, распространения и прионных белков во время нейрональных дифференцировки стволовых клеток человека пульпы зуба
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.