Библиотеку ТРИФОСФАТЫ/sgRNA был применен для допроса белка кодирование генов. Однако возможности библиотеки sgRNA раскрыть функцию CTCF границы в регуляции генов остается неизведанной. Здесь мы описываем библиотеки конкретных sgRNA Гомеозисных локусов для выяснения функцию CTCF границ в Гомеозисных локусов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Гомеозисные Локусов Focused ТРИФОСФАТЫ/sgRNA библиотека скрининга выявление критических CTCF границы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фактор CCCTC-привязки (CTCF)-опосредованной, стабильной, топологически связывания доменов (ТЗЖ) играют важную роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs. CTCF играет важную роль в регулировании пространственных и временных выражение Гомеозисных генов, которые контролируют эмбрионального развития, патронирования тела, кроветворения и leukemogenesis. Однако остается неизвестным, ли и как HOX локусов связанные CTCF границы регулирования организации хроматина и экспрессии Гомеозисных генов. В текущем протоколе конкретные sgRNA пула библиотека ориентации всех сайтов связывания CTCF в HOXA/B/C/D локусов был создан для изучения последствий нарушения границ связанного CTCF хроматина на TAD формирования и Гомеозисные гены выражение. Через ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генетический скрининг, сайт связывания CTCF, расположенный между HOXA7/HOXA9 генов (CBS7/9) были определены как критические регулятор онкогенных хроматина домена, а также имеет важное значение для поддержания внематочная Гомеозисные гены шаблоны выражений в переставить MLL острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Таким образом, эта библиотека sgRNA, скрининг подход обеспечивает новые идеи в CTCF при посредничестве Организации генома в определенных генных локусов и также обеспечивает основу для функциональных характеристик аннотированный генетических нормативных элементов, как кодирование и ««некодирующей, во время обычных биологических процессов в эпоху пост человеческого генома проекта.
Введение
Недавние исследования взаимодействия генома показали, что форм ядерного генома человека стабильные топологически связывая доменов (ТЗЖ), которые сохраняются в различных видов и типов клеток. Организация генома в отдельные домены облегчает и ограничивает взаимодействие между регуляторных элементов (например, усилители и промоутеров). Коэффициент CCCTC-привязки (CTCF) связывается с TAD границ и играет решающую роль в ограничение взаимодействия элементов ДНК, которые находятся в соседних TADs1. Однако, генома широкий CTCF привязки данных показал, что, хотя CTCF главным образом взаимодействует с же ДНК сайтов в различных типов клеток, он часто функ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. CTCF sgRNALibrary дизайн с использованием онлайн инструмент
- Дизайн sgRNA ориентации сайтов связывания CTCF в человека HOX локусов в конструкторе генетических возмущений платформы (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
- Синтезировать в общей сложности 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs ориентации 303 случайные ориентации генов, 60 позитивные элементы, 500 человека ненацеливания контроля и 207 CTCF элементы или lncRNA ориентации генов (рис. 1, Таблица 1). Каждый элемент нацеленности ДНК является мишенью для 5-10 различных sgRNAs.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ТРИФОСФАТЫ-Cas9 технология является мощным исследовательского инструмента для функциональных геномных исследований. Он быстро заменить обычные генов, изменения методов и имеет высокую полезность для генома широкий и отдельных приложений, ориентированных на ген. Здесь, первый индивидуально клонированных конкретных локусов ТРИФОСФАТЫ-Cas9-одетые sgRNA библиотека содержит 1070 sgRNAs, состоящий из sgRNAs ориентации 303 случайные ориентации генов, 60 позитивные элементы, 500 человека ненацели.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Белок кодирование гена, связанные с sgRNA библиотеки были применены в системе функциональной скрининг для выявления генов и сетей регулирования конкретных клеточных функций через sgRNA обогащения24,25,26 ,27,28. Несколько некодирующих региона, относящиеся sgRNA библиотеки были также показаны в ген специфического функциональных экранов дистальных и проксимальн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.
Благодарности
Авторы также поблагодарить Николая Cesari для редактирования рукопись. Работа была поддержана субсидии от национального института здравоохранения (с.х., R01DK110108, R01CA204044).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Липофектамин 3000 реактив | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| протеиназа K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| пуромицин | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 клетки | Технологии жизни | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 лигаза | Биолаборатории Новой Англии | M0202S | |
| QIAquick Набор для извлечения геля | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR набор для очистки | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ СИБР&рег; Зеленый одношаговый набор | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco' s Модифицированный Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Пенициллин/стрептомицин/L-глутамин | Технологии жизни | ||
| Концентратор Lenti-X | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| Буфер ТАЭ | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Сюрвейер® Наборы для обнаружения мутаций | Интегрированные технологии ДНК | 706020 | |
| Biorad Универсальный капюшон II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Центрифуга 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Цифровые сухие ванны/блочные обогреватели | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| серия TSX Сверхнизкие морозильники | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Инкубаторы | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Класс II Шкаф биологической безопасности | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Легенда и торговля; Центрифуга серии XT/XF | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Водяные бани | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific&торговля; Locator™ Плюс стоечные и коробочные системы | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Сенсорная система обнаружения ПЦР в реальном времени | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Термоамплификатор | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Сова и торговля; EC300XL2 Компактный блок питания | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Сова и торговля; EasyCast™ B1 Мини гелевые системы электрофореза | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Вращатель труб и вращатели | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Инкубационный мини-шейкер | VWR International | 12620-942 | |
| Аналитические весы MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX и DS-11 FX+ Спектрофотометр | DeNovix Inc. | ДС-11 FX |
Ссылки
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global an....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
