Методическая статья

Использование En Face иммунофлуоресценции окрашивания для наблюдения сосудистых эндотелиальных клеток непосредственно

DOI:

10.3791/59325

⸱

20 августа 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Institute of Cardiovascular Diseases, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для иммунофлуоресценции окрашивания наблюдать эндотелиальных клеток аорты мыши непосредственно. Этот метод полезен при изучении клеточного и молекулярного фенотипа эндотелиальных клеток в различных структурах потока и в развитии атеросклероза.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аномальные изменения в эндотелиальном фенотипе и морфологии считаются первоначальными событиями при патогенезае атеросклероза. Прямое наблюдение за нетронутым инее эндотелием даст ценную информацию для понимания клеточных и молекулярных событий в дисфункциональных эндотелиальных клетках. Здесь мы описываем модифицированную технику окрашивания иммунофлуоресценции en face, которая позволяет ученым получить четкие изображения нетронутой эндотелиальной поверхности и проанализировать модели экспрессии молекул на месте. Метод прост и надежен для наблюдения за всем эндотелиальным монослойом на разных участках аорты. Этот метод может быть перспективным инструментом для понимания патофизиологии атеросклероза, особенно на ранней стадии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранние изменения в сосуде в первую очередь инициируются в эндотелии, который функционирует как селективный барьер между кровью и стенкой сосуда с ее межклеточными узкими стыковочными комплексами1. Существенные данные указывают на важную роль для механических эффектов кровотока в модуляции эндотелиальной функции2. Напряжение сдвига жидкости, фрикционная сила, порожденная кровотоком, дифференциально формы эндотелиальной морфологии клеток и функции, в зависимости от конкретных парадигм потока в различных сосудистых участках2,3. Атеросклеротические поражения преимущественно происходят в местах нарушения кровотока (d-потока), таких как кривизны сосудов, разделители потока и ветви точек, по сравнению с регионами постоянного потока (s-flow), такими как прямой сегмент артерии. Таким образом, прямое наблюдение эндотелиальной морфологии и моделей молекулярной экспрессии должно обеспечить важное понимание структурных и функциональных фенотипов эндотелиальных клеток при различных парадигмах потока.

Культурные эндотелиальные клетки не могут выразить фактический фенотип, как они делают in vivo отчасти из-за потери воздействия жидкости сдвига стресс, окружающие цитокинов, и клеток или клеток экстраклеточной матрицы взаимодействий. Чтобы помочь этому, нетронутый эндотелиальный монослой клеток может быть изучен на поперечных участках с использованием классической иммуногистохимии. Однако эндотелиальный монослой настолько тонкий и хрупкий, что его обычно не удается четко наблюдать. Эн лицо иммуногистохимии был использован для наблюдения за внутренней поверхности эндотелия, но является либо сложным или неустойчивым в его результатах, потому что эндотелий легко раздели из основной ткани, или только часть артериальной стенки крыс или кроликов, чьи стены толстые, установлен оснащается4,5.

Мышимодели имеют значительные преимущества перед другими животными во многих отношениях. Здесь мы используем модифицированный метод иммунофлуоресценции для анализа эндотелиальных клеток аортальной арки и грудной аорты в мыши C57BL/6. Такая методика широко используется для изучения эндотелиальной патофизиологии в различных структурах потока и в развитииатеросклероза 6,7,8,9,10. Этот метод позволяет ученым четко наблюдать за всей поверхностью эндотелия и сравнивать экспрессионные модели данного белка в регионах под различными сдвигами жидкости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с экспериментальными протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Шанхайского университета Цзяо Тонг.

1. Перфузия аорты мыши

  1. Кратко, анестезируйте 12-недельных мышей C57BL/6 с интраперитонеальными инъекциями пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела). Подтвердите правильное обезвреживание, мягко щипая хвост.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если движения не наблюдается, животное достаточно обезобезвистано, чтобы начать эксперименты.
  2. Лента лапы мыши на стопку бумажных полотенец с клейкой ленты.
  3. Держите кожу мыши с щипками и вырезать кожу с ножницами от живота до верхней части грудной клетки.
  4. Откройте брюшную полость ниже грудной клетки острыми ножницами.
  5. Поднимите грудину щипками и разрежьте диафрагму; затем, отрезать грудную клетку, чтобы разоблачить грудной полости.
  6. Отрежьте поливу вены чуть выше печени, ножницами.
  7. Давление perfuse (100 мм рт. ст.) артериального дерева в течение 5 минут с прехлафтовой нормальной солевой, содержащей 40 единиц /мл гепарина через левый желудочек, пока легкие и печень не побледнеют. Затем, perfuse с прехиллированным 4% параформальдегида в фосфат-буферных солей (PBS, рН 7,4) в течение 3 мин.
  8. Удалите все мышцы, органы и жир, пока аорта подвергается.
  9. Поместите мышь под рассекающий микроскоп.

2. Рассечение и продольное открытие аорты

  1. Выставить аорту четко под рассекающим микроскопом и удалить соединительные ткани вдоль аорты как можно более чистыми, с тонкими щипками и парой тонких ножниц (Рисунок 1).
  2. Вскрыть грудной аорты от сердца до келья ствола с парой деликатных ножниц и положить аорты в 6 см клеточной культуры блюдо с PBS. Отрежьте открытые аорты продольно, вдоль меньшей кривой, и вдоль большей кривой, пока прямой сегмент не будет выполнен. Разрежьте три ветви аортированной арки, в том числе неноминец, левой общей сонной и левой подклавиаской артерии, с микросцинсорами, как показано на рисунке 2.

3. Предварительная обработка и иммуностоирование аорты

  1. Пермяки аорты с 0,1% полиоксиэтилен овтрил фенил эфир в PBS в течение 10 минут и блокировать его с 10% нормальной козьей сыворотки в Tris-буферный солен (TBS), содержащий 2,5% полисорбат 20 для 1 ч при комнатной температуре в 12-хорошей клеточной культуры пластины.
  2. Далее, инкубировать аорту с 5 г/ мл кролика анти-VCAM-1 и 5 г / мл крысы анти-VE-кадерин в блокирующем буфере, на ночь при 4 градусах Цельсия.
  3. После промывки образца 3x с мытьем раствора (TBS, содержащий 2,5% полисорбат 20), применять флуоресценции конъюгированных вторичных антител (1:1,000 разбавления, Alexa Fluor 555-помеченный анти-кролик IgG и Alexa Fluor 488-метка анти-крыса IgG) для 1 h Температура. Промыть 3x в стиральном растворе.
  4. Противостоит аорте с 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (1 мкг/мл) в течение 10 минут и промыть его 3x в стиральном растворе.

4. Монтаж аорты на стеклянной горке

  1. Поместите аорту на крышку с поверхностью светила вниз и медленно переместите ее в раствор установки антифадейда, ранее сброшенного на крышку. Аккуратно растянуть аорту, чтобы сохранить образец плоским.
  2. Обратный крышкой и положить его на слайд стекла. Необходимо позаботиться о том, чтобы не допустить, чтобы между образцом и стеклом оставались пузырьки воздуха.

5. Наблюдение за аортой

  1. Изучите аорту с помощью конфокального микроскопа с лазерным сканированием.
  2. Анализ цветовых интенсивностей различных каналов из желаемой области в en face images с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

12-недельная мышь C57BL/6 была усыплена и проникнута нормальным сольным раствором, содержащим 40 единиц/мл гепарина, а затем прехиллированной 4% параформида. Мышь аорта была выставлена под рассекающим микроскопом(рисунок1), расчленена и разрезана продольно (рисунок2). En лицо иммунофлуоресценции окрашивание сосудистых эндотелиальных клеток было выполнено, как показано на рисунке 3 и таблице 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелий подвергается воздействию многочисленных проатерогенных факторов, включая липиды, воспалительные посредники, и жидкость сдвига стресс1,11,12. Прямое наблюдение эндотелиальных клеток на месте дает особые преимущества для анализа изменений в морфологии клеток, межклеточных стыков и молекулярных моделей экспрессии в ответ на повреждения стимулов.

Предыдущие исследования предоставили два различны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 81670451, 81770430), Шанхайской программой восходящих звезд (Грант No 17-A1403000), а также Комитетом по науке науки Шанхайского муниципального правительства (Грант No. 14441903002, 15411963700).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антивыцветающий монтировщикServicebioG1401
Тонкие щипцыRWD Life ScienceF11001-11
Деликатные ножницыRWD Life ScienceS12003-09
Рассекающие щипцыRWD Life ScienceF12005-10
Весенние ножницы MciroRWD Life ScienceS11001-08
Полиоксиэтиленоктилфениловый эфир (Triton X-100)AmrescoM143
Polysorbate 20 (Tween 20)Amresco0777
VCAM-1 антителоAbcamab134047
VE-кадгерин антителоBD Biosciences555289
Alexa Fluor 555 меченый антикролик IgGinvitrogenA-31572
Alexa Fluor 488 меченый антикрысиный IgGинвитрогенA-21208
Лазерный сканирующий микроскоп Карл Цейсс

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
  2. Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
  3. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  4. Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
  5. Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
  6. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  7. Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).
  8. Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
  9. Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
  10. Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
  11. Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
  12. Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
  13. Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

VCAM 1VEDAPI

Похожие статьи