Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Западный blotting — это метод, который обычно используется для выявления и количественной оценки выражения протеина, в том числе в гомогенатах ткани или экстрактов. С годами эта техника привела к многие достижения в области фундаментальных и клинических исследований, где она может использоваться как средство диагностики для выявления наличия болезни^1,2. Западный blotting был впервые описан в 1979 году как метод для передачи белки от полиакриламидных гелей нитроцеллюлоза листы и впоследствии визуализировать белки, используя вторичные антитела, которые были либо радиоактивно конъюгированных флуоресцеин, помечены или пероксидаза³. Путем разработки коммерчески доступные комплекты и оборудование Западный blotting методы все более стандартизированной и упрощенный с годами. Действительно техника теперь легко осуществляется учеными с различной стола и уровни опыта. Однако как с много аналогичные экспериментальные методы, результаты анализов иммуноблоттинга легко влиянием выбор, сделанный в разработке и осуществлении эксперимента. Важно, таким образом, что доступность стандартизированных западной blotting методы не заслонять необходимость тщательного планирования экспериментальных и дизайн. Экспериментальная соображения включают, но не ограничиваясь, образец подготовки и обработки, отбора и проверки антител для обнаружения протеина и эффективность передачи гель мембраны особенно малых или больших (< 10 или > 140 кДа) белки^4,5,6,,78,9. Качество белка исходного образца играет значительную роль в определении результатов последующих Западный анализ помаркой. Как белка могут быть извлечены из различных образцов и источников, включая линии клеток, тканей животных моделей и ткани трупа человека, последовательность обработки и обработки требуется для получения воспроизводимых результатов. Например когда требуется длительное хранение образцов для извлечения белков, важно понимать, что, хотя белок обычно стабилен при температуре-80 ° C, были различия в стабильности белка извлеченные протеины и нетронутыми тканей при температуре-80 ° C о¹⁰. Кроме того чтобы получить воспроизводимые оценки количества белка, последовательной гомогенизации образцов имеет решающее значение. Оптимизации различных лизис буферов и гомогенизации методы (например, по сравнению с автоматизированных методов ручной гомогенизации) могут потребоваться перед началом крупномасштабного количественный эксперимент.

Нормализация стратегий исправить для загрузки и количественной оценки изменчивости белка необходимо получить надежные, количественные результаты экспрессии белков. Уборка номера белков, таких как β-актина, α-тубулина, β-тубулина и Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) традиционно использовались для нормализации уровня белка для количественной оценки. Однако нормализации конкретные хозяйственные белки для целей количественной оценки чаще критикуют за последние несколько лет^11,12. Например можно изменить выражение уборки белков через различные этапы развития^13,14, через ткани из той же животных⁴и под различные болезни условия^{4,15 ,16,17}. Таким образом использование конкретных уборки белков ограничивает возможности более сложных сравнений между выражение протеина из различных тканей, в разных timepoints и в различных экспериментальных условиях. Альтернатива для уборки белки для управления для белка загрузки вариации является использование общего белка пятно (TPS) что этикетки и визуализирует всех белков, присутствующих в образце. TPS позволяет сигнал нормализации на основе общего белка нагрузки вместо того, чтобы уровень одного определенного белка и, следовательно, количественная оценка TPS сигнала должна быть сопоставимой и воспроизводимые независимо от экспериментальных условий, образец типа или развития timepoint . Примерами общего белка пятна Пуансо, пятно свободный гели, R-350 Кумасси, рубиново-Sypro, Epicocconone, Amydo черный и Cy5 (обзор в ссылка 18). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения и выбор метода зависит от времени и средств, а также экспериментальная установка^4,18.

Наряду с использованием TPS исправить для загрузки в мембране и количественной оценки изменчивости, необходимо сравнить образцы между различными мембраны, особенно при выполнении анализ выражения протеина крупномасштабных. Однако изменчивость в таких факторов, как привязка эффективности и общей белок интенсивность пятно антитела могут вводить далее изменчивость между образцы протеина, которые анализируются на отдельных гели и мембран. Для надежной количественной оценки в этой ситуации поэтому необходимо ввести еще один шаг нормализации для учета изменчивости между мембраной. Это может быть достигнуто, включая стандарт внутренней нагрузки на каждом отдельно проанализированы мембран, которые является неизменным через эксперименты. Этот стандарт может принимать форму любой белок lysate, который может быть получен в достаточных количествах для использования во всех мембраны, включены в эксперимент. Здесь мы используем lysate мыши мозга (полученные от 5 день старых мышей управления), как легко гомогенизированных мозга и полученный белка lysate содержит значительное количество белка в высокой концентрации. Загрузка внутренний стандарт в трех экземплярах позволяет образцы на отдельных мембраны для нормализации и сравнивается непосредственно.

Здесь мы описываем подробный протокол, который мы разработали, чтобы позволить нам для проведения сложных сравнений белка выражение вариации различных тканей, мыши модели (включая модели заболеванием) и развития timepoints¹⁹. Объединив флуоресцентный TPS с использованием внутренней нагрузки стандарта, мы смогли преодолеть существующие ограничения в количество образцов и экспериментальных условий, которые можно сравнивать в рамках одного эксперимента. Такой подход расширяет использование методов традиционной западной помарки, тем самым позволяя исследователей, чтобы лучше изучить белков через различных тканей и образцы.

Ткани для этой процедуры были получены из исследований на животных, которые были утверждены Комитетом по внутренней этики на Эдинбургском университете и были исполнены в соответствии с институциональной и UK Home Office правила под руководством соответствующих личные и лицензии.

Примечание: Этот протокол был оптимизирован с помощью стандартизированных, коммерчески доступные наборы и реагенты для повышения воспроизводимость (см. Таблицу материалы).

1. подготовка проб

1. Экстракции белка
   1. Передача оснастки замороженные клетки или образцов ткани от-80 ° C на сухой лед, оттепели на льду и мыть в соответствии с лед холодной 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) (сведения о тканях и PBS моет, см. таблицу 1). Избегайте ненужных замораживания оттаивания циклов, как это повлияет на качество белка.
   2. Добавить radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера (25 мм трис-HCl (рН 7,6), 150 NaCl, 1% NP-40, Дезоксихолат натрия 1%, 0.1% SDS) содержащий 1 x ингибитор протеазы для каждого образца, используя оптимальный объем за вес ткани (см. Таблица 1 рекомендации).
      Примечание: В зависимости от приложения, тип и количество гомогенизации буфера может понадобиться дальнейшей оптимизации.
   3. Используйте ручные электрические гомогенизатор с полипропиленовой пестиком для гомогенизации образцы тканей. Между каждой выборки мыть пестиком в двойной дистиллированной воде и насухо чистой ткани. Измените пестик между различных экспериментальных условий и тканей.
   4. Оставьте образцы на льду за 10 мин после гомогенизации. Центрифугуйте образцы на > 10000 x g при 4 ° C на 10 мин.
   5. Передать супернатант новой трубки на льду не нарушая гранулы. Супернатант это образец протеина. Хранить извлеченные белков-80 ° c или непосредственно приступить к измерению концентрации белка.
2. Количественная оценка и нормализации концентрации протеина
   1. Измерьте концентрацию протеина используя assay bicinchoninic кислоты (BCA). Подготовка смесь пробирного BCA согласно инструкциям производителя в 96-луночных оптические пластины с помощью 200 мкл BCA смеси в скважины.
      Примечание: Другие методы количественной оценки таких Лоури и Брэдфорд анализов также может использоваться для определения концентрации протеина до тех пор, как концентрация белка количественно последовательно через эксперименты.
   2. Подготовить бычьим сывороточным альбумином (БСА) стандартов на повышение концентрации в трех экземплярах и 1 мкл каждого образца протеина в двух экземплярах. Инкубируйте 96-луночных пластины в блоке разогретой тепла при 60 ° C в течение 10 минут или дольше, если концентрация белка, как ожидается, будет низким.
   3. После инкубации, измерять поглощение на 560 Нм, с помощью пластины читателя.
   4. Экспортируйте измерения читателя пластины и рассчитать концентрацию протеина путем сравнения значений средняя absorbance каждого образца для стандартной кривой, полученные с использованием стандарта белка. Значение R-квадрат для стандартной кривой должна быть больше или равен 0,98 точно оценить концентрацию белка образца.
   5. Нормализует количество белка путем подготовки разведения образцов белка в буфер образца и ультрачистая вода. Общий объем может корректироваться в зависимости от типа используемых геля. Загрузка 30 мкг белка на Лейн как начальной суммы рекомендуется. Добавить восстановитель например Дитиотреитол (DTT; конечная концентрация 5 мм) или бета меркаптоэтанол (конечная концентрация 200 мм) для каждого образца, как требуется. Пипетка неразбавленном бета меркаптоэтанол в зонта.
   6. Проинкубируйте образцы в блоке тепла при 70 ° C на 10 мин, коротко образцы на льду, вихрь и спин вниз для сбора. Держите на льду до загрузки геля.

2. гель-электрофорез белков образцов

1. Устройство и гель, Настройка
   1. Установка градиента бис-трис сборного 4 – 12% гель (см. Таблицу материалы) в системе палаты электрофореза геля. Промойте гели, используя двойной дистиллированной воды перед использованием.
      Примечание: В зависимости от размера, взаимодействия и обилием протеина интереса, гели с различным уклоном, буферизация агента или хорошо размер и число может использоваться.
   2. Добавьте 500 мл 1 x MES SDS работает буфер, разбавленных в двойной дистиллированной воды в бак. Осторожно снимите гребень с Гели после добавления идущий буфер не нарушая скважин в штабелируя гель.
2. Белка загрузки
   1. Загрузите 3.5 мкл белка стандарта в колодец. В зависимости от примера макета Загрузка белка лестница на обе стороны геля может помочь в более точной оценки размера протеина. Используйте гель острым концом загрузки советы для более точной загрузки образца.
   2. При использовании внутреннего стандарта для нормализации между мембраны (см. шаг 5 ниже и обсуждения), нагрузка на сумму, которая равна других образцов в первых 3 скважины рядом с лестницы белка.
   3. Нагрузка 30 мкг каждого образца в оставшихся скважинах. Добавьте 1 x буфер образца все пустые скважины.
3. Электрофорез
   1. Соберите танк гель после загрузки образцов. Выполнение примеров через штабелируя гель на 80 V за 10 мин, после чего 150 V для дополнительных 45-60 мин.

3. белка передачи

Примечание: Белка передачи в этот протокол выполняется с использованием коммерчески доступных полусухое blotting системы (см. Таблицу материалы) для быстрого и последовательного результатов.

1. Подготовить белка передачи предварительного замачивания фильтровальную бумагу в двойной дистиллированной воде и обеспечение гель нож, пластиковые Пастер пипетки, blotting ролика и щипцы готовы к использованию.
2. Откройте стек передачи, тщательно удалив все упаковочной пленки. Удалить вершину из стека снизу и отложите его в сторону. Быстро смочите мембраны на дно стека с несколькими каплями электрофореза работает буфер (2-3 мл). После передачи стек является открытым, важно предотвратить высыхание PVDF мембрану.
3. После остановки электрофореза, откройте сборного гель гель ножом и отрезать штабелируя гель. Вырежьте гель вокруг его края, чтобы освободить его от пластиковые литой. Держите нож гель, влажные для предотвращения повреждения геля.
4. Соберите стек передачи снизу вверх: дно стека (содержащие PVDF мембрану), гель белка, фильтровальная бумага. Используйте blotting ролик удалить все пузырьки воздуха. Место в топ стек поверх фильтровальная бумага и рулон стек снова, чтобы удалить пузырьки воздуха. Не нажимайте слишком сильно, поскольку это может привести к гель деформируется во время белковых передачи.
5. Перевести весь стек в устройство передачи с электрода на левой стороне устройства и поместите гель Губка на вершине стека, таким образом, чтобы он выравнивался соответствующих электрических контактов на устройстве. Закройте крышку, выберите и запустите соответствующую программу (20 V 7 мин это рекомендуется начинать).
6. Когда закончите, оставьте крышку закрытой за 2 мин, чтобы стек остыть и предотвращения высыхания мембраны. Удаление передачи стек и вырезать мембраны к размеру геля. Вымойте отрезока мембрана быстро с двойной дистиллированной водой перед продолжением пятно общего белка.

4. общего белка окраски

Примечание: Использование флуоресцентного обнаружения обеспечивает существенную выгоду более традиционные подходы (например, обнаружение стэк), как линейный диапазон и чувствительность может быть намного лучше контролируемые⁴. Таким образом, в шагах 4 и 5, флуоресцентный TPS и флуоресцентные вторичные антитела используются (см. Таблицу материалы).

1. Ролл мембраны в 50-мл пробирку с стороной внутрь белка. Из-за светочувствительность флуоресцентные TPS и вторичные антитела все последующие шаги осуществляются в темноте.
2. Добавьте 5 мл раствора пятно белков (см. Таблицу материалы) и инкубировать на ролик 5 минут при комнатной температуре. Потому что TPS и мыть буфер содержит метанола, выполнения этих шагов в зонта.
3. Отменить решение окрашивания и мыть дважды быстро с 5 мл промывочного раствора (6,3% уксусной кислоты в 30% метанола). Установите трубку кратко обратно на ролик между мыть шаги. Промойте мембрану кратко с ультрачистая вода перед продолжением.

5. Блокирование, Антитело инкубации и обнаружения

1. Блокирование мембраны: добавить 3 мл блокировки буфера (см. Таблицу материалы) на тюбик 50 мл, содержащие мембраны. Проинкубируйте мембрану на ролике за 30 мин при комнатной температуре. В зависимости от выбора антител тип блокировки буфера может потребоваться оптимизация.
2. Основное антитело инкубации
   1. Отменить блокирование буфера и заменить основное антитело на соответствующие, оптимизированный концентрации (рис. 1 и 2: мышь анти SMN, 1:1, 000, разбавленных в блокирующем буфере).
      Примечание: Адекватная оптимизация первичных антител должно включать подтверждение, что антитела обнаруживает белковый продукт нужного размера, хотя показаны не или минимальный привязки к другим, неспецифическая белковых продуктов. Если это возможно проверить и сравнить несколько антител против протеинов интереса.
   2. Проинкубируйте мембрану на ролике на ночь при 4 ° C. На следующий день, удалить раствор антител и мыть 6 раз за 5 мин с ПБС на ролике при комнатной температуре (RT).
3. Вторичное антитело инкубации
   1. Подготовьте конкретные вторичное антитело на 1:5,000 против принимающей основное антитело в блокирующем буфере 5 мл. Другие вторичные антитела могут потребовать другие разведениях или использование альтернативных блокировки буферов.
   2. Проинкубируйте мембрану с решением вторичное антитело на ролике за 1 час на RT. После инкубации мыть мембрана 30 минут три раза с ПБС на ролике.
   3. Сухой мембраны и держать мембраны, защищенном от света, с помощью алюминиевой фольги до обнаружения. Мембраны может храниться при температуре 4 ° C для длительного хранения.
4. Получение изображения
   1. Войдите на компьютер, прилагаемый к сканеру. Место мембраны на сканере с белком лицевой стороной вниз и выберите область сканирования в программном обеспечении.
   2. Оптимизировать интенсивности лазера для обоих (700 Нм до 800 Нм) каналы, подтвердив происходит не насыщение. Получение изображений в обоих каналах и экспортировать изображения для дальнейшего анализа (шаг 6).

6. Западный анализ помаркой и количественная оценка

Примечание: Эти рекомендации основываются на свободно доступного программного обеспечения имидж студия. Однако, сопоставимого анализа также может быть сделано с помощью других программных пакетов, таких как ImageJ.

1. Импорт файла: создать локальную рабочую область на компьютере используется для анализа. Это создает базу данных файлов изображений для приобретенных западной помарки. Импорт файлов, полученные на сканер и выберите изображение для анализа.
2. TPS анализ
   1. Отображение 700 Нм канал для отображения общего белка, окрашивание результат. Пример изображения TPS входит на рисунке 1 в котором разных тканях от новорожденных (P5) (рис . 1A-B) и 10 - неделя старый мышей (Рисунок 1 C-D) сравниваются напрямую. Аналогично на рисунке 2 показан пример прямое сравнение ткани головного мозга от мышей разных возрастов.
   2. Выберите вкладку анализ в верхнем правом углу и выберите Добавить прямоугольник для определения области, представляющие интерес для нормализации (рис. 1B, D). Скопируйте и вставьте первый прямоугольник области на каждый индивидуальный образец обеспечить определенную область на одинаковый размер для всех проанализированных полос.
   3. Скопируйте результат из вкладки формы в левом нижнем углу программного обеспечения.
3. Количественная оценка
   Примечание: Оптимальный подход для количественной оценки образцов зависит от экспериментальный дизайн. Здесь мы предоставим наглядным примером обнаружения выживания мотонейрона белка (Smn; ключевой белок участвует в нервно-мышечные заболевания спинальной мышечной атрофии^20,21), что известно к снижению с течением времени ¹⁹ и как нормализация Smn интенсивности сигнала на TPS обеспечивает надежные оценки развития выражения протеина.
   1. Рисунок 2 показывает снижение экспрессии Smn с увеличением возраста животного с TPS как белок, загрузки элемента управления. Повторите шаг 6.2.1-6.2.3 для количественного определения белка загрузки (рис. 2B). Повторите шаг 6.2.1-6.2.3 на канале 800 Нм (рисунок 2A) для анализа протеина интереса.
   2. Скопируйте результаты от TPS и протеин интереса в программу электронных таблиц. На таблицу сначала нормализовать белка, загрузки путем определения высокий сигнал TPS и разделив каждый TPS сигнал значение, это значение для получения нормализованных белка, загрузки значения.
   3. Разделите 800 Нм сигнал значение из каждого индивидуального образца на соответствующее нормализованное белка рассчитать коэффициент выражение относительного белка в различных образцах.
   4. После первой нормализации Сравните различные моменты времени или тканей к среднее значение внутреннего стандарта разрешить прямых сравнений различных мембран и экспериментов.

7. Статистика

1. Чтобы определить каких-либо статистически значимых различий в выражении протеина, сложных и больших групп образцов, соответствующей статистической методологии не требуется. Хотя подробное обсуждение статистической фон выходит за рамки данной статьи, мы хотим подчеркнуть ряд соображений и подробно успешный подход, что мы использовали ранее¹⁹.
2. Что касается многих экспериментов белка количественного определения измерений не представляют полностью независимые данные. Здесь например, несколько ткани обычно получаются из одного животных на одной экспериментальной-момент времени определить уровни белка через несколько органов. Таким образом мы использовали смешанных моделей эффектов для анализа различий в выражении протеина с течением времени и между тканями.  В общем смешанных моделей эффектов являются эффективным средством борьбы с не независимость и тем самым избежать псевдо-репликации^22,23. В данном случае смешанных моделей эффектов увеличения статистической мощности путем учета повторных измерений среди тканей, в рамках отдельных лиц. Мы используем пакет статистического программного обеспечения R выполнять эти анализы, как это свободно доступных и универсальным. Однако другие коммерчески доступных пакетов может быть возможность выполнять подобные анализы.
3. Текущий экспериментальный дизайн включает в себя дизайн «разделить участок» потому, что каждая мышь принадлежала только одной возрастной группе. Таким образом мы моделировать отдельные мыши (мыши ID) как случайный эффект с уникальным идентификатором; Мы также приходилось ткани, возраст и их взаимодействия в виде фиксированных эффектов. Мы модели данных с использованием lmer функции в библиотеке R, lme4. Как шаг контроля качества мы визуализируются остаточные оценить предположений и равные дисперсии нормального распределения и преобразованных данных там, где это необходимо для удовлетворения этих предположений. Для проверки существенного взаимодействия между ткани и возраста, мы вписываемся идентичные модели, которая не хватало этого взаимодействия и по сравнению с использованием параметрических самонастройки (функция PBmodcomp в библиотеке, pbkrtest R) модели.  Возникновения значимых взаимодействий, мы использовали функцию emmeans (в библиотеке emmeans R) для определения причины взаимодействия.  Например мы сравнили означает выражение среди возрастных классов в рамках каждой ткани; существенного взаимодействия могут возникать между возрастом и ткани, если, скажем, два класса данного возраста значительно отличались для одной ткани, но не другой. В целом эти подходы предоставляют способ продлить надежность выводов из западной помарке эксперименты путем предоставления статистической поддержки достижению этих результатов.

Мы включаем примеры использования TPS и внутренний стандарт для облегчения сравнения уровня белка через ткани и моменты времени. Рисунок 1 показывает результаты от Западный blotting на протеине, извлеченные из тканей, полученных от новорожденных (послеродовой 5 день) по сравнению с взрослых мышей (10 - неделя). TPS и Smn immunoblot приведены на рисунке 1A, C. Количественная оценка интенсивности флуоресценции TPS была достигнута путем измерения интенсивности флуоресценции внутри прямоугольника коробки на каждой полосе, и его результаты приводятся в таблицах в Рисунок 1B и 1 D. Обратите внимание, что образцы из различных тканей, характеризуются различными TPS белка группа шаблонов и поэтому надо использовать весь Лейн в целях нормализации. Действительно когда анализируются все полосы, интенсивности флуоресценции остается относительно аналогичные образцы, указывающий TPS для нормализации подходит для этой цели. Внутренний стандарт, состоящий из смеси lysate P5 мозга была также включена для иллюстрации того, как она может использоваться для дальнейшего сравнения между различными мембраны. Кроме того на рисунке 2, мы покажем, как люминесцентные TPS может использоваться для сравнения уровня белка в разное время развития точках. Здесь мы покажем уровней Smn в мозг лизатов от новорожденных (P5), отлучение от груди возраст (P20) и взрослых (10W) мышах (рисунок 2A). Хотя ясно уровней Smn уменьшается с возрастом, TPS количественной оценки остается постоянным, как показано на рисунке 2B.

Рисунок 1. Западных помарок показаны уровни TPS и Smn белка в тканях мыши на двух разных возрастов. TPS и Smn белка для P5 (A) и 10 (C) week-old мышей. (B, D) Интенсивность флуоресценции целом лэйн TPS рассчитывается и указывается (в произвольных единицах). M: маркер/белков стандарта; кДа: kilodalton; а.е.: произвольные группы; P5: послеродовой день 5; 10W: 10 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Анализ экспрессии Smn в тканях мыши на различные области развития время очков. (A) мозг лизатов от ткани, полученные из P5, P20 и 10 week-old мышей были проанализированы с использованием TPS (Верхняя панель) и SMN (Нижняя панель). (B) интенсивность флуоресценции TPS была рассчитывается и указывается в произвольных единицах. M: маркер/белков стандарта; кДа: kilodalton; а.е.: произвольные группы; P5: послеродовой день 5; P20: послеродовой день 20; 10W: 10 недель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблицы 1. Обзор ожидаемых тканей весов и соответствующие рекомендации для смывки PBS и объем буфера lysis использоваться для гомогенизации. Веса являются показания для ткани, полученные от послеродового день 8 (P8) мышах. PBS и lysis буфера томов можно вычислить по маштабу вверх и вниз по данным экспериментальных потребности.

Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.