Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Онкогенный гепатоцит индуцированной ортотопической мыши Модель гепатоцеллюлярного рака, возникающих в настройке воспаления печеночного и фиброза

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59368

⸱

12 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center, University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri-Columbia

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем разработку клинически релевантной модели рака печени, подражая типичные иммунные особенности гепатоцеллюлячного рака (HCC).

Аннотация

Отсутствие клинически релевантной модели животных, касающейся типичных иммунных характеристик гепатоцеллюлярного рака (HCC), значительно затрудняет разъяснение основных механизмов и разработку инновационных иммунотерапевтических стратегий. Для разработки идеальной модели животных recapitulating человека HCC, иммунокомпетентных мужчин C57BL/6J мышей сначала получить углеродный тетрахлорид (CCl4) инъекции, чтобы вызвать фиброз печени, а затем получить гистологически нормальные онкогенные гепатоциты от молодого мужчины SV40 T антиген (TAg)-трансгенных мышей (MTD2) путем внутриселекционной (ISPL) прививки. Андроген, генерируемый у мышей-реципиентов в период полового созревания, инициирует экспрессию TAg под контролем фиченного промоутера. В результате передаваемые гепатоциты становятся раковыми клетками и образуют опухолевые массы в условиях фиброза/цирроза печени. Эта новая модель имитирует инициацию и прогрессирование HCC человека в контексте фиброза печени / цирроза и отражает наиболее типичные особенности человеческого HCC, включая иммунную дисфункцию.

Введение

Гепатоцеллюлярный рак (HCC) является наиболее быстро растущим типом рака в Соединенных Штатах (США)1,2,3. Каждый год, около 850000 новых случаев диагностируется4,5 и 700000 пациентов умирают от этого смертельного заболевания6,7,8,9,10 , что делает его второй по значимости причиной смерти, связанной с раком во всем мире. Управление HCC включает в себя хирургическую резекцию, трансплантацию, абляцию, химиоэмболизацию или системную терапию, такую как sorafenib11. Ранняя диагностика и управление хирургической резекцией или трансплантацией имеют самое высокое общее преимущество выживания4. К сожалению, большинство пациентов, присутствующих на более поздней стадии и требуют управления с абляцией, химиоэмболизацией или сорафениб12. Sorafenib, ингибитор тирозина киназы рецептора (RTKI), был одобрен Пищевых продуктов и медикаментов в 2008 году в качестве единственной системной медикаментозной терапии для лечения нерезектационных HCC. Хотя препарат обеспечивает лишь незначительное увеличение общей выживаемости, с 7,9 до 10,7 месяцев13, он предоставил новую терапевтическую стратегию, которая может быть использована для управления HCC.

Манипулирование иммунной системой для устранения установленных раковых заболеваний является быстро растущей области в исследовании рака14. Иммунные контрольные исследования имеют значительно продвинутые иммунотерапевтические разработки лекарств в лечении рака15,16. FDA одобрило использование антител (Abs) против цитотоксического T-лимфоцита антиген айген 4 (CTLA-4), запрограммированный белок смерти клеток 1 (PD-1), и его лиганд PD-L1 для лечения меланомы, рака легких, головы и рака шеи, и рака мочевого пузыря17, 18 лет , 19 лет , 20. Клинические испытания монотерапии или комбинированной терапии с использованием одного или нескольких антител против PD-1, PD-L1, или CTLA-4 для лечения передовых HCC продолжаются21,22,23, и некоторые испытания показали положительные результаты. В 2017 году FDA предоставило ускоренное одобрение антител против PD-1 для лечения пациентов HCC, которые сопротивляются сорафенибу, но общий процент ответов на эту терапию составляет всего 14,3%. Другие стратегии не были переведены в клиническую практику в это время24,25. Преодоление опухоли индуцированной глубокой иммунной толерантности для улучшения иммунной терапии контрольно-пропускной пункт26; прогнозирование эффективности иммунной контрольно-пропускной терапии; предотвращение побочных явлений, связанных с иммунитетом; оптимизация маршрута администрирования, дозировки и частоты; и найти эффективные комбинации терапии27,28,29все остаются чрезвычайно сложными задачами.

Есть несколько обычных подходов, используемых для индуцирования HCC в мышиных моделях в настоящее время и используются в зависимости от конкретного исследовательского вопроса следователя30. Химически индуцированных моделей мыши HCC с генотоксическими соединениями имитируют злокачественность, вызванную травмами. Модели xenograft через эктопическую или ортотопическую имплантацию клеточных линий HCC подходят для скрининга наркотиков. Ряд генетически модифицированных мышей были разработаны для исследования патофизиологии HCC. Трансгенные мыши, выражающие вирусные гены, онкогены и/или факторы роста, позволяют выявлять пути, участвующие в гепатокарциногенезе. Из-за присущих им ограничений, эти модели не резюмируют типичные иммунные характеристики, наблюдаемые в HCC человека, что значительно препятствует разъяснению основных механизмов и разработке инновационных иммунотерапевтических стратегий14 ,15. Недавно мы создали клинически актуальную модель мурина. Эта новая модель не только имитирует инициации и прогрессирование HCC человека, но и отражает наиболее типичные особенности болезни человека, включая иммунную дисфункцию. Мы охарактеризовали его биологические и иммунологические характеристики. Используя эту новую модель, мы изучили различные иммунотерапевтические стратегии для лечения HCC31,32,33,34,35,36, 37. Эта уникальная платформа позволяет нам изучать механизмы иммунопереносимости, вызванной опухолью, и разрабатывать доказательства концепции терапевтических стратегий для HCC в направлении возможного клинического перевода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, включая животных субъектов были одобрены IACUC в Университете Миссури. Все мыши получали гуманную помощь в соответствии с критериями, изложенными в "Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных". Следующая процедура клеточной изоляции и прививки должна быть выполнена в капюшоне. Все исполнители должны носить стандартное индивидуальное защитное оборудование для обработки мышей и тканей.

1. Индукция фиброза печени и цирроза с инъекцией IP-изгоя углеродного тетрахлорида (CCl4)

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1. (CCl4 является очень опасным реагентом, с ним следует обращаться осторожно и носить химически устойчивые перчатки)

  1. Получить мужчин C57BL/6J мышей, которые от шести до восьми недель (см. Таблица материалов).
  2. Приготовьте 10% раствор CCl4 (v/v) в кукурузном масле в центрифуге. Определить общий объем на основе количества мышей, которые будут введены (см. шаг 1.6).
  3. Используйте соответствующий метод обработки мышей, чтобы выбрать одну мышь для инъекций.
  4. Вручную удерживать мышь с ее псом (абдомина) стороной вверх.
  5. Очистите место инъекции на брюшной стенке мыши путем очистки с 70% алкоголя.
  6. Впрысните мужских мышей C57BL/6J с 160 л раствора CCl4 путем интраперитонеальной (IP) инъекции с использованием 25-калиберной одноразовой иглы.
  7. Убедитесь, что игла проникает только через брюшную стенку (примерно 4-5 мм) с скотобойней вверх и слегка наклонной при 15-20 градусах.
  8. Вводить мышей два раза в неделю в общей сложности четыре недели каждая мышь будет получать в общей сложности восемь инъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через две недели после последней инъекции, обработанные мыши готовы к прививке ISPL онкогенных гепатоцитов от мышей MTD2.

2. Изолирование тегов-трансгенных гепатоцитов от мышей Line MTD2

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите таблицу 1 для рецептов решений.

10x Эрл сбалансированное решение соли без Ca или Mg (EBSS без Ca или Mg)4 г KCl
68 г NaCl
1,4 г NaH2PO4 H2o
10 г декстроза
Добавить воду до 1 литра, рН до 4,32
Пройдите через фильтр
Решение 120 мл 10x EBSS без Ca или Mg
44 г NaHCO3
1,33 мл 1,5 м гепс
10 мл 10 мл EGTA
Добавить воду до 200 мл
Решение 2100 мл 10x EBSS
2,2 г NaHCO3
6,67 мл 1,5 м хепс
Добавить воду до 1 литра
0,75% коллагенеза раствор15 мг коллагеназа типа 1
20 мл раствора 2
Полная средняя2 РПМИ
50 мл FBS
5 мл 100x пенициллин-стрептомицин

Таблица 1: Рецепты решений.

  1. Получить линии MTD2 мышей38 в качестве источника онкогенных гепатоцитов.
  2. Анестезия 5-недельных MTD2 мышей с помощью 2,5% изолюран.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная анестезия будет проверена методом щепотки. Вкратце, используя 2 перста, дайте носу/ноге мыши хорошее сжатие. Если нет реакции на вывод, животное оценивается достаточно глубоко, чтобы начать операцию.
  3. При адекватном успокоительном положении, место мышей в положении на спине и исправить конечности с лентой, чтобы обеспечить адекватное воздействие брюшной поверхности.
  4. Выполните разрез лапаротомии средней линии с помощью ножниц по длине linea alba достаточно большой, чтобы обеспечить адекватное воздействие печени.
  5. Смещение кишечника влево, чтобы обеспечить лучшее воздействие печени и портал триады.
  6. Рассекать над печенью, чтобы разоблачить нижнюю поливу вену (IVC).
  7. Ligate IVC над печенью с помощью зажима артерии.
  8. Возвращаясь к нижней границе печени, используйте иглу бабочки (см. материалы), чтобы получить IV доступ к вене портала. Исправьте катетер вручную.
  9. Последовательно пронизываете печень мыши с помощью инъекционного шприца на уровне 8,9 мл/мин с 15 мл раствора 1, 15 мл коллагеназе раствор 2 и 15 мл раствора 2 через катетер.
  10. Урожай пронизывает печень путем резки и принятия опухолевой массы от MTD2 мышей в 50 мл конической трубки с 10-15 мл PBS.
  11. Удалить PBS и мыть дополнительное время с PBS; не центрифуги на этом этапе.
  12. Разрежьте печень на более мелкие кусочки с помощью ножниц, а затем снова мыть с PBS 2x, чтобы удалить оставшуюся кровь.
  13. Добавьте 5 мл полной среды RPMI к конической трубке и непрерывно фарш печени ножницами на мелкие кусочки (Злт;3 мм) ткань должна плавно пройти через 5 мл пипетки.
  14. Добавьте полный RPMI к окончательному объему 30 мл и приостановите печень с помощью пипетки 5 мл.
  15. Фильтр смешанный раствор с 70 мкм ситечко в 50 мл конической трубки.
  16. Вымойте ситечко несколько раз с полным RPMI и настроить окончательный объем до 50 мл, добавив дополнительные rpMI среды.
  17. Быстро закрутите подвеску центрифугой до максимум 500 об/мин; как только скорость ускоряется до 50 х г,центрифуга должна быть остановлена.
  18. Декант супернатант и приостановить гранулы в 20 мл PBS.
  19. Подсчитайте клетки, используя трипан синий исключение и гемоцитометр, а затем настроить концентрацию клеток до 2,5 х 106/мл для следующей прививки клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход из 5 граммов опухолевой ткани составляет 80 миллионов гепатоцитов с жизнеспособностью

3. Прививание гепатоцитов из мышей MTD2 в печень диких мышей типа C57BL/6J путем инъекций ISPL

  1. Асептический метод следует использовать во всех процедурах
  2. Анестезия CCl4-обработанныхмужчин C57BL/6J мышей с 2,5% изофруран, мышей следует лечить с помощью смазки глаз, чтобы предотвратить высыхание глаз.
  3. Приготовьте шприцы с 200 йл гепатоцитов для инъекций.
  4. При адекватном успокоительном положении мышей с левой стороны вверх.
  5. Бритье весь левый фланг мышей, а затем скраб области, чередуя между 70% алкоголя и бетадин в три раза.
  6. Администрирование 5 мг/кг карпрофена субкутано до хирургического разреза.
  7. Сделайте разрез 1 см на левом фланге параллельно13-му ребро от верхнего экстремального начала чуть ниже мышцы позвоночника.
  8. Определите селезенку, а затем испределите ее с помощью тупых щипцы.
  9. Закрепите селезенку двумя титановыми зажимами среднего размера. Поместите оба клипа между селезенки артерии и вены, оставьте место между клипами, чтобы сократить позже после прививки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы изолировать нижний полюс селезенки, чтобы уменьшить риск посева.
  10. Введите 200 кЛ (0,5 миллиона) подготовленных гепатоцитов в нижний полюс селезенки с помощью иглы 27 G.
  11. Закрепите нижнюю ветвь педиклы (нижние сосуды с селезенки) одним зажимом среднего размера.
  12. Вырежьте селезенку между двумя первоначально размещенными клипами.
  13. Удалить нижний полюс селезенки, которая была непосредственно введена с опухолевыми клетками.
  14. Используйте 3-0 полиглактина 910 прерванных зашивания, чтобы закрыть внутренний мышечный слой.
  15. Используйте стерилизованные стальные зажимы для закрытия наружного слоя кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стальные зажимы предпочтительнее над швами, чтобы избежать животных жевать швы, оставляя зияющую рану.
  16. Администрирование 5 мг/кг карпрофена подкожно после шва.
  17. Поместите всех выздоравливающих животных на температурно-контролируемой грелке и внимательно следите до полного восстановления после наркоза.
  18. Дайте мышам свободный доступ к воде после операции. Если мышь обезвоживается во время операции, вводят подкожные жидкости (1 мл).
  19. Удалите зажимы для кожи на 7-10 дней после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Онкогенные гепатоциты, изолированные от TAg-трансгенных мышей(рисунок 2) были посеяны в печени диких мышей типа внутриселективной инъекцией(рисунок 3). Пересаженные гепатоциты успешно и надежно росли ортотопические опухоли HCC(Рисунок 4) с опухолевым специфическим антигеном SV40 TAg(Рисунок 5) в условиях печеночного воспаления и фиброза(рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С помощью этого протокола мы создали надежную и воспроизводимую модель моверина HCC, которая имитирует инициацию и прогрессирование hCC человека. Клинически, многие факторы риска последовательно вызывают травмы печени, фиброз печени, цирроз печени и заключительной стадии HCC. В нашем протоколе, IP инъекции CCl4 используется для первого производства фиброза печени у мышей дикого типа, что позволяет последующей онкогенных гепатоцитов для формирования опухолей в условиях фиброза печени. Мы обнаружили, что образов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Некому декларировать.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (К. Ф. Стэйвли-О'Кэрролл, PI) и NIH/NCI R01CA208396 (Марк Кестер, Гуанфу Ли, Кевин Ф. Стэйвли-О'Кэрролл).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наркозный аппаратVETEQUIPIMPAC6наркозный аппарат для хирургии
Иглабабочка BD8122963Игла для перфузии печени
C57BL/6 мышейJackson Lab000664 мыши, используемые в прототоле
CarprofenCRESCENT CHEMICAL20402карпрофен для снятия боли
Cell Strainer CORNINGREF 431751Клеточный фильтр, 70&микро; m, для выделения гепатоцитов
ЦентрифугаBeckman CoulterAllegra X-30Rцентрифуга для выделения клеток
Clips Teleflex MedicalREF 523700Титановые клипсы для селезеночного
микроскопаZeissPrimovert Микроскоп для наблюдения за клетками
Мыши Mtd2Н/ДПодарок от доктора Уильяма А. Проведен в Институте рака Розуэлл Парк в 2002 году, содержался в нашей лаборатории
ИглаBDREF 305109BD precisionglide игла, 27G x 1/2 (0,4 мм x 13 мм)
Шовный материалETHICONJ303Hс покрытием VICRYL шовный материал
SV40 T Ag антителоAbcamab16879анти-SV40 Т-антиген антитело для IHC
ШприцBDREF 3096261 мл TB шприц для инъекций клеток
Trypan blueSIGMAT 8154Trypan blue раствор для теста жизнеспособности клеток
Зажимы для ранReflexreflex9, арт. No 201-1000нержавеющая сталь зажимы для закрытия раны

Ссылки

  1. O'Connor, S., Ward, J. W. Hepatocellular carcinoma - United States. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59, 517-520 (2010).
  2. Petrick, J., Kelly, S., Altekruse, S., McGlynn, K., Rosenberg, P. Future of Hepatocellular Carcinoma Incidence in the United States Forecast Through 2030. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 34, 1787-1794 (2016).
  3. Greten, T., Lai, C., Li, G., Staveley-O'Carroll, K. Targeted and Immune-based Therapies for Hepatocellular Carcinoma. Gastroenterology. 156, 510-524 (2019).
  4. Llovet, J., Zucman-Rossi, J., Pikarsky, E., Sangro, B., Schwartz, M., Sherman, M., Gores, G. Hepatocellular Carcinoma. Nature reviews. Disease primers. 2, 16018(2016).
  5. Ding, X., et al. Precision medicine for hepatocellular carcinoma: driver mutations and targeted therapy. Oncotarget. 8, 55715-55730 (2017).
  6. Colombo, M., Maisonneuve, P. Controlling liver cancer mortality on a global scale: still a long way to go. Journal of Hepatology. 67, 216-217 (2017).
  7. Llovet, J., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362, 1907-1917 (2003).
  8. Parkin, D., Bray, F., Ferlay, J., Pisani, P. Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. International Journal of Cancer. 94, 153-156 (2001).
  9. Thomas, M., Zhu, A. Hepocellular carcinoma: the need for progress. Journal of Clinical Oncology. 23, 2892-2899 (2005).
  10. Llovet, J., Bruix, J. Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 48, 1312-1327 (2008).
  11. Bruix, J., Sherman, M. Management of hepatocellular carcinoma: an update. Hepatology. 53, 1020-1022 (2011).
  12. Pang, T., Lam, V. Surgical management of hepatocellular carcinoma. World Journal of Hepatology. 7, 245-252 (2015).
  13. Llovet, J., et al. Design and endpoints of clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of the National Cancer Institution. 100, 698-711 (2008).
  14. Mueller, K. Cancer immunology and immunotherapy. Realizing the promise. Introduction. Science. 348, 54-55 (2015).
  15. Gajewski, T., Schreiber, H., Fu, Y. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14, 1014-1022 (2013).
  16. Ribas, A., Wolchok, J. Combining cancer immunotherapy and targeted therapy. Current Opinion in Immunology. 25, 291-296 (2013).
  17. Postow, M., Callahan, M., Wolchok, J. Immune checkpoint blockade in cancer therapy. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33, 1974-1982 (2015).
  18. Gao, J., et al. VISTA is an inhibitory immune checkpoint that is increased in ipilimumab therapy in patients with prostate cancer. Nature Medicine. 23, 551-555 (2017).
  19. Hahn, A., Gill, D., Pal, S., Agarwal, N. The future of immune checkpoint cancer therapy after PD-1 and CTLA-4. Immunotherapy. 9, 681-692 (2017).
  20. Remon, J., Besse, B. Immune checkpoint inhibitors in first-line therapy of advanced non-small cell lung cancer. Current Opinion in Oncology. 29, 97-104 (2017).
  21. Kudo, M. Immune checkpoint blockade in hepatocellular carcinoma: 2017 update. Liver Cancer. 6, 1-12 (2017).
  22. Kudo, M. Immune checkpoint inhibition in hepatocellular carcinoma: Basics and ongoing clinical trials. Oncology. 92, 50-62 (2017).
  23. Breous, E., Thimme, R. Potential of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 54, 830-834 (2011).
  24. Sprinzl, M., Galle, P. Facing the dawn of immunotherapy for hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 59, 9-10 (2013).
  25. Liu, D., Staveley-O'Carroll, K., Li, G. Immune-based therapy clinical trials in hepatocellular carcinoma. Journal of Clinical Cell Immunology. 6, 376(2015).
  26. Greten, T., Wang, X., Korangy, F. Current concepts of immune based treatments for patients with HCC: from basic science to novel treatment approaches. Gut. 64, 842-848 (2015).
  27. Koster, B., de Gruijl, T., van den Eertwegh, A. Recent developments and future challenges in immune checkpoint inhibitory cancer treatment. Current Opinion in Oncology. 27, 482-488 (2015).
  28. Johnson, D., Sullivan, R., Menzies, A. Immune checkpoint inhibitors in challenging populations. Cancer. 123, 1904-1911 (2017).
  29. Li, H., et al. Programmed cell death-1 (PD-1) checkpoint blockade in combination with an mTOR inhibitor restrains hepatocellular carcinoma growth induced by hepatoma cell-intrinsic PD-1. Hepatology. 66, 1920-1933 (2017).
  30. Heindryckx, F., Colle, I., van Vlierberghe, H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research. International Journal of Experimental Pathology. 90, 367-386 (2009).
  31. Qi, X., et al. Development of inCVAX, in situ cancer vaccine, and its immune response in mice with hepatocellular cancer. Journal of Clinical and Cellular Immunology. 7, 438(2016).
  32. Qi, X., et al. Development of a radiofrequency ablation platform in a clinically relevant murine model of hepatocellular cancer. Cancer Biology and Therapy. 16, 1812-1819 (2015).
  33. Liu, D., et al. Sunitinib represses regulatory T cells to overcome immunotolerance in a murine model of hepatocellular cancer. Oncoimmunology. 7, 1372079(2017).
  34. Staveley-O'Carroll, K., et al. In vivo ligation of CD40 enhances priming against the endogenous tumor antigen and promotes CD8+ T cell effector function in SV40 T antigen transgenic mice. Journal of Immunology. 171, 697-707 (2003).
  35. Avella, D., et al. Regression of established hepatocellular carcinoma is induced by chemoimmunotherapy in an orthotopic murine model. Hepatology. 55, 141-152 (2012).
  36. Li, G., et al. Successful chemoimmunotherapy against hepatocellular cancer in a novel murine model. Journal of Hepatology. 66, 75-85 (2017).
  37. Li, G., et al. Nanoliposome C6-ceramide increases the anti-tumor immune response and slows growth of liver tumors in ice. Gastroenterology. 154, 1024-1036 (2018).
  38. Held, W., et al. T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene. EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).
  39. Hanahan, D., Weinber, R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

T SV40
Онкогенный гепатоцит индуцированной ортотопической мыши Модель гепатоцеллюлярного рака, возникающих в настройке воспаления печеночного и фиброза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.