Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59454

⸱

16 января 2020 г.

 ,  ,  , 
1Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, 2Department of Anatomy of Physiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол для колористического асссиса цитратной активности синтазы для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы в гомогенатах ткани Дрозофилы.

Аннотация

Митохондрии играют наиболее заметную роль в клеточном метаболизме, производя АТФ через окислительную фосфорилирование и регулируя различные физиологические процессы. Митохондриальная дисфункция является основной причиной ряда метаболических и нейродегенеративных заболеваний. Intact митохондрии имеют решающее значение для их надлежащего функционирования. Фермент цитрат синтазы локализован в митохондриальной матрицы и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера фермента нетронутой митохондриальной массы. Учитывая, что многие молекулы и пути, которые имеют важные функции в митохондриях, очень сохраняются между людьми и дрозофилой,и что массив мощных генетических инструментов доступны в Drosophila, Drosophila служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого измерения активности цитрата синтазы в ткани гомегената от взрослых мух без изоляции митохондрий. Этот протокол также подходит для измерения активности цитрата синтаза в личинках, культивированных клетках и тканях млекопитающих.

Введение

Митохондрии наиболее известны как органеллы, производящие энергию в большинстве эукариотических организмов, которые производят энергетическую валюту, АТФ, через цикл трикарбоксилевой кислоты (т.е. цикл Кребса) и окислительного фосфорилирования. Митохондрии также находятся играть важную роль во многих других физиологических процессов, таких как регулирование апоптоза1, Ca 2 "гомеостаз2,3, реактивные виды окисления (ROS) поколения4, и эндоплазмический ретикулум (ER)-стресс ответ5. Митохондриальная дисфункция может повлиять на любой орган в организме в любом возрасте и является основной причиной метаболических, связанных со старением6,и нейродегенеративных заболеваний7. Нетронутые митохондрии механистически связаны с митохондриальной функцией. Таким образом, надлежащая количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции8. Цитрат синтазы, ограничивающий скорость фермента в первой ступени цикла трикарбоксилевой кислоты9, локализуется в митохондриальной матрицы в эукариотических клетках, и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера для присутствия нетронутой митохондриальной массы9,10. Активность цитрата синтазы также может быть использована в качестве фактора нормализации для нетронутых митохондриальных белков11,12.

Плодовая муха, Drosophila melanogaster, является отличной моделью системы для изучения митохондриальной функции, так как многие молекулы и пути, которые играют ключевую роль в митохондриях эволюционно сохранены от Drosophila к людям13,14,15. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого метода измерения активности цитрата синтазы с помощью колористического анализа в ткани Drosophila гомогенатов16 в формате 96 скважин. В цитрат синтазы деятельности анализ, цитрат синтазы в ткани Drosophila гомогената катализации реакции оксалататата с ацетил коэнзим а (ацетил КоА) для формирования цитрат CoA-SH и H. CoA-SH впоследствии реагирует с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) для создания цветного продукта, 2-нитро-5-тиобензоат (TNB), который может быть легко измерен спектрофотометрически на 412 нм. Активность цитрата синтаза может быть отражена скоростью производства цвета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Колориметрический цитрат Синтаза Деятельности Анализ для D. melanogaster16

  1. Соберите десять взрослых мух для каждого образца. Соберите хотя бы тройные образцы для каждого генотипа.
  2. Подготовьте 500 кЛ ледяного буфера экстракции, содержащего 20 мМ HEPES (pH 7.2), 1 мМ EDTA и 0,1% тритона X-100 в пробирке 1,5 мл для каждого образца.
  3. Анестезия взрослых мух с CO2 на прокладке анестезии и изолировать нужные ткани. Чтобы изолировать взрослую муху грудей, например, зафиксировать грудную клетку мухой парой щиптов, а затем изолировать муху животами, разрезая вдоль границы грудной клетки и живота ножницами. Соберите мухи грудной клетки для мышечной цитрат синтазы деятельности ассеи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите свежий вес ткани на этом этапе, если с его помощью для нормализации активности цитрата синтаза.
  4. Передача 10 взрослых летать грудной клетки на 100 л ледяной буфер добычи немедленно и гомогенизации с пестиком на льду. Чтобы сохранить образцы ледяной, гомогенизации образцов для 5-10 s на льду, затем образцы сидят на льду в течение 5 с, и повторять, пока все ткани в трубке гомогенизированы полностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лента трубки, проверить гомогенаты, чтобы убедиться, что Есть нет сгустков в гомогенатах и что ткани в трубке гомогенизированы полностью. Все образцы лечения должны проводиться на льду.
  5. Возьмите 10 кЛ каждого гомогенизированного образца в новой трубке для измерения содержания белка. Храните образцы для измерения белка на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы белка могут быть заморожены и храниться при -80 градусах по Цельсию для последующего анализа. Концентрации белка служат внутренним параметром для нормализации деятельности цитрата синтаза.
  6. Добавьте 400 qL ледяного буфера извлечения к каждому оставшемуся образцу, чтобы сделать общий объем 500 л. Смешайте хорошо, мягко пайпетируя вверх и вниз, по крайней мере 5x, избегая образования пузырьков. Для каждой реакции добавьте 1 кЛ разбавленного клеточного лизата к 150 л свежеподготовленного раствора реакции (20 мм Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 мМ DTNB, 0,3 мм ацетил коА, 1 мм оксалататической кислоты). Тщательно перемешайте и сразу же аккуратно пайпетить, избегая образования пузырьков. Измерьте абсорбцию на уровне 412 нм каждые 10-30 с в течение 4 минут при 25 градусах Цельсия с помощью считывателя пластин, способного измерять абсорбцию на уровне 412 нм с минимальными интервалами 10 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение наконечника перед pipetting другой реагент и избежать формирования пузырьков в колодцах. Неполное смешивание реагентов может привести к колебаниям измерений. Контроль активности цитрата синтазы должен быть сделан при комнатной температуре сразу после сбора образцов, так как этот обзор используется для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы. Буфер реакции должен быть подготовлен непосредственно перед использованием и не должен храниться.
  7. Данные участка как оптическая плотность (OD) абсорбция (abs) (Y-ось) по сравнению со временем (в минутах) (X-ось). Затем вычислите наклон для линейной части кривой, где скорость реакции

    figure-protocol-1

    Разделите значение на концентрацию белка образца для нормализации активности цитрата синтаза. Активность синтаза цитрата рассчитывается как

    figure-protocol-2

    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка образца может быть измерена набором анализов концентрации белка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 представляет собой пример кинетических кривых для абсорбции OD на 412 нм с течением времени, полученных с помощью цитрат ажиотажной активности колористовой анализ для измерения drosophila грудной ткани ткани гомогенаты различных генотипов. Хорошо известно, что PGC-1 является мастером регулятора митохондриального биогенеза. PGC-1" функционально сохраняется между дрозофилой и людьми. Дрозофила RNF34 (dRNF34) является E3 убик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метаболические исследования с использованием Drosophila в качестве модели должны принимать во внимание генетический фон, диета, и запас обслуживания мух18. Чтобы избежать воздействия различных генетических фонов на измерение активности цитрата синтаза, различные штаммы Drosophila должны быть перекрещены к контрольному штамму в течение 10 поколений. Генетический фон всех штаммов Drosophila, используемых в наших экспериментах, составляет w 1118,поэтому ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами От Национального фонда естественных наук Китая (31401013 и 31471010), Научно-технической комиссии муниципалитета Шанхая, Шанхайской программы Пуцзян (14PJ1405900) и Фонда естественных наук Шанхай (19ЗР14446400).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновая кислота (HEPES)Сигма-ОлдричV900477
2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (основание ТРИЗМА)Сигма-ОлдричV900483
ацетил-КоАСигма-ОлдричА2181
Дитио-бис-нитробензойная кислота (ДТНБ)Сигма-ОлдричD8130
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-AldrichV900106
оксалоацетатSigma-AldrichO4126
Пеллетный пестикSangonF619072
Пеллетный пестик моторTiangenOSE-Y10
Планшетный ридерBioTekEon
Protein BCA Набор для анализаBeyotimeP0010S
НожницыWPI14124
Triton X-100СангонA110694-0100

Ссылки

  1. Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
  2. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
  3. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  4. Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
  5. Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
  6. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
  7. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
  8. Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
  11. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
  12. Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
  13. Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
  14. Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
  15. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
  16. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  17. Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
  18. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  19. Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.