В этой рукописи мы создали метод высокую пропускную способность для количественного определения активности щелочной фосфатазы в S. aureus биопленки культуры от 96-луночных культуры ткани пластины
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Колориметрического анализа щелочной фосфатазы деятельность S. aureus биопленки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Щелочная фосфатаза (ALP) является общим фермент выразил в клетках прокариот и эукариот. Он катализирует гидролиз фосфат monoesters от многих молекул базовых pH и играет незаменимую роль в метаболизме фосфат. В организме человека эукариотических ALP является одним из наиболее часто используемых ферментативные сигналов в диагностики различных заболеваний, таких как холестаза и рахита. В S. золотистого стафилококка, ALP обнаруживается исключительно на клеточной мембраны; также выражается как секреторной формы также. Тем не менее мало что известно о ее функции в биопленки.
Цель этой рукописи заключается в разработке быстрого и надежного анализа для измерения активности ALP биопленки S. aureus , которые не требуют изоляции белка. С помощью p нитрофенил фосфат (pNPP) как субстрат, мы измерили ALP деятельность биопленки S. aureus , образованная в 96-луночных тканевой культуры пластин. Деятельность была основана на образовании продукта растворимых реакции, измеряется 405 нм поглощения. Высокая пропускная способность характер метода 96 хорошо культуры ткани пластины обеспечивает чувствительных и воспроизводимый метод для анализов деятельности ALP. То же экспериментальная Настройка также может распространяться для измерения других внеклеточного молекулярных маркеров, связанных с биопленки.
Введение
Щелочная фосфатаза (ALP) повсеместно выражается в обеих клеток прокариот и эукариот1. Он может катализировать гидролиз монофосфат от различных молекул, таких как нуклеотидов, белки, алкалоиды, фосфатные эфиры и ангидриды фосфорной кислоты. В организме человека эукариотических ALP присутствует во многих тканях, в том числе печень, кости,2кишечника и плаценты. Она играет важную роль в фосфорилирование белков, рост клеток, апоптоз, стволовых клеток процессов, а также обычных скелетной минерализации. Эукариотические ALP также является показателем ключевых сыворотки на наличие заболеваний костей, печени и других тканей/органо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Средний подготовка
- Подготовка 1 Л Tryptic соевый бульон (БСЭ): В 1 Л дистиллированной воды, добавить 15 g поджелудочной железы дайджест казеина, 5 g papaic дайджест соевого жмыха, 3 g хлорида натрия, 2,5 г декстрозы и 2,5 г калия фосфата. Стерилизуйте перед использованием.
- Для Tryptic соевый агар (TSA), добавить 1 Л TSB, 15 г агара автоклава. Затем дайте ему остыть до комнатной температуры. Затем налейте в соотношении 20 мл на Петри блюдо (100 x 15 мм).
- Биопленки питательной среды: добавить 10 г глюкозы в 1 Л газобетона TSB. Стерилизуют фильтрацией, с помощью фильтра 0,2 мкм.
2. S. aureus биопле....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 1 показывает представитель результат деятельности ALP от биопленки культур S. aureus в 96 хорошо культуры ткани пластины. 75 мкл раствора коммерчески доступных pNPP был добавлен в каждый хорошо и инкубируют при комнатной температуре. После инкубации для разных времен (0 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 60 мин и 75 мин, соответственно) 75 мкл 5 M NaOH был добавлен для остановки реакции. Продукт затем измеряется в 96 хорошо пластины читателя на 405.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В нашем assay мы использовали pNPP как ALP субстрата. Это рабочее решение предназначенных для ELISA и неразбавленный необходим. После гидролиза, ALP, желтый продукт развивается и может быть измерена в 405 нм. В конце ферментативные реакции мы кратко центрифугировали 96 хорошо пластины и переданы свежие 96 хорошо пластины для измерения оптической плотности, используя читателя пластины супернатант. Мы обнаружили, что этот дополнительный центрифугирования шаг очень важен, так как это увеличивает согласованность поглощения н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим Уильям Рэйни Харпер колледж и Университет Иллинойса в Чикаго для объекта для проведения этих экспериментов. Мы также благодарим фонд McGraw Хилл за их щедрую поддержку.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Агар | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge Thomas | Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH гранулы | VWR | SS0550-500GR | |
| Пара-нитрофенилфосфат (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Типичные концентрации жидких субстратов pNPP, часто используемых в иммуноферментных анализах (ИФА), варьируются от 10 до 50 мМ. Как и в случае с большинством готовых к использованию жидких субстратов pNPP, подобных использованному здесь, точная концентрация pNPP не раскрывается из-за его запатентованной природы. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4 | Sigma | P3288-1VL | |
| Считыватель пластин | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Триптический соевый агар 15 г/л TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Триптический соевый бульон: g/L Панкреатический перевар казеина............ 15,0<руб/> Папаиновый дайджест соевого шрота......... 5,00<бр/> Хлорид натрия.............................. 3.00 Декстроза........................................ 2,50 дикалийфосфата.................. 2.50 | VWR | 90006-098 | |
| 96 луночные планшеты для культивирования тканей | BD | 6902D09 | U-образное дно |
Ссылки
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian Journal of Clinical Biochemistry. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
