Методическая статья

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

DOI:

10.3791/59321

⸱

1 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology Charles Darwin, Sapienza University of Rome, Italy, 2Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, Italy, 3Laboratory of Stem Cell biology and Molecular Embryology, The Rockefeller University, USA, 4Department of Physiology and Pharmacology, Sapienza University of Rome, Italy

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет быстрое и эффективное преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в моторные нейроны с спинномозговой или черепной идентичности, эктопическим выражением транскрипционных факторов из индуцированных векторных переносчиков.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь метод для получения функциональных спинномозговых и черепных двигательных нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Прямое преобразование в мотонейрона получено эктопическим выражением альтернативных модулей транскрипционных факторов, а именно Ngn2, Isl1 и Lhx3 (ноль) или Ngn2, Isl1 и Phox2a (НПВ). НОЛЬ и НПВ указывают, соответственно, спинной и черепной двигательной идентичности. Наш протокол начинается с генерации измененных линий iPSC, в которых ноль или НПВ прочно интегрированы в геном через переносчик транспона. Экспрессия трансгенов затем индуцируется доксициклин и приводит, в 5 дней, к преобразованию Ипмск в MN прародителей. Последующее созревание, в течение 7 дней, приводит к однородным популяциям спинного или черепного МНБ. Наш метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими протоколами: он чрезвычайно быстрый и упрощенный; Он не требует вирусной инфекции или дальнейшей изоляции MN; Он позволяет генерировать различные МН субпопуляции (спинной и черепной) с замечательной степенью созревания, о чем свидетельствует способность стрелять поездов потенциалов действия. Кроме того, большое количество двигательных нейронов может быть получено без очистки от смешанных популяций. iPSC-производные спинномозговых и черепных двигательных нейронов может быть использовано для экстракорпорального моделирования боковой амиотрофического склероза и других нейродегенеративных заболеваний мотонейрона. Однородные популяции мотонейронов может представлять собой важный ресурс для клеток типа конкретных обследований наркотиков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двигательные нейрона (MN) дегенерация играет причинную роль в человеческих заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) и спинальной мышечной атрофии (СМА). Создание подходящих в пробирке систем модели клеток, которые повторяют сложность человеческого MN является важным шагом на пути к разработке новых терапевтических подходов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ипскс), наделенные замечательными дифференцированием, в настоящее время получены от ряда пациентов, страдающих заболеваниями моторных нейронов1,2. Дополнительные линии iPSC, несущие патогенные мутации, связанные с заболеваниями MN, генерируются путем редактирования генов, начиная с контроля «здоровых» плюрипотентных стволовых клеток3. Эти линии представляют собой полезные инструменты для моделирования в пробирке и скрининга лекарственных препаратов при условии, что имеются соответствующие методы дифференциации iPSC в МНБ. Обоснование развития этого метода заключается в том, чтобы обеспечить научное сообщество, заинтересованный в MN заболеваний с быстрым и эффективным протоколом дифференцировки, давая рост зрелой функциональной МНБ. Первым преимуществом этого метода является его таймфрейм исполнения. Другой соответствующий пункт прочности приходит от исключения любого шага очищения. Наконец, протокол может быть использован для создания двух различных популяций моторных нейронов.

Возможность генерации различных подтипов МНБ особенно актуальна для моделирования заболеваний MN. Не все подтипы MN одинаково уязвимы в ALS и СМА и появление симптомов в различных моторных единицах значительно влияет на прогноз. В ALS, спинного начала с симптомами, начиная с верхних и нижних конечностей приводит к смерти примерно в 3-5 лет4. И наоборот, булбарные начала, начиная с дегенерацией черепных МНБ, имеет наихудший прогноз. Более того, процент появления булбарного заболевания значительно выше у пациентов с мутациями в РНК-связывающих белках ФУС и TDP-43, чем у особей с SOD1 мутациями5. Почти совокупность альтернативных протоколов дифференциации MN опирается на активность ретиноевой кислоты (RA), которая наделяют спинного характера для дифференциации iPSCs6,7,8. Это ограничивает возможность изучения внутренних факторов, которые могут быть защитные в конкретных подтипов MN9,10.

В соответствии с предыдущей работы в мышке эмбриональных стволовых клеток11, мы недавно показали, что в человеческом iPSCs эктопического выражения Ngn2, Isl1 и LHX3 (ноль) индуцирует спинного MN идентичности, в то время как Ngn2 и Isl1 плюс PHOX2A (НПВ) определить черепной МНБ12. Поэтому мы разработали эффективный протокол, что привело к производству человека МНБ наделены функциональных свойств в 12 дней поворот. Цель этого метода заключается в получении, в короткие сроки и без необходимости очистки (например, по FACS), популяции клеток высоко обогащенный для МНБ с позвоночника или черепной идентичности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. поддержание iPSCs человека

  1. Подготовка пластин с матрицей с покрытием
    1. Оттепель один 5 мл флакон матрицы (см. таблицу материалов) при температуре 4 °c в одночасье. Оригинальные запасы матрицы приходят на различные концентрации запасов и aliquототы производятся в соответствии с фактором разрежения указано на информационный листок, специфичный для отдельного лота. Важно держать пробирку и трубы ледяную, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразующего матрицы. Дозировать матрицу в алкуоты в предварительно охлажденных криотрубках на льду. Замораживание неиспользованных аликуотов при температуре-20 °C.
    2. Поместите один Алиготе на льду около 2 ч в оттепель.
    3. Развести Алиготе матрицы с 20 мл холодного ДМА/F12 в 50 ml конической трубки.
    4. Смешайте хорошо и обойтись 1 мл разбавленной матрицы в 35 мм блюда (эквивалентные суммы на площади поверхности других блюд).
    5. Держите блюда, содержащие разбавленной матрицы для 1 ч при комнатной температуре, чтобы покрытие.
      Примечание: Блюда, запечатанные парафильмом, можно хранить при температуре 4 ° c до 2 недель.
  2. Подготовка запаса раствора (20 мл) и 1x рабочих аликуотов нежного реагента диссоциации клетки (см. таблицу материалов).
    1. Растворить порошок до 10 мг/мл в PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
    2. Фильтр стерилизовать через 0,22 мкм фильтр мембраны.
    3. Приготовьте 20 аликуотов (по 1 мл) и храните при температуре-20 °C.
    4. Перед использованием, разбавить один Алиготе в PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно) до 1 мг/мл (1x рабочих aliquототы).
      Примечание: 1x рабочие aliquототы могут храниться при температуре 4 ° c до 2 недель.
  3. Пассаже человеческих iPSCs.
    1. Перед началом: если хранится при температуре 4 ° c, предварительно теплые матрицы покрытием пластин в инкубаторе при температуре 37 ° c для 20-30 мин. предварительно теплый при комнатной температуре количество человеческих iPSC средних (см. таблицу материалов) необходимо. Предварительно прогреем ДМЕ/F12.
    2. Аспирин культуры среды.
    3. Промыть iPSCs с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
    4. Добавьте 1x нежное диссоциация раствор (0,5 мл для тарелки 35 мм). Инкубировать при температуре 37 ° c до краев колоний начинают отделяться от пластины, как правило, 3-5 мин.
    5. Аспирин нежный раствор диссоциации, будучи осторожным, чтобы не отделить iPSC колоний.
    6. Вымойте клетки с ДМА/F12 (2 мл для 35 мм блюдо) и аспирин быть осторожным, чтобы не отделить клетки. Повторите этот шаг еще раз.
    7. Добавить человека iPSC средних (1 мл для 35 мм блюдо).
    8. Аккуратно отделите колонии с ячейки ручка и переход на 15 мл трубки.
    9. Аккуратно разорвать ячейки сгустки по пипетки вверх и вниз с P1000 пиктоили 3-4 раз.
    10. Аспирин супернатант от матрицы покрытием пластины (ы).
    11. Семенной клетки в соответствующем объеме культуры человека iPSC среды. Коэффициент разделения может варьироваться от линии к линии и составляет около 1:4-1:8. Изменение среды в день.

2. поколение ноль и НПВ Индусибл линии iPSC

  1. Клеточная трансфеекция.
    1. Промыть клетки с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
    2. Добавить реагента диссоциации ячейки (см. таблицу материалов) (0,35 ml для тарелки 35 mm) и инкубировать при 37 °c, пока одиночные клетки не отделяются (5-10 мин).
    3. Аккуратно полное разделение клеток по пипетке вверх и вниз с P1000 пикетили 3-4 раз.
    4. Соберите в трубку 15 мл и добавьте PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно) до 10 мл. Считайте ячейки.
    5. Гранулы 106 ячеек и ресуспензируем в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропораляции ячейки, см. таблицу материалов).
    6. Добавить плазмид ДНК для переливания: 4,5 мкг переносного вектора (ЭПБ-бзд-ТТ-ноль или ЭПБ-бзду-ТТ-НПВ12) и 0,5 мкг транспосэ-плазмид13.
    7. Transfect с клеточной электропорцией системы (см. таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и как описано ранее3 со следующими параметрами: 1 200 V напряжение, 30 MS ширина, 1 пульс. Семенные клетки в человеческом средстве iPSC дополнены 10 мкм Y-27632 (ингибитор ROCK, см. таблицу материалов) в 6-мм блюде с матрицей с покрытием.
  2. Отбор с помощью антибиотиков.
    1. Через два дня после переливания, добавить 5 мкг/мл пресект к культуре среды.
    2. Большинство не трансфцифицированных клеток умрет в течение 48 h от отбора, которым будет недоволен. Держите клетки в пресблили в течение по крайней мере 7-10 дней, чтобы противостоять выбрать клетки, которые не интегрированы трансгенов в геноме.
    3. Поддержание стабильно трансфцированных клеток в виде смешанного населения, состоящего из ячеек с разным числом трансгенов и различных интеграционные узлы, или изолирования одиночных клонов.
    4. Подготовьте дополнительное блюдо для проверки на эффективное выражение трансгенов, после 1 мкг/мл индукционного доксициклин, с помощью RT-СР с трансген-специфических праймеров для Ngn2 (Форвард: TATTACACCTCCAG; Реверс: GAAGGGAGGGGCACT), как описано ранее12.
    5. На данном этапе замораживаем запасы романа «ноль-и щипок-iPSC» в морозильной среде для IPSC человека (см. таблицу материалов).

3. дифференцировка нейрона мотора

  1. Отделить клетки от клеточной диссоциации, как описано (шаги 2.1.1.-2.1.3.). Собирают диссоциированные клетки в трубке 15 мл и разбавляют 5 томами ДМЕ/F12. Гранулы клетки и ресуспензируем в человеческом средней iPSC дополнить 10 мкм ингибитор рок. Подсчет клеток и семян на матричных покрытием блюд при плотности 62 500 клеток/см2.
  2. На следующий день, заменить среду с ДМ/F12, дополнено 1x стабильный L-глютамина аналог, 1x не незаменимые аминокислоты (NEAA) клеток культуры дополнения и 0,5 х пенициллин/стрептомицин, и содержащие 1 мкг/мл доксициклин. Это рассмотрено как день 0 дифференцировки. В день 1, обновить среду и доксициклин.
  3. В день 2 Измените медиум на Нейробазальную/B27 среду (Нейробазальную среду, дополненную 1x B27, 1x стабильный L-глютамин аналог, 1x NEAA и 0,5 х пенициллин/стрептомицин), содержащий 5 мкм ДКВ, 4 мкм SU5402 и 1 мкг/мл доксициклин (см. таблицу материалов ). Обновите носитель и доксициклин каждый день до 5 дня.
  4. День 5: клетки диссоциации с клеточной диссоциации реагента (см. таблицу материалов).
    1. Промыть клетки с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
    2. Добавить реагента диссоциации ячейки (0,35 mL для тарелки 35 mm) и инкубировать при 37 °C до тех пор пока весь монослой клетки не отделяется от тарелки. Обратите внимание, что одиночные ячейки не будут разделены во время инкубации.
    3. Добавьте 1 мл ДМЕ/F12 и соберите ячейки в трубке 15 мл.
    4. Аккуратно полное разделение клеток по пипетке вверх и вниз с P1000 пикетили 10-15 раз.
    5. Добавьте 4 мл ДМЕ/F12 и подсчитайте ячейки.
    6. На данном этапе, замораживание мотонейрона прародителей в камере замораживания среды (см. таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя.
    7. Гранулы клетки и ресуспензируем в нейрональных средних (Нейробазальной/B27 средней дополнить 20 нг/мл БНФ, 10 нг/мл ГНФ и 200 нг/мл L-Аскорбиновая кислота, см. таблицу материалаs) дополнена 10 мкм рок ингибитор.
    8. Семенной клетки на Поли-орнитин/ламининин-или альтернативно на матричном покрытием поддерживает при плотности 100 000 клеток/cm2. Использование μ-слайд пластиковые опоры с полимерной кроя (см. таблицу материалов) для иммуноокрашивания анализа.
  5. На 6-ый день, измените средство с свежим нейрональная средняя лишенная ингибитора утеса. В ближайшие дни обновите половину среды каждые 3 дня. Среда культуры должна быть изменена очень тщательно для того чтобы предотвратить отрешенность от поверхности.

4. иммуноокрашивания анализ

  1. Фиксация клеток. Промыть клетки с PBS (с CA2 +/mg2 +) и инкубировать в течение 15 минут в 4% ПАРАФОРМАЛЬДЕГИД в PBS (с CA2 +/mg2 +) при комнатной температуре.
    Осторожно: Параформальдегид токсичен и подозревается в причинении рака. Избегайте контакта с кожей и глазами и ручка под химический вытяжки дыма.
  2. Проникая с PBS (с CA2 +/mg2 +), содержащий 0,1% тритон X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре.
  3. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре при блокировке антител раствора (ABS: 3% БСА в PBS с CA2 +/mg2 +).
  4. Инкубировать для 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами в ABS: Anti-TUJ1 (1:1000; кролик) и анти-Oct4 (1:200; мышь) или анти-чат (анти-холин ацетилтрансферазы; 1:150; коза). См. таблицу материалов.
  5. Инкубировать для 45 мин при комнатной температуре с соответствующим осла вторичной пары антител в ABS: анти-мышь Alexa Fluor 647 (1:250), анти-кролик Alexa Fluor 594 (1:250) и анти-коза Alexa Fluor 488 (1:250). См. таблицу материалов.
  6. Инкубировать в 0,4 мкг/мл DAPI для 5 мин при комнатной температуре для обозначения ядер.
  7. Установите клетки с монтажных средств (см. таблицу материалов) для визуализации на флуоресцентного микроскопа.

5. функциональные характеристики через патч-зажим записи

  1. Подготовка HEPES-equilibrated внешнее решение (РЭШ) как следующие: 140 mM Перламуговый, 2,8 mM KCl, 2 мм кактуса2, 2 мм MgCl2, 10 мм HEPES, и 10 мм глюкозы. Установите осмоллярность между 290-300 MOм. Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью 1N NaOH и храните раствор при температуре 4 °C.
  2. Подготовьте внутреннее решение: 140 mM K-глюконет, 2 мм перламутр, 5 мм БАФТА, 2 мм MgCl2, 10 мм HEPES, 2 мм мг-ATP, 0,3 мм Na-GTP. Отрегулируйте рН до 7,3 с 1M Кох и убедитесь, что осмоллярность установлена на уровне около 290 м. Заморозить раствор при температуре-20 °C в небольших аликуототов.
  3. Перед проведением экспериментов предварительно прогреть раствор РЭШ в водяной бане примерно до 28-30 °C.
  4. Вытяните некоторые боросикатные микропипетки (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) подшипник сопротивления: 5-6 MОМ и заполнить с внутриклеточного раствора перед установкой в пипетки держателя.
    Примечание: Не забудьте хлорид серебряные провода из записывающего электрода и опорного электрода в отбеливателя, по крайней мере 30 мин для того, чтобы сформировать единый слой AgCl на поверхности провода.
  5. Перенесите чашку Петри в камеру записи и позвольте камере с решением NES на 1-2 mL/min. Пусть поток, проходящий через встроенный нагреватель установлен при температуре 30 ° c, чтобы сохранить раствор теплым.
  6. Поместите электрофизиологическую камеру записи под вертикальный Микроскоп. Запись мембранные токи с патч-зажим усилитель и получить данные с соответствующего программного обеспечения.
  7. Откройте программное обеспечение для управления усилителем и установите сигнал усиления в значении 1 и фильтр Бесселя на 10 кГц. Убедитесь, что фильтр Бесселя находится в 2,5 раз ниже частоты дискретизации.
  8. Установите экспериментальные протоколы для напряжения-зажим и ток-зажим эксперименты в записи программного обеспечения.
  9. В настройке протокола отметьте режим эпизодической стимуляции и установите частоту дискретизации в 25 кГц. Затем переместите на вкладку сигнала формы и наберите напряжение или текущую амплитуду шага и длину, как следует.
  10. Для напряжения-закрытого течения натрия, используйте 15 шагов напряжения (50 MS продолжительность каждого) от-100 мВ до + 40 мВ (10 МВ прирост). Запустите протокол после наложения на пропатчен ячейку холдинга потенциал-60 МВ через усилитель. Аналогичным образом, напряжение-закрытый калийные токи вызваны шагами напряжения (250 MS продолжительность каждого) от-30 мВ до + 50 МВ (10 МВ приращения), держащих Записанная ячейка до-40 мВ.
  11. Для исследования огневые свойства iPSC-производные черепных и спинальных МНБ, зажима клеток, в режиме тока-зажим, при мембранный потенциал-70 МВ и использовать 4 текущие импульсы (1 s продолжительность каждого) увеличения амплитуды (от + 20 pA до + 80 pA; 20 прирост pA).
  12. Приобретают для каждого клеточного напряжения-активированные токи, вызывали огневые действия и три пассивных свойства в качестве емкости цельного клетки (cm), сопротивления клеточной мембраны (RM) и потенциала мембраны покоя (RMP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое описание метода дифференциации показано на рисунке 1. IPSCs человека (ДЦ I линия3) были трансфедифицированна с ЭПБ-бзди-ТТ-Нил или ЭПБ-БЗД-ТТ-НПВ, генерируя, после того, как недоволен отбора, стабильной и индузбл ячейки линии12, далее именуемый iPSCs-ноль и iPSCs-НПВ, соответственно. Дифференцируя клетки были охарактеризованы для выражения плюрипотентности маркер OCT4 и Пан-нейрональных маркер TUJ1. Иммуноокрашивания анализ показа...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет эффективно преобразовывать человеческие ИППО в спинномозговую и черепную двигательные нейроны благодаря эктопическим выражению специфических факторов, связанных с линией преемственности. Эти трансгены являются Индастри по доксициклин и стабильно интегрированы в геноме благодаря переносной транспона на основе вектора. В смешанной популяции один или несколько копий вектора "Спекулябак" будут случайным образом интегрированы в геном отдельных клеток, что увеличивает риск изменений целостности генома. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотят поблагодарить центр визуализации в центре жизни нано науки, Isto Итальянский ди Текнологии, для поддержки и технических консультаций. Мы благодарны членам центра по жизни нано науки для полезной дискуссии. Эта работа была частично поддержана грантом Арисла (Пилотная субсидия 2016 "Стрессфус") в AR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5-BaptaSigma-AldrichA4926-1Gхимикаты для электрофизиологических растворов
AccutaseSigma-AldrichA6964-100ML Реагент для диссоциации клеток
анти-CHATEMD Millipore AB144Pантихолинацетилтрансфераза. Первичное антитело, используемое в иммуноокрашивающих анализах. RRID: AB_2079751; Номер партии: 2971003
антикозий Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055Вторичное антитело, используемое для иммунофлуоресцентных анализов. RRID: AB_2534102; Номер лота: 1915848
антимышь Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific A31571Вторичное антитело, используемое для иммунофлуоресцентных анализов. RRID: AB_162542; Номер лота: 1757130
anti-Oct4 BD Biosciences611202Первичное антитело, используемое в анализах иммуноокрашивания. RRID: AB_398736; Номер лота: 5233722
anti-Phox2bSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-376997Первичное антитело, используемое в иммуноокрашивании. Номер лота: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594 Иммунологические наукиIS-20152-1Вторичное антитело, используемое для иммунофлуоресцентных анализов
анти-TUJ1 Сигма-Олдрич T2200Первичное антитело, используемое в иммуноокрашивающих анализах. RRID: AB_262133
B27Miltenyi Biotec130-093-566Бессывороточная добавка для поддержания нейрональных клеток
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Среда для замораживания клеток, используемая здесь для предшественников моторных нейронов
BDNFPreproTech450-02Нейротрофический фактор мозга
бластицидинSigma-Aldrich203350Нуклеозидный антибиотик, ингибирующий синтез белка у прокариот и эукариот
BSASigma-AldrichA2153Bovine Serum Albumin. Блокатор для предотвращения неспецифического связывания антител в иммуноокрашивающих анализах
CaCl2Sigma-AldrichC3881химикаты для электрофизиологических растворов
Clampex 10 программное обеспечениеМолекулярные устройстваClampex 10Мембранная система регистрации токов
Corning Matrigel hESC MatrixCorning354277Восстановленный препарат базальной мембраны из саркомы мышей Энгельбрета-Холма-Роя (EHS). Используется для адгезии иПСК к пластику и стеклу подложки
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EЗамораживающая среда для человека iPSC
D-GlucoseSigma-AldrichG5146химикаты для электрофизиологических растворов
DAPI порошокRoche102362760014,6-диамидино-2-фенилиндол. Флуоресцентный краситель, который связывается с аденином; Богатые тимином участки ДНК используются для окрашивания ядер в иммунофлуоресцентных анализах
DAPTAdipoGenAG-CR1-0016-M005Ингибитор гамма-секретазы
DispaseGibco17105-041Реагент для щадящей диссоциации иПСК человека
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLБазальная среда для клеточной культуры
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1G& НБСП;Используется для индукции экспрессии трансгенов из векторов epB-Bsd-TT-NIL и epB-Bsd-TT-NIP
DS2U WiCellUWWC1-DS2UКоммерческая линия iPSC человека
E.Z.N.A Total RNA Kit Omega bio-tekR6834-02Набор для тотальной экстракции РНК из культивируемых эукариотических клеток
GDNFPreproTech450-10Глиально-производный нейротрофический фактор
Gibco Episomal hiPSCLine Thermo Fisher ScientificA18945Коммерческий человеческий iPSC line
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050038Альтернатива L-глутамину с повышенной стабильностью. Улучшает здоровье клеток.
HepesSigma-AldrichH4034химикаты для электрофизиологических растворов
iScript Reverse Transcription Supermix для ОТ-кПЦР Bio-Rad1708841Набор для анализа экспрессии генов с помощью qPCR в реальном времени
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix Био-Рад172-5121 Готовая к использованию реакционная мастер-смесь, оптимизированная для количественной ПЦР на основе красителей (qPCR) на любом приборе для ПЦР в реальном времени
K-глюконатSigma-AldrichG4500химикаты для электрофизиологических растворов
KClSigma-AldrichP9333химикаты для электрофизиологических растворов
L-аскорбиновая кислотаLKT LaboratoriesA7210Используется в клеточной культуре в качестве антиоксиданта
ЛамининSigma-Aldrich11243217001Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Олимп  iX83 FluoView1200Конфокальный микроскоп для получения иммуноокрашивающих изображений
Mg-ATPSigma-AldrichA9187химикаты для электрофизиологических растворов
MgCl2Sigma-AldrichM8266химикаты для электрофизиологических растворов
Монтажная среда Ibidi50001Монтажный раствор для конфокальной микроскопии и иммунофлуоресцентных анализов
Multiclamp патч-клэмпликаторМолекулярные устройства700BМембранная система регистрации токов
Na-GTPSigma-AldrichG8877химикаты для электрофизиологических растворов
NaClSigma-Aldrich71376химикаты для электрофизиологических растворов
NEAAThermo Fisher Scientific11140035заменимых аминокислотах. Используется в качестве добавки к клеточной культуральной среде, для увеличения роста и жизнеспособности клеток.
Неон 100 μ L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Набор для электропорации клеток
Система для трансфекции неоновыхThermo Fisher ScientificMPK5000Система электропорации клеток
Нейробазальная средаThermo Fisher Scientific21103049Базальная среда, предназначенная для длительного поддержания и созревания популяций нейрональных клеток без необходимости использования питательного слоя астроцитов
NutriStem-XF/FF Биологическая промышленность05-100-1AПитательная среда для иПСК человека
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Науки157-8Используется для фиксации клеток в иммуноокрашивающих анализах
PBSSigma-AldrichD8662-500MLФосфатный буфер Дульбекко Буферный раствор, с кальцием, с магнием
PBS Ca2+/Mg2+ свободныйSigma-AldrichD8537-500MLФосфатный буферный раствор Дульбекко, без кальция, без магния,
пенициллина/стрептомицина Sigma-AldrichP4333-100MLРаствор пенициллина/стрептомицина, используемый для предотвращения контаминации клеточной культуры бактериями.
полиорнитинSigma-AldrichP4957Способствует прикреплению и росту нервных клеток in vitro
SU5402Sigma-AldrichSML0443-5MGСелективный ингибитор рецептора фактора роста эндотелия сосудов 2 (VEGFR-2)
Triton X-100 Sigma-AldrichT87874-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенил-полиэтиленгликоль,  t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол, полиэтиленгликоль  Трет-октилфениловый эфир. Используется для пермеабилизации клеток в иммуноокрашивающих анализах
Вертикальный микроскопOlympusBX51VIМикроскоп для электрофизиологической регистрации оснащен камерой CoolSnap Myo 
Y-27632  (Ингибитор ROCK)Энцо Медико-биологические наукиALX-270-333-M005 Проникающий в клетки селективный ингибитор Rho-ассоциированной, спиральной спирали, содержащей протеинкиназу (ROCK). Повышает выживаемость iPSC
mu;-Slide 8 Well Ibidi80826Поддержка high– Конечный микроскопический анализ неподвижных клеток
клеток &

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960(2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Human iPSCsMotor Neuron DifferentiationPiggyBac VectorsNgn2 Isl1 Lhx3Ngn2 Isl1 Phox2aSpinal Motor NeuronsCranial Motor NeuronsDoxycycline InductionCholine AcetyltransferaseAction Potential Firing

Похожие статьи