Методическая статья

Захват малые молекулы связь между тканей и клеток с использованием изображений масс-спектрометрия

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59490

⸱

3 апреля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Animal Science, University of Illinois at Urbana-Champaign

В этой статье

Краткое содержание

Новый метод пробоподготовки была разработана для размещения клеток и тканей coculture обнаружить малые молекулы exchange с помощью тепловизионных масс-спектрометрии.

Аннотация

Imaging масс-спектрометрия (IMS) регулярно был применен для трех типов образцов: разделов ткани, сфероидов и микробных колоний. Эти типы образцов были проанализированы с использованием матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) для визуализации распределения белки, липиды и метаболитов через биологический образец интерес. Мы разработали метод подготовки Роман образца, который сочетает в себе сильные стороны трех предыдущих приложений для решения underexplored подход к выявлению химическая связь в рак, путем посева культуры mammalian клеток в агарозы в coculture с здоровые ткани, после высыхания образца. У млекопитающих ткани и клетки cocultured в непосредственной близости, позволяя химическая связь через диффузии между ткани и клетки. В определенное время точках образца на основе агарозы высушена таким же образом как микробной колоний, подготовленный для анализа IMS. Наш метод был разработан для модели связи между высококачественного Серозный рак яичников, производный от маточной трубе, как он взаимодействует с яичника во время метастазов. Оптимизация подготовки пробы привело к идентификации норадреналин как ключевого химического компонента в яичников микроокружения. Этот недавно разработанный метод может применяться для других биологических систем, которые требуют понимания химической связи между соседними клетки или ткани.

Введение

Imaging масс-спектрометрия (IMS) был оптимизирован для характеризовать пространственное распределение молекулярных компонентов в три широко используемых приложений: фрагменты тканей, сфероидов и микробных колоний1,2,3. Фрагменты тканей могут использоваться для оценки локализации метаболитов в контексте биологических условий в узле, либо целевых или нецелевого в пределах определенного диапазона массы. Однако различия между молекулярные особенности являются наиболее значительных и очевидно здоровых тканей по сравнению с больными условие, например, опухоль. Этот подход IMS особенно приспособлены для обнаружения болезни биомаркеров, однако, получение образцов тканей на отдельных стадиях прогрессирования заболевания (например, опухоль классы) исключает возможность идентификации сигналов, которые могут быть важны для инициирования болезни. Обмен информацией через пространство является вездесущий особенностью многих биологических систем, и кусочки ткани не может захватить этот динамический химических реле. Один из методов, который способен визуализации химического обмена и распространения является IMS микробной колоний, выращенных на плитах агара; малые молекулы способны распространять через и через агар и может быть захвачен через матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) масс-спектрометрии4. Этот рост установки может использоваться для идентификации молекул, обмениваются дискретных биологических образований (колоний) и также может определить направленность производства метаболит. Платформа, первоначально разработанный для роста микроорганизмов колонии была адаптирована к изучить первичный метаболизм эксплантов ткани, выросло с mammalian клеток, и МСМ была использована для оценки динамического химического обмена в системе экстракорпорального млекопитающих.

В последние несколько лет стало ясно, что высокий класс Серозный рак яичников (HGSOC) часто происходит в маточной трубе эпителия (FTE) и затем метастазирует в яичнике во время ранних заболеваний развития5,6, 7 , 8. Причина, что онкогенной FTE клетки распространились на яичнике, где большие опухоли в конечном итоге формируют и далее метастазировать, в настоящее время непонятно. Предыдущие исследования были направлены на роль яичников белков в первичной метастазирования яичников; Однако недавно было продемонстрировано что переход от здоровой онкогенной ткани приводит к массовым нарушения клеточного метаболизма и изменяет производство малых молекул9,10,11. Таким образом мы предположили, что малые молекулы, обмениваются ФТЕ и яичника может быть частично отвечает за основной метастазов HGSOC.

С помощью нашего недавно разработанные процедуры IMS, мы определили, что coculture онкогенной FTE и здоровой ткани яичника индуцирует производства норадреналина из яичника. Однако другие типы клеток или нормальные клетки ФТЕ не вызывают этот эффект. Чрезвычайный преимущество этого метода является, что могут быть визуализированы молекулярного производства и обмена сигналами, которые представляют реальных молекул, так что даже в coculture это можно определить источник сигнала. Это преимущество над анализ гомогенизированных образцов, где все пространственная информация теряется. В нашей модели системы мы смогли четко назначить производства норадреналина в яичнике. Норадреналина связано с метастазами и chemoresistance рака яичников, и наши обнаружения этой молекулы проверила, что метод Роман IMS может раскрыть биологически соответствующих молекул12,13, 14. Эта проверка позволяет нам предложить, что это новое применение IMS может быть особенно полезно для исследовательских групп, которые пытаются определить малых молекул в coculture средах и понять раннего события, влияющие ячейки преобразования и метастаз. Общая цель этого метода заключается в том, для выяснения личности и пространственного распределения мелких молекул во время обмена между тканей и органов, представлены в vitro 3D клеточных культур или ex vivo ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все животные процедуры соответствовали национальные институты здравоохранения руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных и утвержденных Комитетом правомерного использования животных и уход (IACUC) в университете штата Иллинойс в Чикаго.

1. Подготовка реагентов

  1. Поддерживать мышиных oviductal эпителия (МО) клеток при 37 ° C с 5% CO2 в увлажненные инкубатора в альфа-СМИ минимум основных средних (αMEM), дополнены плода бычьим сывороточным 10% (ФБС), 2 мм L-глютамином, 10 мг/мл инсулин, трансферрин, селен (СТС) , 1,8 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 100 ед/мл пенициллин стрептомицином, 1 мг/мл гентамицина и эстрадиол 17β 18.2 нг/мл. Клетки проходят каждые 3 – 4 дня, обеспечение того, что существует достаточное количество клеток в тот же день будет жертвовать мышей.
  2. 2% агарозном готовят путем смешивания 1 g легкоплавких агарозы с 50 мл дистиллированной воды. Автоклав агарозы, дайте ему остыть, а затем Алиготе (1 мл) 2 мл пробирок (см. Таблицу материалы) до агарозы затвердевает. Агарозы могут храниться при температуре-20 ° C на неопределенный срок.
  3. Подготовьте по крайней мере 2 мл 1 x Дульбекко изменения орла среднего (DMEM) средств массовой информации.
  4. Для матрицы MALDI-TOF MS, подготовить 10 мл по 5 мг/мл 1:1 альфа циано-4-hyroxycinnamic кислота (CHCA): dihydroxybenzoic кислота (DHB) (см. Таблицу материалы) в цвету ACN:H2O + 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК). Sonicate решение, до тех пор, пока матрица растворяется.

2. мышь колонии и удаление яичника

  1. Поддерживать разведения пары CD-1 мышей с использованием стандартного жилья процедур. Рядом в день родов проверьте мышей каждый день так, что возраст щенков известен.
  2. Усыпить щенков в возрасте 16-18 дней с CO2 ингаляции в них руководящие принципы. Доставить CO2 (100%) в потоке ставка 10% – 20% камерная тома в минуту и продолжаться в течение двух минут после остановки дыхания. Подтвердите эвтаназии, шейки матки дислокации.
  3. Лечить все хирургическое оборудование, погрузив в 70% этиловом спирте. Теплый Лейбовиц в L-15 СМИ с 1 x пенициллин стрептомицином до 37 ° C.
  4. Влажные поверхности живота с 70% этанол дезинфицировать области и свести к минимуму загрязнение с волосами. Хватка кожи, охватывающих брюшной стенки с помощью тупого щипцы и использовать Ножницы хирургические сделать большой V-образные прорваться через кожу и брюшной стенки, подвергая внутренние органы.
  5. Переместите в сторону, используя пинцет внутренних органов. Отдельности захватить каждый рога матки с тонкой щипцами и слегка приподнимите.
  6. Найдите яичника, которая будет в конце рога матки, непосредственно ниже почки. Используйте Ножницы хирургические для того чтобы рассечь свободной соединительной ткани яичника. Затем пополам яичников рога.
  7. Переместить, яичников, маточных труб и около одной половины каждого рога матки подогретым Лейбовиц L-15 СМИ.
  8. Под микроскопом рассечения тщательно двигаться каждый яичник от окружающих Бурсы, освобождая его от маточных труб, Бурса и любой жировой ткани. Переместите каждый яичник новое блюдо Лейбовиц L-15 средств массовой информации.
  9. Пополам каждый яичник аксиально. Держите яичников части (теперь называется эксплантов) хранится при 37 ° C до обшивки агарозы.

3. Настройка и инкубации Ито лечение слайд для Cocultures

  1. Неделимого cocultures
    1. Liquify агарозы при 70 ° C на горячей плите.
    2. Место 8-Ну делителя на вершине tinoxide Индий (ИТО)-лечение слайд (рис. 1A). Нижней резины на разделителем СПИД в адгезии к слайду, но убедитесь, что применять непрерывный нежный понижательное давление во время покрытия агарозы для обеспечения нет утечки или смешивания между скважинами.
    3. Собрать клетки в 15 мл Конические трубки, центрифуг (5 мин на 800 об/мин) и Ресуспензируйте до 50k клеток на 150 мкл в 1 x DMEM СМИ. Если плотность разных клеток является оптимальным, убедитесь, что на данном этапе суспензию клеток 2 x окончательной плотности желаемого (например, для окончательного концентрация 50 000 ячеек в 300 мкл, плотность клеток на этот шаг 50 000 ячеек в 150 мкл).
    4. Перед покрытием культуры клеток, добавьте яичников экспланта центр скважины (рис. 1B).
    5. Добавьте агарозы в каждой культуре клетки в отдельных 2 мл трубки перед обшивкой. Для каждой скважины объединить 200 мкл суспензии клеток и 200 мкл сжиженых агарозы в 2-мл пробирку. Например для четырех скважин, объединить 800 мкл суспензии клеток и 800 мкл 2% агарозы. Некоторые смеси останется, но делать немного больше, чем необходимо избежать пузырьков воздуха во время закупорить.
      1. Добавьте агарозы для отдельных клеточных культур непосредственно перед покрытие этой клеточной культуры. Агарозы будет охлаждаться в соответствии с минуту, так что будьте готовы быстро пластины.
    6. Сразу же добавьте 300 мкл клеток/агарозы смеси для каждой скважины (рис. 1 c). Рисунок 1 c показывает три ячейки условия и состояние одного СМИ, каждый покрытием с и без яичника.
    7. Инкубируйте слайд при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.
  2. Разделенные Cocultures.
    1. Вырежьте разделители из тонкой, гладкой пластмассы (рис. 2A).
      Примечание: Этот эксперимент использует стороны бассейна, стерильные одноразовые СМИ, потому что они плоские и тонкий. Вырежьте их достаточно широк, чтобы поместить snugly в гипотенузы скважины (~ 13 мм).
    2. Liquify агарозы при 70 ° C на горячей плите.
    3. Место 8-Ну делителя на вершине Ито лечение слайд (рис. 2B). Нижней резины на разделителем СПИД в адгезии к слайду, но убедитесь, что применять непрерывный нежный понижательное давление во время покрытия агарозы для обеспечения нет утечки или смешивания между скважинами.
    4. Собрать клетки в 15 мл Конические трубки, центрифуг (5 мин на 800 об/мин) и Ресуспензируйте до 50k клеток на 150 мкл в 1 x DMEM СМИ. Если плотность разных клеток является оптимальным, убедитесь, что на данном этапе суспензию клеток 2 x окончательной плотности желаемого (например для окончательного концентрации 50 000 ячеек в 300 мкл, плотность клеток на этот шаг, 50 000 ячеек в 150 мкл).
    5. Вставьте пластиковые разделители по диагонали скважин (рис. 2 c).
    6. Добавление агарозы для каждой ячейки подвеска, один в то время как раз перед обшивкой. Для каждой скважины объединить 100 мкл суспензии клеток и 100 мкл сжиженых агарозы в 2-мл пробирку. Например для четырех скважин, объединить 400 мкл культуры клеток и 400 мкл 2% агарозы. Некоторые клетки/агарозы смесь останется, но делать немного больше, чем необходимо избежать пузырьков воздуха во время закупорить.
      1. Добавьте агарозы для отдельных клеточных культур непосредственно перед покрытие этой клеточной культуры. Агарозы будет охлаждаться в соответствии с минуту, так что будьте готовы быстро пластины.
    7. На одной стороне делителя пластина 150 мкл клеток/агарозы смеси. Разрешить агарозы остыть и затвердеть (приблизительно 1 мин) и затем удалить разделитель (Рисунок 2D).
    8. Место экспланта завязи в центре пустой половины колодца. Место 150 мкл СМИ/агарозы смесь над верхней завязи и только в правильной стороне хорошо (Рисунок 2E).
    9. Инкубируйте слайд при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатора.

4. Сушка слайд и подготовке MALDI-TOF MS

  1. После четырех дней (или любой предпочтительный момент), удалить разделитель камеры от агарозы вилки и слайд (рис. 1 d). Аккуратно отделить стороны агарозы из камеры с плоский шпатель и осторожно потяните камеры вверх, стараясь не переместить любой агарозы вилки. Если они движутся, аккуратно переместите их таким образом, чтобы они не соприкасаются друг с другом.
  2. Место в слайд 37 ° C духовке около 4 ч, вращающихся 90° каждый час.
    Примечание: Вращение слайда имеет важное значение для обеспечения распределения тепла даже всей выборки.
  3. После высыхания, удалите слайд из духовки (Рисунок 1E).
  4. Применение матрицы решения с помощью распылителя (Рисунок 1F), со следующими параметрами: температура = 30 ° C, скорость потока = 0,2 мл/мин, количество проходов = 8, направление = CC и сопло расстояние = 40 мм.
    Примечание: Вместо матрицы распылителем, художественная Аэрография может использоваться для применения жидких матрицы. То же решение матрица может использоваться для распыления, но требуется примерно вдвое больше решение. С горкой, зажимается так, что он висит вертикально, спрей слайд с 90° углом от приблизительно одной ногой прочь (адаптировано из Гофмана15) до матрицы слой видимым.
  5. 1 мкл calibrant (красный фосфор для целей < 500 Да, смесь пептида (см. Таблицу материалы) для целей < 5000 Da) чтобы очистить место на слайде. Фосфор красный требует, не смешивая с матрицей, но пептид смесь смесь 1:1 с матрицей для помощи ионизации. Дождитесь calibrant для просушки.
  6. Нарисуйте X с использованием перманентный маркер в каждом углу слайда и принимать оптические изображения с помощью камеры или сканера на 1200 dpi.

5. Визуализация сбора данных масс-спектрометрии

  1. Открыть новую последовательность на программное обеспечение для анализа данных IMS (см. Таблицу материалы). Задайте ширину растрового желаемого пространственное разрешение, по крайней мере 50 мкм.
  2. Загрузить программное обеспечение для анализа оптической изображение слайда и установить три учить точек с помощью пересечений в Икса обращается в каждом углу.
  3. Обозначить области интереса для изображений в приобретение программного обеспечения и назвать их соответствующим образом.
  4. Калибровки инструмента, с помощью программного обеспечения сбора данных (см. Таблицу материалы) в течение 5 ppm ошибка.
  5. Сохранить оптимизированный метод и начать запуск. Этот эксперимент оптимизированы следующие параметры: полярности = положительный, детектор = Reflectron, лазерная размер = 2, мощность лазера = 50%, отражатель режим детектора прибыль = 3 x.

6. обработка данных IMS

  1. Импорт файла .mis в статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалы) для анализа значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимально сушеные Ито слайд приведет к плоской сморщившимися образца с минимальными без морщин по всей поверхности агарозы и агарозы куски, которые поддерживают пространственное разделение на слайде (рис. 3). На рисунке 3A показывает, оптимального высыхания, а рисунок 3B показывает морщины, которые следует избегать. Эта оптимизация требует тщательного мониторинга слайда в духовке, как точное время м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует растущее число доказательств того, что подразумевает норадреналина в роль в HGSOC12,17,18, и этот метод вносит более механистических информации. С по меньшей мере восемь биологических условиях на тот же слайд метод можно объяснить биологического контроля как ген и специфичность клетки, а также элементы управления мультимедиа в одном IMS. В то время как метод был оптимизирован для оценки обмен малых молекул в модели пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Финансирование было предоставлено Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго по общинным (C-076) (L.M.S.); Университет Иллинойса в Чикаго запуска средства (L.M.S.); Грант 543296 из Альянса Фонд исследований рака яичников (M.D.); и UG3 ES029073 (J.E.B.) и национальным центром для продвижения трансляционная наук, Национальный институт здравоохранения, через Грант UL1TR002003 (Джеб и LMS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл пробирки FalconDenvilleC1017-OДля сбора ячеек
8-луночная камера (Millipore EZ-slide камера)MilliporePEZGS0816Перепрофилировано из Millipore Millicell EZ-slide камерное стекло
АцетонитрилSigma-Aldrich34998-4LРастворитель для распыляемой матрицы
Alpha Minimum Essential Medium (α MEM)Fisher10-022-CVСреда для культивирования клеток
Autoflex speed MALDI-TOF LRFBrukerДля анализа данных IMS
ЦентрифугаEppendorf5810 RДля сбора клеток и удаления надосадочной жидкости
CHCA MatrixBruker Daltonic8201344Matrix, распыляемая на высушенное предметное стекло
DHB MatrixBruker Daltonic8201346Matrix распыляемая на высушенное предметное стекло
Одноразовые скальпелиFisher22-079-707Для удаления яичников
Препарирующие ножницыFisher13-804-6Для удаления яичников
DMEM MediaGibco11995-065Средство смешанное с агарозным
эпидермальным фактором ростаPeprotech Inc.100-15Добавка к клеточным культурам
Eppendorf tubesGenesee Scientific22-282Для агарозных аликвот
Эстрадиол-17&бета;Simga-AldrichE2758Пищевая добавка для клеточных культур
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаDenvillefb5001Пищевая добавка для клеточных культур
FlexControl 3.4Программное обеспечение для сбора данныхBruker Daltonic
FlexImaging 4.1Программное обеспечение для анализа данныхBruker Daltonic
Щипцы (тонкие)Fsiher22-327379Для удаления Питательная среда для яичников
GentamycinCellgro30-005-CRПитательная среда для клеточных культур
Инсулин, Трансферрин, Селен (ITS)Сигма-Олдрич11074547001Пищевая добавка для клеточных культур
Слайд с покрытием ITOBruker8237001Платформа для инкубации кокультур
Leibovitz's L-15 MediumGibco11415064Среда, используемая во время работы с тканями диссекция
L-глутаминGibco25030-081Добавка к питательной среде для клеточных культур
Низкоплавкая агарозаSigma-AldrichA9414-10GСмешана с питательной средой для нанесения покрытий
Медиа-бассейнCorning4870Используется для резки пластиковых разделителей для разделенных камер
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122Добавка
к питательной среде для клеточных культурПептидный калибровочный стандартBruker Daltonic8206195Calibrant для среднего диапазона
масс Phophorus redSigma-Aldrich343-242-5GCalibrant для малого диапазона масс
SCiLS Lab 2015Bruker DaltonicIMS статистический анализ данных
Хирургические щипцы (тупые)Fisher08-875-8BДля удаления яичников
TFAFisher ТехнологииА116-50Добавлен в матричный раствор
ТМ РаспылительHTX ТехнологииДля нанесения матрицы
IMS IMS

Ссылки

  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
  3. Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  4. Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
  5. Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645(2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
  7. Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
  8. Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410(2015).
  9. Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
  10. King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435(2011).
  11. Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
  12. Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
  13. Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
  14. Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
  15. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
  16. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
  17. Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403(2013).
  18. Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TOF

Похожие статьи