Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59297

⸱

18 апреля 2019 г.

 , 
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

В этой статье

Краткое содержание

Мы предлагаем протокол, который показывает, как для дифференциации кератиноцитов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и фибробластов и создания 3D кожи органоид, используя эти кератиноцитов и фибробластов. Этот протокол содержит дополнительный шаг генерации модели гуманизированные мышей. Техника, представленная здесь будет улучшить дерматологические исследования.

Аннотация

Кожа является крупнейшим органом органа и имеет множество функций. Кожа действует как физический барьер и защитник тела и регулирует функции организма. Биомиметики это имитация моделей, систем и элементов природы с целью решения сложных проблем человека1. Биомиметики кожи является полезным инструментом для исследований в пробирке болезней и в естественных условиях восстановительной медицины. Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеют характеристику неограниченного распространения и способность дифференциации три зародышевых. Человеческого iPSCs генерируются из различных начальных клеток, таких как клетки крови, кератиноциты, фибробласты и многое другое. Среди них мононуклеарных клеток пуповинной крови (CBMCs) появились как источник альтернативной ячейки с точки зрения аллогенной регенеративной медицины. CBMCs являются полезными в регенеративной медицине, потому что человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) ввод имеет важное значение для ячейки, банковской системы. Мы предоставляем метод дифференциации СВМС iPSCs в кератиноцитов и фибробластов и для поколения органоид 3D кожи. СВМС iPSC производные кератиноцитов и фибробласты имеют характеристики похож на главной ячейки строки. Organoids 3D кожи генерируются путем наложения эпидермального слоя на слой дермы. По пересадке этой 3D кожи органоид, формируется модель гуманизированные мышей. Это исследование показывает, что органоид 3D человеческого iPSC производные кожи может быть роман, альтернативные инструментом дерматологических исследований в vitro и in vivo.

Введение

Кожа покрывает внешней поверхности тела и защищает внутренние органы. Кожа имеет различные функции, в том числе защиты от патогенов, поглощая и хранения воды, регулирование температуры тела и выделяют тела отходов2. Пересадке кожи могут быть классифицированы в зависимости от источника кожи; графтов, использование кожи от другого донора называются аллотрансплантантов, и трансплантатов, используя кожи пациента являются аутотрансплантантов. Хотя аутотрансплантатом является предпочтительным лечения из-за его низкой неприятие риска, биопсия кожи, трудно выполнить на пациентов с серьезными повреждениями или недостаточное количество клеток кожи. У больных с ожогами в три раза количество клеток кожи необходимы для покрытия больших территорий. В ситуациях, когда необходима трансплантация аллогенных приводит ограниченное количество клеток кожи от тела пациента. Аллотрансплантата используется временно, до аутологичной трансплантации может быть выполнена, поскольку обычно оно отклоняется иммунной системой хозяина, после примерно 1 неделю3. Чтобы преодолеть неприятие иммунной системой пациента, графтов должна исходить от источника с тем же идентификатором иммунитета пациента4.

Человеческого iPSCs являются источником новых клеток для клеточной терапии5. Человеческого iPSCs генерируются из соматических клеток, используя перепрограммирования факторов, таких как OCT4, SOX2, Klf4 и c-Myc6. С помощью человеческого iPSCs преодолевает этические и иммунологические аспекты эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)7,8. Человеческого iPSCs имеют плюрипотентности и могут дифференцироваться в три зародышевых9. Наличие HLA, решающим фактором в регенеративной медицине, определяет иммунный ответ и возможность отказа10. Использование пациента производные iPSCs решает проблемы отказа ограничения и иммунной системы клетки источник. CBMCs также стали источником альтернативной ячейки для регенеративной медицины11. Обязательное HLA набрав, которая происходит во время СВМС банковской, легко может использоваться для исследования и трансплантации. Кроме того, гомозиготных HLA-типа iPSCs может широко применяют для различных пациентов12. СВМС iPSC банк — Роман и эффективную стратегию для клеточной терапии и аллогенных регенеративной медицины12,,1314. В этом исследовании мы используем СВМС iPSCs, дифференцированные в кератиноцитов и фибробластов и генерировать слои стратифицированной 3D кожи. Результаты этого исследования свидетельствуют о СВМС iPSC производные 3D кожи органоид Роман инструмент для в vitro и in vivo дерматологические исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с участием животных были выполнены в соответствии с Закон о социальном обеспечении лабораторных животных, руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и руководящие принципы и политику для грызунов экспериментов институциональный уход животных и Используйте Комитет (IACUC) школы медицины в Католическом университете Кореи. Протокол исследования был одобрен Советом по рассмотрению институциональных католический университет Кореи (CUMC-2018-0191-01). IACUC и Отдел лабораторных животных (ДЬОЛА) в католический университет Кореи, Songeui Кампус аккредитованных Кореи Excellence животных Лаборатория Кореи продовольствия и медикаментов в 2017 и приобретенных ассоциации оценки и Аккредитация международных полную аккредитацию лабораторных животных международного (AAALAC) в 2018 году.

1. кожа дифференцировки клеток от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

  1. Средний подготовка
    Примечание: Сохранить все среды при температуре 4 ° C в темноте на срок до 3 месяцев. Фильтр все среды, используя систему фильтров Полиэфирсульфон 0,22 мкм перед использованием для стерилизации. Все среды была доступна в общем объеме 500 мл.
    1. Подготовка KDM1 (кератиноцитов дифференциация средний 1). Mix Дульбекко изменения орла среднего (DMEM) / F12 среднего (3:1) с 2% плода бычьим сывороточным (ФБС), 0.3 L-Аскорбиновая кислота ммоль/Л, 5 мкг/мл инсулина и 24 мкг/мл аденин.
    2. Подготовка KDM2 (кератиноцитов дифференциации среднего 2). Mix определены кератиноцитов сыворотки бесплатно средний (см. Таблицу материалы) с 0.3 L-Аскорбиновая кислота ммоль/л, 5 мкг/мл инсулина и аденин 10 мкг/мл.
      Примечание: Определенные кератиноцитов сыворотки свободный среднего оптимизирован для поддержки роста и расширения кератиноцитов.
    3. Подготовка KDM3 (кератиноцитов дифференциация средний 3). Mix определены кератиноцитов сыворотки бесплатно среднего и кератиноцитов сыворотки бесплатно среднего (1:1) Таблица материалов для деталей.
      Примечание: Кератиноцитов сыворотки свободный среднего оптимизирована для роста и поддержания кератиноцитов.
    4. Подготовка FDM1 (фибробластов дифференциация средний 1). Mix DMEM/F12 среднего (3:1) с 5% FBS, 5 мкг/мл инсулин, аденин 0,18 мм и 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF).
    5. Подготовить FDM2 (фибробластов дифференциации среднего 2). Mix DMEM/F12 среднего (1:1) с 5% FBS и 1% заменимых аминокислот.
    6. Подготовить EP1 (эпителиальные средний 1). Mix DMEM/F12 (3:1) с 4 мм L-глютамином, 40 мкм аденин, 10 мкг/мл трансферрин, 10 мкг/мл инсулина и 0,1% FBS.
    7. Подготовить EP2 (эпителиальные средний 2). Mix EP1 и хлористый кальций 1,8 мм.
    8. Подготовить EP3 (эпителиальные средний 3, средний ороговения). Mix F12 средний с 4 мм L-глютамином, 40 мкм аденин, трансферрин 10 мкг/мл, 10 мкг/мл инсулин, 2% FBS и хлористый кальций 1,8 мм.
  2. Поколение эмбриональных тела
    1. Генерировать СВМС iPSCs с использованием протокола, показано в предыдущем исследовании12.
    2. Герб культуры блюда, используя vitronectin. Подготовьте 5 мл, чтобы покрыть 100 мм блюдо.
      1. Размораживание и Ресуспензируйте 50 мкл 0.5 мг/мл vitronectin (конечная концентрация: 5 мкг/мл) с 5 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS). Добавить решение в посуду и инкубации при комнатной температуре (RT) за 1 ч. аспирационная материала покрытия перед использованием (не высохнуть).
    3. Поддерживать СВМС производные iPSCs с покрытием vitronectin 100 мм пластины и изменить iPSC среднего (E8) ежедневно при 37 ° C с 10% CO2.
    4. Генерировать эмбриональных органов (EBs), используя протокол, показано в предыдущем исследовании15 (кратко описывается следующим). Разверните iPSCs, изменив носитель до тех пор, пока клетки достигли 80% слияния. При впадении в 80% удалите среды и мыть с PBS.
    5. Лечить клетки с 1 мл раствора 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин и урожай ячейки, используя 3 мл среды E8. Центрифуга клетки на 250 x g на 2 мин.
    6. Аспирационная супернатант и применить 5 мл E8 среды к ячейкам. Подсчитать ячейки, используя Горяева и передачи 1 x 106 клеток к новой 15 мл Конические трубки. Центрифуга клетки на 250 x g на 2 мин.
    7. Ресуспензируйте передаваемых клетки с 2,5 мл EB формирования среды с 10 ингибитора киназы Ро связанные (рок) мкм. Падение 1 х 104 клетки (25 мкл/drop) на крышке плита noncoated культуры, с помощью 10-100 мкл многоканальные пипетки. EBs в форме 100 от 1 x 106 клеток (1 х 104 клетки/1 EB). Перевернуть блюдо и повесить на капли на крышке.
      Примечание: Рок ингибитор необходимо на этапе вложение в процессе обслуживания и дифференциации. Добавление ингибитора рок только на этапе агрегирования EB.
    8. Инкубируйте капель при 37 ° C с 5% CO2 на 1 день.
    9. Следующий день, урожай 100 EBs и использовать их для дифференциации. Промойте крышку плиты с iPSC средний (E8 средний) или PBS и урожай его содержимое в 50 мл Конические трубки. Поддерживать EBs на RT 1 мин для их урегулирования. Аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте EBs с E8 среднего и поддерживать их в чашке Петри 90 мм до дифференциации.
  3. Дифференцировка СВМС iPSCs на кератиноциты
    Примечание: Для схемы дифференциации кератиноцитов от СВМС iPSCs, см. рис. 1A.
    1. Урожай 100 EBs 50 мл Конические трубки с iPSC среднего или PBS. Сохранить на RT 1 мин, чтобы успокоиться EBs. Убедитесь, что они оседают на дне Конические трубки. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте EBs с E8 средний с 1 нг/мл костный морфогенетический белок 4 (BMP4). Передача EBs до 90 мм Петри и поддерживать их при 37 ° C с 5% CO2 на 1 день.
    2. Герб культуры блюда, используя тип IV коллагена. Подготовьте 5 мл тип IV коллагена для покрытия блюдо 100 мм.
      1. Размораживание и Ресуспензируйте типа IV коллагена раствор (конечная концентрация: 50 мкг/мл) с 0,05 N HCl. Добавить решение в посуду и Инкубируйте на RT 1 ч. аспирационная материала покрытия перед использованием (не высохнуть).
        Примечание: Перед использованием плиты, мыть посуду 3 x с PBS для удаления любых кислоты.
    3. Урожай EBs (шаг 1.3.1) 50 мл Конические трубки и поддерживать их на RT 1 мин для их урегулирования. Убедитесь, что они оседают на дне Конические трубки, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте EBs в 6 мл KDM1 с 10 мкм рок ингибитора. EBs передать тип IV коллаген покрытием 100 мм блюдо.
      Примечание: Добавление рок ингибитор только на стадии вложение EB.
    4. Между 0-8 дней измените среднего каждый другой день, чтобы KDM1 с 3 мкм ретиноевой кислоты (РА) и 25 нг/мл каждый BMP4 и EGF. Поддерживать EBs при 37 ° C с 5% CO2.
    5. От дней 9 – 12 измените среднего каждый день KDM2 с 3 мкм RA, 25 нг/мл BMP4 и EGF 20 нг/мл.
    6. Между 13 – 30 дней измените средство каждый день на KDM3 с 10 нг/мл BMP4 и EGF 20 нг/мл.
  4. Дифференциация СВМС iPSC в фибробластов
    Примечание: Для схемы фибробластов дифференциации от СВМС iPSCs, см. Рисунок 2A.
    1. Герб культуры блюда, с помощью базальной мембраны матрицы. Подготовьте 5 мл, чтобы покрыть 100 мм блюдо.
      1. Оттепель базальной мембраны матрица (конечная концентрация: 600 нг/мл) и разбавить его с среде DMEM/F12. Добавить решение в посуду и инкубировать при 37 ° C на 30 мин аспирата материала покрытия перед использованием (не высохнуть).
    2. Урожай 100 EBs 50 мл Конические трубки с помощью пипетки с iPSC среднего или PBS. Сохранить на RT 1 мин, чтобы успокоиться EBs. Убедитесь, что они оседают на дне Конические трубки. Удалите супернатант.
    3. Ресуспензируйте EBs, используя 1000 мкл пипетки в 6 мл FDM1 с 10 мкм рок ингибитора. EBs (с средний) передать блюдо матрица покрытием 100 мм базальной мембраны и инкубировать и при 37 ° C с 5% CO2. Обновление FDM1 каждый день в течение 3 дней.
      Примечание: Только добавьте ингибитор рок на стадии вложение EB.
    4. Добавьте 0.5 Нм костных морфогенетических белков 4 (BMP 4) FDM1 между 4 и 6 дней.
    5. На 7 день измените средство на FDM2 каждый день в течение 1 недели.
    6. На 14 день добавляют 1 мл 1 мм ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин урожай клетки с 3 мл FDM2 и центрифуги на 250 x g 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл FDM1.
    7. Подсчитать ячейки, используя Горяева, Ресуспензируйте 2 х 106 клеток с FDM1 средой и передать noncoated блюдо клетки. Сохранить клетки при 37 ° C с 5% CO2 и изменения среды каждый день.
    8. Слой культуры блюда, с использованием типа коллагена. Подготовьте 5 мл, чтобы покрыть 100 мм блюдо. Разбавить типа коллагена раствор (конечная концентрация: 50 мкг/мл) в 0.02 N уксусной кислоты. Добавить решение в посуду и Инкубируйте на RT 1 h. аспирата материала покрытия перед использованием (не высохнуть).
      Примечание: Перед использованием плиты, мыть посуду 3 x с PBS для удаления кислоты.
    9. На 21 день добавляют 1 мл 1 мм ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин урожай клетки с 3 мл FDM1 и центрифуги на 250 x g 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл FDM1. Счетчик клеток с помощью Горяева и передачи 2 x 106 ячеек к типу я коллагена покрытием 100 мм блюдо с FDM1 средой. Сохранить клетки при 37 ° C с 5% CO2 и изменения среды каждый день.
    10. День 28 добавляют 1 мл 1 мм ЭДТА и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин урожай клетки с 3 мл FDM1 и центрифуги на 250 x g 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 5 мл FDM1. Подсчитать ячейки, используя Горяева и передачи 2 х 106 клеток в noncoated блюдо с FDM1 средой. Поддержания клеток при 37 ° C с 5% CO2 и изменения среды каждый день.
      Примечание: iPSC производные фибробластов размножаться как линия клетки первичной фибробластов и проезд до 10 ходов. В этом исследовании мы использовали фибробластов iPSC производный от двух до пяти проходы для дальнейшего анализа.

2. применение hiPSC производные дифференцированных клеток

  1. Поколение 3D кожи органоид
    1. Подготовить нейтрализованы типа я коллагена на льду, следуя рекомендациям изготовителя. Как конечная концентрация, используйте 3 мг/мл для типа коллагена (типа акций концентрация Коллаген является 3.47 мг/мл) и убедитесь, что конечный объем смеси составляет 5 мл. Рассчитать объем 10 x PBS (окончательный объем/10 = 0.5 мл). Рассчитать объем типа коллаген использоваться (окончательный объем x окончательные коллаген концентрации / фондовый коллагена концентрация = 5 мл x 3 мг / мл / 3.47 мг / мл = 4.32 мл). Рассчитать объем 1 N NaOH (объем коллагена использоваться x 0,023 = 0,1 мл). Рассчитать объем dH2O (окончательный объем - объем коллагена - объем 10 ПБС - объем 1 N NaOH = 5 мл - 4,32 мл-0,5-0,1 мл = 0,08 мл). Смешать содержимое трубки и держать его на льду до готовой к использованию.
    2. Добавить 1 мл раствора ЭДТА в iPSC производные фибробласты из шага 1.4.10 и инкубировать и при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин урожай отдельные клетки, подсчитать количество ячеек с помощью Горяева и 2 x 105 клетки перехода к новой 15 мл Конические трубки. Центрифуга на 250 x g на 2 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте клетки фибробластов iPSC производные в 1,5 мл FDM1 и нейтрализовать тип я коллагена раствор (1:1).
      Примечание: Смешайте раствор осторожно, чтобы избежать пузырей.
    3. Место вставки мембраны на 6-ну микроплиты, передача смеси вставки и Инкубируйте 30 мин в рт.
      Примечание: Не перемещайте пластины.
    4. После подтверждения гелеобразования, добавьте 2 мл среды в верхней части вставки и 3 мл в нижней части скважины. Инкубируйте матрица фибробластов и коллагена при 37 ° C с 5% CO2 для 5-7 дней, пока не завершится гелеобразования и больше не контрактов.
    5. После полного гелеобразования, отсоединить iPSC производные кератиноциты (из шага 1.3.6) с помощью ЭДТА. Добавьте 1 mL ЭДТА и инкубировать и при 37 ° C с 5% CO2 на 2 мин урожай отдельные клетки, считать их с помощью Горяева и передачи 1 x 106 клеток к новой 15 мл Конические трубки. Центрифуга на 250 x g на 2 мин.
    6. Удалить супернатант и Ресуспензируйте 1 x 106 клеток в 50-100 мкл низким содержанием кальция эпителиальных средних 1 (EP1).
    7. Аспирационная всех средних в матрице (см. шаг 2.1.5) и семян 1 х 106 клеток кератиноцитов iPSC производных на каждый слой фибробластов. Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 30 мин.
      Примечание: Не перемещайте пластину и не добавляйте любые средства для крепления кератиноцитов.
    8. Добавьте 2 мл EP1 в верхней части вставки и 3 мл EP1 в нижней части скважины.
    9. После 2 дней аспирационная всех средних в пластину вставки мембраны и измените средний нормальный кальция EP2 за 2 дня.
    10. После 2 дней аспирационная всех средних и добавить 3 мл среды ороговения только снизу для создания интерфейса, воздух жидкость.
    11. Поддерживать органоид 3D кожи на срок до 14 дней при 37 ° C с 5% CO2 и изменения среды каждый день. Урожай органоид 3D кожи на передний край insert и использовать его для дальнейшего изучения окрашивание и кожного лоскута.
  2. Кожного лоскута
    1. Выполнять ингаляционной анестезии на Нод/scid мышей (мужской, 6 недель), стандарт, институционально утвержденным методом. Для кожного лоскута брить мех каждой мыши спинной кожи.
    2. Удалите часть кожи мыши, используя щипцы изогнутые ножницы 1 см x 2 см.
    3. Место органоид СВМС iPSC производные 3D кожи на месте дефекта и шовный материал, с помощью метода галстук за Туалетная с шелковыми швами.
    4. Соблюдать мышей в течение 2 недель и пожертвовать их для гистологического анализа. Окрашивание протокол проверялось в предыдущих исследованиях16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кожа состоит, по большей части, из эпидермиса и дермы. Кератиноциты тип основных клеток эпидермиса, и фибробласты тип основной ячейки дермы. Схема дифференциации кератиноцитов показана на рисунке 1A. СВМС iPCSc были сохранены в блюдо vitronectin покрытием (рис. 1Б). В этом исследовании мы продифференцировано СВМС iPSCs в кератиноцитов и фибробластов, с помощью формирования EB. Мы создали EBs с помощью висит падение метод для обе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как новая альтернатива для персональной восстановительной медицины17было предложено человека iPSCs. Пациент производные персонализированные iPSCs отражают пациента характеристики, которые могут использоваться для моделирования заболевания, наркотиков скрининг и аутологичной трансплантации18,19. Использование пациента производные iPSCs можно также преодолеть проблемы, касающиеся начальной ячейки, отсутствие число адекватных клеток и иммунны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от Кореи здравоохранения технологии R & D проекта, Министерство здравоохранения, благосостояния и делам семьи, Республика Корея (H16C2177, H18C1178).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АденинSigmaA2786Компонент среды для дифференцировки фибробластов
AggreWell Medium (среда для формирования EB)STEMCELL05893Образование EB
Антитело против фибронектинаabcamab23750Маркер фибробластов
Anti-KRT14 антителоabcamab7800Маркер кератиноцитов
Антитело к лорикринуabcamab85679Stratum corneum marker
Anti-p63 антителоabcamab124762Маркер кератиноцитов
Anti-Vimentin антителаSanta cruzsc-7558Маркер фибробластов
BAND AID ГИБКАЯ ТКАНЬJohnson & Матрикс
базальной мембраны Johnson-Bandage (Matrigel)BD354277Компонент дифференцировочной среды для фибробластов
BLACK SILK шовный материалAILEEESK617Кожный трансплантат
CaCl2SigmaC5670Компонент эпителиальной среды для 3D кожи Органоид
Коллаген I типаBD3542363D органоид кожи
Коллаген IV типаSanta-cruzsc-29010Компонент среды для дифференцировки кератиноцитов для кератиноцитов
Определенная кератиноцитарная среда без сывороткиGibco10744-019Компонент среды для дифференцировки кератиноцитов
DMEM, с высоким содержанием глюкозыGibco11995065Компонент среды для дифференцировки
DMEM/F12 СредаGibco11330-032Компонент среда для дифференцировки
Essential 8 средаGibcoA1517001iPSC среда
FBS, квалифицированнаяCorning35-015-CVКомпонент среды для дифференцировки фибробластов и кератиноцитов Добавка
глутамакс Gibco35050061Компонент среды для дифференцировки фибробластов
ИнсулинИнвтроген12585-014Компонент среды для дифференцировки фибробластов и кератиноцитов
Стандартные изогнутые ножницы радужной оболочкиProfessionalPC-02.10Хирургический инструмент
Кератиноцитарная сыворотка свободная средаGibco17005-042Компонент среды для дифференцировки кератиноцит
L-аскорбиновая кислота 2-фосфата сесквимагния соль гидрат магнияSigmaA8960Компонент среды для дифференцировки кератиноцитов
MEM Заменимая аминокислотаGibco1140050Компонент среды для дифференцировки фибробластов
Meriam Щипцы большой палец 16 смHIROSEHC 2265-1Хирургический инструмент
NOD. CB17-Prkdc SCID/JЛаборатория Джексона001303Мышей штамм для пересадки кожи
чашка Петри 90 ммHyundai MicroH10090Пластиковая посуда
Рекомбинантный человек BMP-4R& D314-BPКомпонент среды для дифференцировки кератиноцитов
Рекомбинантный человеческий белок EGFR& D236-EGКомпонент среды для дифференцировки кератиноцитов
Ретиноевая кислотаSigmaR2625Компонент среды для дифференцировки кератиноцитов
T/C Petridish 100 мм, 240/bxTPP93100Пластиковая посуда
Transferrin SigmaT3705Компонент эпителиальной среды для 3D кожи органоид
Transwell-COL с коллагеновым покрытием мембранные вставки& НБСП;CorningCLS3492Пластиковая посуда для 3D кожи органоид 
ВитронектинЛайф технолоджисА14700иПСК культура
Y-27632 Дигидрохлоридпепротех1293823иПСК культура

Ссылки

  1. Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
  2. Madison, K. C. Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
  3. Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
  4. Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).
  5. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  6. Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
  7. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
  8. Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
  11. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  12. Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
  13. Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
  14. Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
  15. Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008).
  16. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).
  17. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
  18. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  19. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
  20. Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
  21. Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
  22. Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
  24. Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
  25. Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
  26. Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
  27. Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
  28. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  29. Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
  30. Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
  31. Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
  32. Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).
  33. Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
  34. Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

мононуклеарные клетки пуповинной крови3D-органоид кожидифференцировка кератиноцитовдифференцировка фибробластовформирование эмбриональных телецколлаген I типаколлаген IV типаингибитор ROCKкостный морфогенетический белок 4
Поколение 3D кожи органоид из пуповинной крови производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.