Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Автоматизированная 3D оптическая когеренционная томография для выяснения биофильма Morphogenesis над большими пространственными весами

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59356

⸱

21 августа 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stream Biofilm and Ecosystem Research Laboratory, School of Architecture, Civil and Environmental Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 2Plateforme technique, School of Architecture, Civil and Environmental Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 3Water Chemistry and Water Technology, Engler-Bunte-Institut, Karlsruhe Institute of Technology, 4Thorlabs GmbH

В этой статье

Краткое содержание

Микробные биопленки образуют сложные архитектуры на межфазах и превращаются в сильно зависящие от масштаба пространственные узоры. Здесь мы внедряем экспериментальную систему (жесткое и программное обеспечение) для автоматизированного приобретения наборов 3D оптической когересцены (OCT). Этот набор инструментов позволяет неинвазивную и многомасштабную характеристику биопленки морфогенеза в пространстве и времени.

Аннотация

Биопленки являются наиболее успешным микробным образом жизни и преобладают во множестве экологических и инженерных настройки. Понимание морфогенеза биопленки, то есть структурной диверсификации биопленок во время собрания сообщества, представляет собой замечательную проблему в пространственных и временных масштабах. Здесь мы представляем автоматизированную систему визуализации биопленки на основе оптической когеренционной томографии (ОКТ). OCT является новой техникой визуализации в исследованиях биопленки. Однако объем данных, которые в настоящее время могут быть получены и обработаны, препятствует статистическому выводу о крупномасштабных закономерностях в морфологии биопленки. Автоматизированная система визуализации OCT позволяет покрывать большие пространственные и расширенные временные масштабы роста биопленки. Он сочетает в себе коммерчески доступную систему OCT с роботизированной платформой позиционирования и набором программных решений для управления позиционированием сканирования зонда OCT, а также приобретением и обработкой наборов данных для визуализации 3D биопленки. Эта установка позволяет in situ и неинвазивный автоматизированный мониторинг развития биопленки и может быть дополнительно разработан для сочетания OCT изображений с макрофотографией и микросенсорным профилированием.

Введение

Биопленки являются весьма успешной адаптации микробного образа жизни и эти межфазные и матричные закрытые сообщества микроорганизмов доминируют микробной жизни в естественных и промышленных условиях1,2. Там, биопленки образуют сложные архитектуры, такие как удлиненные растяжки3, рябь4 или грибоподобные колпачки5 с важными последствиями для роста биопленки, структурной стабильности и устойчивости к стрессу6. Хотя многое о биопленки структурной дифференциации было извлечено из работы по моновидовкультуры, выращенные в миниатюрных камер потока, большинство биофильмов очень сложных общин часто в том числе членов всех областях жизни6. Оценивая эти сложные биопленки как микробные ландшафты7 и понимание того, как структура и функция биопленки взаимодействуют в сложных сообществах, таким образом, находится на переднем крае исследований биопленки.

Механистическое понимание морфогенеза сложных биопленок в ответ на экологические сигналы требует тщательно разработанных экспериментов в сочетании с пространственно и временно решенными наблюдениями биопленки физической структуры по всей актуальности весы8. Однако неразрушающие наблюдения за ростом биопленки в экспериментальных системах были серьезно ограничены такими логистическими ограничениями, как необходимость перемещения образцов (например, в микроскоп), часто повреждающих тонкую структуру биопленки.

Представленный здесь протокол вводит полностью автоматизированную систему, основанную на оптической когеренционной томографии (ОКТ), которая позволяет вести неинвазивный мониторинг биопленогенеза в мезомасштабе (мм диапазоне). OCT является новой техникой визуализации в биопленки исследований с приложениями в области очистки воды и биофоллинг исследований, медицины9 и потока экологии10. В OCT источник света с низкой согласованностью делится на образец и эталонную руку; анализируется интерференция света, отраженного и рассеянного биопленкой (образец руки), и свет эталонной руки. Серия профилей интенсивности осевой нагрузки (A-scans), которая содержит глубоко решенную структурную информацию, приобретается и сливается в B-сканирование (сечение). Серия смежных B-сканов составляет окончательный 3D объем сканирования10. OCT обеспечивает боковое оптическое разрешение в диапазоне около 10 мкм и поэтому хорошо подходит для изучения мезоскопической структурной дифференциации биопленок10,12. Для более подробного описания OCT, обратитесь к Drexler и Fujimoto13и Ферчер и коллеги14. Хотя поле зрения одного OCT xy-scan достигает сотен квадратных микрометров, более крупные модели не могут быть количественно оценены с помощью OCT в одном сканировании. Что касается биопленки в естественных средах обитания, таких как ручьи и реки, это в настоящее время ограничивает нашу способность оценивать биопленки морфогенеза в масштабах, соответствующих физическому и гидравлическому шаблону среды обитания.

Для того, чтобы превзойти эти пространственные пределы и автоматически приобрести ОКТ сканирование, спектральный домен OCT imaging зонд был установлен на 3-осевой системы позиционирования. Установка позволяет получить несколько OCT сканирования в перекрывающихся мозаики картины (плитка сканирования), эффективно достижения томографической визуализации поверхностных участков до 100 см2. Кроме того, высокая точность позиционирования этой системы позволяет надежно контролировать рост и развитие функций биопленки на конкретных участках во время длительных экспериментов. Система является модульной и отдельные компоненты (наоборот, позиционирование устройства и OCT) установки могут быть использованы в качестве автономных решений или гибко сочетаются. Рисунок 1 предоставляет обзор жестких и программных компонентов установки.

Система была протестирована с коммерчески доступным GRBL-контролируемым устройством позиционирования CNC(Таблицаматериалов). Рабочие расстояния этой конкретной платформы позиционирования составляют 600-840-140 мм, с указанной производителем точностью 0,05 мм и программируемым разрешением 0,005 мм. GRBL является открытым исходным кодом (лицензия GPLv3), высокопроизводительным управлением движением для CNC Устройств. Таким образом, каждый GRBL основе (версия Nogt; 1.1) позиционирование устройство должно быть совместимо с руководящими принципами и пакетами программного обеспечения, представленных здесь. Кроме того, программное обеспечение может быть адаптировано к другим stepmotor контроллеров с STEP-DIR ввода типа с несколькими изменениями.

Устройство OCT, используемое для оценки производительности системы(Таблица материалов) имеет низкий источник слаженный свет с центральной длиной волны 930 нм (ширина пропускания 160 нм) и регулируемой длиной и интенсивностью эталонной руки. В приведенном здесь примере также использовался адаптер погружения для погружения зонда OCT в протекающую воду(ТаблицаМатериалов). Программное обеспечение пакет, разработанный здесь для автоматизированного приобретения сканирования ОКТ критически зависит от SDK, предоставляемых вместе с конкретной системой OCT, однако, OCT систем ы от того же производителя с различными сканирования линз и центральной длины волн должны быть легко совместимы.

Устройство GRBL управляется веб-сервером, установленным на однобортном компьютере(рисунок 1). Это предоставляет пульт дистанционного управления устройством с любого компьютера с локальной сетью или доступом в Интернет. Устройство OCT управляется отдельным компьютером, что позволяет работать с системой OCT в сторону автоматизированной экспериментальной настройки. Наконец, пакеты программного обеспечения включают библиотеки для синхронизации позиционирования зонда OCT и приобретения сканирования OCT (т.е. для автоматического приобретения наборов данных 3D-изображений в мозаичном шаблоне или в наборе определенных позиций). Определение положения зонда OCT в 3D эффективно позволяет настроить фокусную плоскость специально для (региональных) наборов сканирований. В частности, на неровных поверхностях для каждого сканирования OCT могут быть указаны различные фокусные плоскости (т.е. различные положения в направлении z).

Набор программных пакетов был разработан для обработки необработанных ОКТ-сканирований(таблица 1). Навигация устройства позиционирования, приобретение сканирования OCT и обработка наборов данных выполняются с помощью ноутбуков Jupyter с кодовым кодом Python, которые обеспечивают замечательную гибкость в разработке и оптимизации программного обеспечения. Два отработанных и аннотированных примера таких тетрадей (для приобретения изображений и обработки, соответственно) доступны из https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Они предназначены в качестве отправных точек для настройки метода. Ноутбук Jupyter — это приложение на основе веб-браузера, которое содержит ячейки с аннотированным кодом Python. Каждый шаг содержится в ячейке блокнота, который может быть выполнен отдельно. Из-за разной длины светового пути через скан-объектив (сферическая аберрация)15, сырые сканирование OCT появляются искаженными(рисунок 2A). Мы разработали алгоритм для автоматического исправления этого искажения в приобретенных OCT сканирования (содержится в ImageProcessing.ipynb, Дополнительный файл 1). Кроме того, биопленка морфологии может быть визуализирована как 2D карта высоты, как это было ранее используется в мембранных систем16, и мы иллюстрируем, как высота карты, полученные от сканирования, принятых в плиточный массив могут быть сшиты.

Наконец, функциональность описанной лабораторной установки иллюстрируется с помощью эксперимента с флеймом, в котором биопленка фототрофического потока подвергается градиенту скорости потока.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Настройка устройства позиционирования

  1. Проводите устройство позиционирования на доску микроконтроллера, следуя инструкции в https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
  2. Подключите микроконтроллер к однобортному компьютеру с подключением к Интернету через кабель USB и установите сервер GRBL, как описано в https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Теперь устройство позиционирования должно быть судоходным с веб-страницы, размещенной в http://IP:5020/. Кроме того, устройство позиционирования можно перемещаться по сценарию Python, как показано в первой части работаемого примера ImagesAcquisition.ipynb (Дополнительныйфайл 2).

2. Установка OCT

  1. Установите зонд OCT к позиционирующего устройству с помощью совместимого держателя голубя-хвоста. При необходимости установите адаптер погружения на объектив.
  2. Расположите компьютер и базовый блок ОКТ на скамейке рядом с экспериментом (например, микрофлюидные устройства, камеры потока, флеймы, системы фильтрации). Убедитесь, что оптический шнур (максимальная длина около 1,8 м) свободно перемещается, достаточно долго, чтобы добраться до всех намеченных мест и не мешая экспериментальной установке.
  3. Установите систему OCT вместе с доступным программным обеспечением, как описано производителем.
  4. Установите пакеты программного обеспечения для автоматизированного приобретения сканирования OCT, как описано в https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.

3. Приобретение изображений

  1. Питание в системе OCT и устройстве позиционирования. Убедитесь, что устройство может свободно перемещаться.
  2. Откройте файл config.json в текстовом редакторе. Отспособите файл config.json для настройки параметра приобретения изображения по умолчанию(таблица2), например, рефракционный индекс (1,33 для воды при 20 градусах По Цельсию, 1,00 для воздуха) и папку назначения для приобретенных данных и метаданных.
  3. Определите размер поля обзора (FOV) и количество A-сканов на B-сканирование в config.json.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти два параметра определяют размер вокселей конечного набора данных и размер выходного файла и должны соответствовать оптическому разрешению зонда (размер x-y voxel не должен быть меньше половины оптического разрешения). Количество A- и B-сканирований влияет на пространственную степень, которая будет покрыта, которая торгует-офф против доступного дискового пространства и вычислительной мощности.
  4. Определите границы сигнала вывода OCT сканирования на config.json. Они зависят от типа образца. Поэтому рекомендуется определить эти параметры на основе интенсивности гистограмм набора предварительного сканирования. Сохранить изменения в config.json.
  5. Перейдите зонд OCT к интересуемому сайту. Сосредоточьте образец и отрегулируйте эталонную руку и интенсивность источника света для оптимального качества изображения. Повторите эту процедуру для ряда позиций и обратите внимание на координаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит последующее автоматическое приобретение сканирования OCT вокруг этих ориентиров. Обратите внимание, что длина и интенсивность эталонной руки не могут быть изменены при автоматическом приобретении изображения.
  6. Откройте файл ImageAcquisition.ipynb (Дополнительныйфайл 2) в Записной книжке Juypter. Каждая ячейка содержит код для выполнения определенных задач и может выполняться отдельно через нажатие ячейки Выполнить,или Ctrl - Введите или сдвируй - Введите.
    1. Установите путь к требуемым библиотекам и параметрам конфигурации по умолчанию. Кроме того, определите новый набор временных параметров.
    2. Подключитесь к позиционирующему устройству и инициализировать OCT.
    3. Калибровать устройство позиционирования (т.е. выполнить "самонаводящееся").
    4. Приобретите наборы данных, охватывающие позиции интересов в односканном или мозаичном шаблоне, с указанием числа и перекрытия (например, 30%) соседних плиток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Память выделяется до сканирования, которое оптимизирует использование компьютерных ресурсов. Данные сохраняются в 8 битах, чтобы сохранить пространство для хранения, в папку назначения, определяемую в config.json, используя отметку времени и положение в качестве именования конвенции (т.е. % Y%m%d'%H%M%S'lt;;???; Метаданные, включая параметры OCT и координаты, сохраняются в одной папке в файле.srm с той же конвенцией именования. В зависимости от таких настроек, как FOV и разрешение, размер файла может достигать до 1,5 ГБ на сканирование OCT.
  7. Чтобы избежать аборта при получении данных, убедитесь, что свободное пространство диска имеет достаточное количество дисков или постоянно перемещайте наборы данных OCT на внешний жесткий диск.

4. Коррекция изображения и дисплей

  1. Откройте ноутбук Jupyter ImageProcessing.ipynb (Дополнительныйфайл 1) для работаемого примера обработки изображений OCT (коррекция искажения, фоновое вычитание, расчет высотных карт, сшивание карты высоты).
  2. При необходимости, урожай OCT сканирования для того, чтобы исключить ложные сигналы и переориентировать набор данных (биопленка должна появиться над субстратом).
  3. Правильно для сферической аберрации. Это достигается с помощью алгоритма коррекции, который использует высоко отражающую эталонную поверхность, которая, как известно, плоская (например, нижняя часть флейма, субстрат). Во-первых, алгоритм определяет сетку из 20 х 20 вертикальных линий, регулярно расположенных по кси-плану сканирования OCT. Затем он выбирает круговую область вокруг каждой точки и средние интенсивности сигнала вдоль вертикального профиля(рисунок 2B). Вертикальные профили обрабатываются с помощью модифицированного гауссианского фильтра:
    figure-protocol-1
    где x является входиным сигналом, и его стандартное отклонение, в то время как C определяется, например:
    figure-protocol-2
    Эталонная поверхность локализована как локальная максима в каждом из этих профилей. Ошибочные точки фильтруются в зависимости от положения своих соседей в трех измерениях(рисунок 2C). Наконец,2-го порядка полиномальной поверхности, отражающей искажения, введенные сканирования объектив установлен через эти точки(Рисунок 2C). Установленная поверхность затем используется для перемещения каждого пикселя в z-направление, тем самым получая сплющенный образ. Параметры этого алгоритма должны быть скорректированы с учетом характеристик сканирования OCT.
  4. Правильно для фонового шума. Определите пустую область изображения (обычно выше биопленки) и используйте алгоритм коррекции, чтобы вычесть среднюю интенсивность фона из значений интенсивности изображения для получения окончательного исправленного изображения OCT (Рисунок 2D).
  5. Вычислите карту высоты из набора данных 3D OCT. На этом этапе определите эталонную поверхность, представляющих интерес для конкретного эксперимента (например, субстрата) и соответствующую пороговую интенсивность. Затем используйте алгоритм расчета карты высоты, чтобы вычислить толщину биопленки для каждой координарной маски (x,y) и назначить ее новой 2D-матрице(рисунок 3A). Значения толщины затем присваиваются 2D-матрице размером с исходное изображение в направлениях x и y. Отображается изображение, в котором высота поверхности сообщается как серомасштабное значение(рисунок 3B).
  6. В случае, если несколько ОКТ сканирование сделаны в мозаичном рисунке, определить количество строк и столбцов и сшить соответствующие карты высоты. На рисунке 5 представлены примеры сшитых карт высот, охватывающих широкий диапазон пространственных масштабов и разрешений, достижимых с описанной установкой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы демонстрируем функциональность автоматизированной системы визуализации OCT с помощью эксперимента по флейму, предназначенного для изучения пространственно-временного морфогенеза фототрофических биопленок потока. Постепенно сужая геометрию флеймов индуцированных градиентов в скорости потока вдоль центра флейма (см. справку17).  Височное развитие и структурная дифференциация биопленки контролировалась в течение 18 дней с целью лучшего понимания влияния гидродинамических состояний на биопленочный мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Oct изображение хорошо подходит для решения структур в диапазоне микрометров с FOV в несколько квадратных миллиметров. Таким образом, это мощный инструмент для исследования биопленки10,18. Тем не менее, OCT в настоящее время ограничивается максимальной площадью сканирования 100 - 256 мм2, в то время как биопленки структурные модели часто превышают эту пространственную шкалу19, особенно когда морфологическая дифференциация обусло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Себастьян Шефер работает в компании Thorlabs Inc.

Благодарности

Мы благодарим Маурисио Агирре Моралеса за его вклад в развитие этой системы.  Финансовая поддержка была получена от Швейцарского национального научного фонда t.J.B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ОКТ-зондThorlabsGAN210C1аппарат для визуализации
ОКТ объектив для ОКТ-сканированияThorlabs OCT-LK3-BB
Погружной адаптерThorlabs OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFTNAустройство позиционирования
микроконтроллерArduino Uno R3NA
Одноплатный компьютерRaspberry PINA
камераCanon EOS 7D Mark IINA
объектив камерыCanon MACRO EFS 35 mmNA

Ссылки

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).
  3. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
  4. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
  5. Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
  6. Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
  7. Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
  8. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
  9. Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002(2016).
  10. Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
  11. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  12. Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
  13. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
  14. Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
  15. Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
  16. Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
  17. Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178(2016).
  18. Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
  19. Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
  20. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Автоматизированная система визуализации3D-визуализация биопленоканализ пространственного масштабаобработка изображений ОКТизмерение толщины биопленкисканирование по мозаичному шаблонууправление устройством позиционированияпостроение карты высот
Автоматизированная 3D оптическая когеренционная томография для выяснения биофильма Morphogenesis над большими пространственными весами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.