Физиологически одорант рецепторы активируются одоранта молекул вдыхается в паровой фазе. Однако большинство в пробирке систем используют жидкой фазы одоранта стимуляции. Здесь мы представляем метод, который позволяет в реальном времени в пробирке мониторинга одоранта рецептор активации после стимуляции одоранта в паровой фазе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Режиме реального времени в Vitro мониторинга одоранта рецептор активации одоранта в паровой фазе
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обонятельные восприятие начинается с взаимодействием отдушки с рецепторами одоранта (или) выраженные обонятельной сенсорных нейронов (ОСН). Запах признание следующим комбинаторные схемы кодирования, где один или может быть активирован с помощью ряда отдушки и один одорантов можно активировать сочетание ORs. Через такие комбинаторной кодирования, организмы можно обнаруживать и различать мириады летучих запах молекул. Таким образом запах при данной концентрации можно описать активации шаблон СПР, который специфичен для каждого запаха. В этом смысле, растрескивание механизмы, которые мозг использует для восприятия запахов требует понимания одоранта-или взаимодействия. Вот почему обоняние сообщество привержено «де orphanize» эти рецепторы. Обычные в пробирке систем, используемых для идентификации одоранта- или взаимодействия использовали инкубирования ячейки СМИ с одоранта, который отличается от естественной обнаружения запахи через пара отдушки растворения в слизистую оболочку носа до взаимодействия с СПР. Здесь мы опишем новый метод, который позволяет для реального времени наблюдения или активации через паровой фазы отдушки. Наш метод основан на измерения лагеря выхода люминесценции, используя Glosensor assay. Он ликвидирует нынешние пробелы между подходами в vivo и in vitro и обеспечивает основу для biomimetic летучих химических датчика.
Введение
Обоняние позволяет наземных животных взаимодействовать с их летучие химические среды привод поведения и эмоции. По существу процесс обнаружения запаха начинается с самого первого взаимодействия молекул одоранта с обонятельной системы, на уровне одоранта рецепторов (СПР)1. В млекопитающих ORs индивидуально выражаются в обонятельной сенсорных нейронов (OSNs), расположенный в обонятельного эпителия2. Они принадлежат к семейству рецепторов (GPCR) G-протеин и более точно родопсин как суб семье (также называемый класса A). СПР пара с стимулирующее G протеина GФОО чьи Активация приводит к лагеря производства последов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Hana3A клетки культуры
- Подготовить M10 (минимум основных средних (MEM) плюс 10% v/v плода бычьим сывороточным (ФБС)) и M10PSF (М10 плюс 100 мкг/мл пенициллин стрептомицином и амфотерицин B 1,25 мкг/мл).
- Культура клетки в 10 мл M10PSF в 100 мм ячейку культуры блюдо в инкубаторе в 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2).
- Деление клетки каждые 2 дня в соотношении 20%: при 100% слияния клеток (примерно 1.1 x 107 клеток) наблюдается под микроскопом фазово контрастной, стремятся СМИ и вымыть клетки мягко с 10 мл физиологического раствора фосфатного буфера (PBS).
- Аспирационная PBS и добавить 3 мл 0,05% трипсина эти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы показан ответ три мыши ORs, Olfr746, Olfr124 и Olfr1093 с помощью оксима пара стимуляции (рис. 3). Одновременно, мы использовали элемент пустой вектор (Ро pCI), чтобы заверить, что одоранта индуцированной деятельности протестированных ОРС были конкретные (рисA). Реальном времени активации ORs после пара одоранта стимул был контроль более чем 20 измерений циклов. Данные для каждого хорошо были впервые нормализовано к значению элемента управлен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Восприятие запаха принципиально зависит от активации ORs. Следовательно для того чтобы треснуть сложные механизмы, использующие мозг воспринимать его летучие химические среды требуется понимание их функциональность. Однако понимание этого процесса сдерживается трудностями в создании надежного метода для экран или справочника для функциональности против одорантов в пробирке. Клеток поверхности и гетерологичных выражение ORs частично решена путем создания тегами рецепторов13,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Ю.Ф, H. K и H.M. подал заявку на патент отношение к этой работе на 27 октября 2016.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от них (DC014423 и DC016224) и обороны передовых исследований агентства RealNose проекта. YF остался в университете Дьюка при финансовой поддержке программы JSP-страницы для продвижения стратегических международных сетей для ускорения циркуляции талантливых исследователей (R2801). Мы благодарим Sahar Калима для редактирования рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05 % трипсин-ЭДТА | Gibco | 25300-054 | 0,05% Трипсин - ЭДТА (1х), фенол красный - хранить при 4&deг; C |
| 100 мм чашка для клеточных культур | BD Falcon | 353003 | 100 мм x 20 мм |
| 15 мл туба | BD Falcon | 352099 | 17 мм x 120 мм коническая трубка |
| 96-луночная пластина | Corning | 3843 | 96 лунка, с крышкой LE белая с прозрачным дном покрытие поли-D-лизин покрытый полистиролом |
| амфотерицин | Gibco | 15290-018 | амфотерицин B 250 &; г/мл - хранить при 4 °deg; C |
| центрифуга | Jouan | C312 | Центрифуга с качающимся ковшом ротором на 15 мл |
| Класс II Тип A/B3 Вытяжной шкаф | NUAIRE | NU-407-500 | для культивирования клеток |
| FBS | Gibco | 16000-044 | Фетальная бычья сыворотка - хранить при -20 ° C |
| GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent люминесцентный белковый субстрат - хранить при -20 °deg; C |
| Инкубатор 37 ° C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Инкубатор для культивирования клеток |
| Lipofectamine 2000 реагент | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Реагент 1 мг/мл реагент для трансфекции - хранить при температуре 4 ° C |
| Люминометр POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | снят с производства | 96 луночный планшетный считыватель для люминесценции |
| Минеральное масло | Sigma | M8410 | Растворитель для одорантов - хранить при комнатной температуре |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle' S Соли и L-глютамин - хранить при 4 градусах; C |
| Пенициллин/стрептомицин | Sigma Aldrich | P4333 | Пенициллин-стрептомицин раствор, стабилизированный 10 000 ЕД пенициллина и 10 мг стрептомицина - хранить при -20 °°; C |
| pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP люминесцентный белок плазмида - хранить при 4 °deg; C |
| Фазово-контрастный микроскоп | Leica | 090-131.001 | фазово-контрастный микроскоп с объективами x4, x10, x20 |
| RTP1S | H. Matsunami | lab-100 нг/&микро; L плазмида - хранить при 4°°; С |
Ссылки
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Gene....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
