Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение ферментативные стабильности путем изотермического титрования калориметрия

12.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59302

⸱

26 марта 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Dietetics and Food Science, Brigham Young University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Brigham Young University

В этой статье

Краткое содержание

Термостабильность активность фермента измеряется легко изотермический титрования калориметрии (ЦМТ). Большинство анализов стабильности белка в настоящее время используется мера белка разворачивается, но не предоставляют информацию о ферментативной активности. ЦМТ позволяет прямое определение влияния фермента изменений на стабильность ферментативной активности.

Аннотация

Эта работа демонстрирует новый метод измерения стабильности активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). Пик жары скорость наблюдается после однократного введения раствора субстрата в решение фермента связан с ферментативной активности. Многократные инъекции субстрата в то же решение фермента с течением времени показывают потери активности ферментов. Автономное, требует очень мало времени, персонала и применима к большинству средств массовой информации и ферментов.

Введение

Ферменты являются белки, способный катализировать широкий спектр органических реакций. Большинство ферментов функция в водном растворе в рядом с нейтральным pH, таким образом избегая использования суровых растворителей. Из-за их высокой селективностью, фермент катализатором реакции производят меньше (в некоторых случаях не субпродуктов) побочные продукты чем неизбирательной катализаторы например1кислот и щелочей. Это особенно актуально в производстве продовольствия, где все химические реакции должно быть сделано, чтобы конечный продукт является безопасным для потребления человеком. В настоящее время ферменты используются для производства Высокофруктозный кукурузный сироп2, сыр3, пиво4, лактозы молоко5и других важных пищевых продуктов. Хотя этот документ посвящен фермента использования в пищевой промышленности, есть много других применений для ферментов, в том числе в зеленой химии и наркотиков синтеза.

Полезность ферментов ограничен стабильности активность фермента, который зависит от поддержания трехмерной структуры фермента. Структура фермента может стабилизировать посредством модификации, такие как ПЭГилирование6, иммобилизации на прочную поддержку7, генетические модификации8и формулировок. В настоящее время фермент стабильность измеряется обычно дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и активность фермента конечной assays9. DSC измеряет температуру, при которой разворачивается фермент; чем выше температура, тем стабильнее структуры. Однако часто происходит потеря активности при более низкой температуре, чем требуется разворачиваться фермента или домены в пределах фермента10. Таким образом DSC не достаточно, чтобы определить ли модификация фермент увеличивает стабильность ферментативной активности. Assays энзима конечной точки, обычно время интенсивного, требуют несколько образцов и часто включают спаренных колориметрические реакции, которая не применима к высоко цветные или непрозрачные решения или суспензий.

Эта работа демонстрирует метод прямого измерения устойчивости активность фермента, изотермические титрования калориметрии (ЦМТ). ЦМТ измеряет скорость тепла освобождены или впитывается в ходе реакции. Поскольку почти все реакции производят или поглощать тепло, МТЦ может использоваться для большинства катализируемой ферментных реакций, включая реакции, которые не имеют спаренные реакции или происходят в непрозрачных носителей, таких как молоко. ЦМТ был использован на протяжении многих десятилетий для измерения химического кинетические параметры для многих видов реакций, но протокол, представленные здесь сосредоточена на использовании ЦМТ для измерения расхода тепла пик катализируемой ферментных реакций и демонстрирует, что активность фермента линейно коррелирует с расхода тепла пик. ЦМТ измерения пиковых ставок тепла в основном автономных и требуют очень мало времени персонала для установки и анализировать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка образцов

  1. 1000 мл 0,1 М натрия ацетата буфера при pH 4,6
    1. Мера 800 мл дистиллированной воды в стакан 1000 мл закончил.
    2. Весят 8.2 г безводного натрия ацетата и добавить его в стакан.
    3. Поместите стакан на тарелку, перемешать, поместить перемешать стержня в стакан, включите пластину перемешать и размешайте до полного растворения.
    4. Когда натрия безводный ацетат полностью не растворится, измеряют рН раствора с калиброванной рН метр.
    5. Добавьте 1 М HCl или NaOH соответственно для получения желаемого pH 4,6.
    6. Долейте дестилированную воду до тех пор, пока общий объем составляет 1000 мл.
    7. Хранить при комнатной температуре до использования.
  2. Фермент решение
    1. Подготовка 10 мл раствора в диапазоне 10-30 мг/мл, первые измерения 8 мл 0,1 М натрия ацетата буфер рН 4,6 в 15 мл окончил цилиндра фермента.
    2. Добавить буферный раствор в 15 мл Конические трубки с ферментом и встряхнуть, пока не растворится фермента.
    3. Добавьте больше буферного раствора, до тех пор, пока общий объем составляет 10 мл.
    4. Храните фермента раствор при температуре 4 ° C до использования.
  3. Раствора субстрата
    1. Для приготовления раствора субстрата в диапазоне 300-600 мм, подсчитать количество в граммах необходимо сделать желаемой концентрации субстрата.
    2. Весят из субстрата и поместить в стеклянный стакан 100 мл
    3. Мера 20 мл буферного раствора, с использованием 25 мл закончил цилиндров и затем добавить его в стеклянный стакан.
    4. Поместите стакан на тарелку, перемешать и место стержень магнитной размешать в стакане. Включите тепла и соответствующим образом скорректировать скорость перемешивания.
    5. Позвольте, перемешивание продолжать пока субстрат не растворится.
    6. Налить раствора субстрата в 50 мл Конические трубки и добавить 0,1 М натрия ацетата буфер рН 4,6 до тех пор, пока общий объем составляет 45 мл. Смешайте встряхивания.
    7. Храните раствора субстрата при комнатной температуре до использования.

2. Выполнение эксперимента

  1. Подготовка документа МТЦ
    1. Убедитесь, что загружен ссылочной ячейки с 350 мкл дистиллированной воды. Перед загрузкой фермента в ячейки выборки, убедитесь, что ячейки выборки был очищен.
    2. Очистка протокол заполните шприц загрузки с 500 мкл 2% раствор для очистки (Таблица материалов), осторожно вставить иглу в ячейки выборки, заполнить ячейки и медленно удалить жидкость, используя же шприц. Утилизируйте жидкость в стакан. Повторите этот шаг два раза с 2% раствор для очистки (Таблица материалов), три раза с 70% этанола, а затем вымыть десять раз дистиллированной водой.
    3. Заполните шприц загрузки с 450 мкл раствора фермента, тщательно вставить иглу вплоть до нижней части ячейки выборки и нажмите поршень вниз линии 100 мкл медленно, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
    4. Вымойте шприц 50 мкл титрования с дистиллированной водой в три раза, поместив кончик иглы в воду медленно принимает воду в шприц, а затем дозирования воды в контейнер для отходов.
    5. Удалите остатки воды, полоскать с раствора субстрата в три раза.
    6. Заполните шприц титрование раствора субстрата, нарисовав решение до шприца полностью без каких-либо воздушных пузырьков.
    7. С шприца до сих пор в раствора субстрата удалите поршень и позволяют примерно 2 мкл воздуха войти в верхней части шприц и вставьте поршень.
    8. Сними ручку Бурети ЦМТ, поместите шприц внутри ручки бюретки и завинтить до жесткой.
    9. Протрите кончик мешалка с безворсовой ткани, а затем тщательно установите ручку Бюретки в ЦМТ инструмент и зафиксируйте ее на месте.

3. Настройка ITCrun

  1. На компьютере откройте ITCrun и нажмите кнопку Настройка.
  2. Нажмите кнопку перемешивания скорость и установите 350 об/мин. Проверьте размер шприца (мкл) и убедитесь, что он находится в 50 мкл.
  3. Установите температуру и нажмите Обновить. Рекомендуется выполнять этот шаг по крайней мере 1 час перед подготовкой ЦМТ. Это позволяет достаточно времени для инструмента для нагрева или охлаждения при необходимости.
  4. Для настройки эксперимента выберите Инкрементное титрования.
  5. Нажмите кнопку Вставить для установки инъекции. Настройка интервала впрыска до 5400 s, объем впрыска (мкл) 4 и количество инъекций до 4. Нажмите OK для подтверждения настроек.
  6. В поле уравновешиваниявыберите Auto сбалансировать и большой ожидается нагревается. (Если ожидаемый нагревает малы, можно выбрать небольшой под ожидаемое нагревается; однако, это увеличит время уравновешивания).
  7. Установите первоначальный базовый 300 s.
  8. Для начала выполнения, нажмите начать символ рядом с скорость перемешивания и затем нажмите кнопку начать находящийся рядом с символом гаечного ключа.
  9. Сохраните файл и разрешить инструмент для запуска.

4. анализ данных

  1. Откройте файл в NanoAnalyze. Щелкните данные и выберите столбцы данных.
  2. Выберите все данные, копировать и затем вставить данные в Microsoft Excel.
  3. Регулировка нулевого базового, добавив значение требуется 300 s, чтобы сделать его нулевой. Примените это исправление на весь столбец значения интенсивности тепла.
  4. Найти минимальное или максимальное значение расхода тепла для каждой инъекции, используя уравнение: =MIN(cell:cell) или MAX(cell:cell). Каждая точка данных представляет собой пик Ферментативная активность фермента в каждой инъекции.
  5. Печать диаграммы значений MIN или MAX против времени, в которой значение произошло во время титров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель результаты на рисунке 1 и на рисунке 5 показывают данные из двух ферментов, лактозу и инвертазы. Лактаза и инвертазы катализируют гидролиз дисахарида в два моносахариды, endothermically и exothermically, соответственно. Обе ферментативных реакций были запущены в концентрациях, которые препятствуют насыщенность фермента.

Лактаза данные показывают, как ЦМТ данные могут использоваться для оценки стабильности фермента. Четыр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основным преимуществом пробирного стабильности фермента ЦМТ, описанные здесь является автоматизация. После того как сделаны все необходимые буферы и решения, время установки для каждого пробирного находится примерно 15 минут, для лица, совершающего assay. В отличие от обычных анализов для инвертаза и лактозной активности требуют около 2 ч с постоянным участием лица, совершающего assay и многие ферментативную активность анализов принимать значительно более человеко-часов. В предыдущей публикации мы продемонстрировали, как...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
a-ЛактозаФишер Научный неизвестный (слишком старый)500г
ацетата натрия, безводный 99% минAlfa Aesar A13184-30250г
лактазы MP Bio1007805г
раствор гидрохлорной кислоты, 1N Fisher Scientific SA48-500
Настольный измерительVWR89231-622
Этанол 70%Fisher Scientific BP8231GAL1 галлон
Micro-90Fisher Scientific NC0246281л (чистящий раствор)
500 мл - pH

Ссылки

  1. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  2. Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
  3. Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
  4. van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
  5. Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
  6. Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
  7. Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
  8. Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).
  9. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
  10. Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
  11. Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
  12. Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Измерение ферментативные стабильности путем изотермического титрования калориметрия
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.