Методическая статья

Выявление аминокислотных перепроизводителей с использованием редких Кодон-богатых маркеров

DOI:

10.3791/59331

⸱

24 июня 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование представляет собой альтернативную стратегию к обычным токсичным аналоговым методом в выявлении аминокислотных сверхпроизводителей с помощью редких богатых кодон маркерами для достижения точности, чувствительности и высокой пропускной силы одновременно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для удовлетворения постоянно растущего рынка аминокислот необходимы высокопроизводительные производственные штаммы. Аминокислоты overproducers условно определены путем использования конкуренции между аминокислотами и их аналогов. Однако этот аналоговый метод имеет низкую точность, а надлежащие аналоги для конкретных аминокислот ограничены. Здесь мы представляем альтернативную стратегию, которая позволяет точно, чувствительный и высокопроизводительный скрининг аминокислот с использованием редких кодон богатых маркеров. Эта стратегия вдохновлена феноменом смещения использования кодона в переводе белков, для которого кодоны классифицируются на общие или редкие на основе их частот возникновения в кодирующей ДНК. Перевод редких кодонов зависит от их соответствующих редких переносных РНК (tRNAs), которые не могут быть полностью заряжены аминокислотами cognate под голодом. Теоретически, редкие tRNAs могут быть заряжены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимов общих изоастежителей. Поэтому отсталые переводы, вызванные редкими кодонами, могут быть восстановлены путем кормления или внутриклеточного перепроизводства соответствующих аминокислот. Согласно этому предположению, система отбора или скрининга для выявления аминокислотных производителей устанавливается путем замены общих кодонов целевых аминокислот их синонимами редких альтернатив в генах устойчивости к антибиотикам или генах кодирование флуоресцентных или хромогенных белков. Мы показываем, что протеиновые экспрессии могут быть значительно затруднены включением редких кодонов и что уровни белков положительно коррелируют с аминокислотными концентрациями. Используя эту систему, перепроизводители нескольких аминокислот можно легко отсеивать из библиотек мутаций. Эта стратегия на основе редкого кодона требует только одного модифицированного гена, и усев с меньшей вероятностью избежит выделения, чем в других методах. Он предлагает альтернативный подход для получения аминокислотных производителей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нынешнее производство аминокислот в значительной степени зависит от брожения. Тем не менее, титры и дает для большинства штаммов производства аминокислот ниже растущих требований глобального рынка аминокислот, который стоит миллиарды долларов1,2. Получение высокопроизводительных аминокислотных производителей имеют решающее значение для модернизации аминокислотной промышленности.

Традиционная стратегия для выявления аминокислот overproducers использует конкуренции между аминокислотами и их аналогов в синтезе белка3,4. Эти ана....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструкция плазмидов, выражающих редко-кодон-богатые гены маркера

  1. Выберите ген маркера, который содержит соответствующее количество общих кодонов для целевой аминокислоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для L-лейцина, ген резистентности канамицина kanR, который содержит 29 кодонов лейцина, из которых 27 являются общими кодонами, используется для строительства системы отбора13. Ген gfp, который содержит 17 общих кодонов из 19 кодонов лейцина, или фиолетовый белок-кодируя ген prancerpurple (ppg),который гавани 14 leucine общие кодоны, используется для системы скрининга (Дополнительная таблица 1....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для системы отбора, резкое снижение OD600 для штаммов укрывательство редких кодон-богатых антибиотиков устойчивость гена должны наблюдаться по сравнению с штаммом укрывательство дикого типа гена устойчивости к антибиотикам, когда культивируется в подходящих средний(рисунок 1a). В тех же условиях, уменьшение в клетке OD600 становится более очевидным, как число редких кодонов в гене устойчивости к антибиотикам увеличивается

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количество редких кодонов в генах маркеров и среда отбора или скрининга имеют решающее значение для ингибирования белковых выражений из редко-кодон-модифицированных генов маркера. Если не может быть обнаружено существенное различие между протеиновыми экспрессиями генов дикого типа и их производными, увеличение числа редких кодонов или использование среды с ограниченным и питательными веществами может усилить различия. Однако, если эффект ингибирования слишком силен, протеиновые выражения не могут быть восстановлены даже .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 21676026), Национальной программой научных исследований и разработок Китая (грант No 2017YFD0201400) и Китайским фондом постдокторской науки (грант No 2017M620643). Работы в Институте развития UCLA (Сучжоу) были поддержаны внутренними грантами из провинции Цзянсу и индустриального парка Сучжоу.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилThermo51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit TransgenEM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction KitTransgenEG101-01
Gibson assembly master mixNEBE2611S
Изопропил β-D-1-тиогалактопиранизидSolarbioI8070
L-лейцинSigmaL8000
Считыватель микропланшетовBiotekSynergy 2
n-гексанThermoH3061
ФенилизотиоцианатSigmaP1034
PrancerPurple CPB-37-441ATUMCPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA полимеразаTransgenAP231-01
ТриэтиламинSigmaT0886
Сверхвысокоэффективная жидкостная хроматографияAgilent1290 Infinity II
Wild тип C. glutamicumATCC13032
XL10-Gold E. coli компетентная клеткаAgilent200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 колонкаAgilent959759-902К

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA cod....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

OD600

Похожие статьи