Методическая статья

Изображение динамики кальция в субпопуляциях мышей поджелудочной железы клеток на икры

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59491

⸱

26 ноября 2019 г.

 ,  ,  , 
1Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford, 2Lund University Diabetes Centre, Unit of Molecular Metabolism, Clinical Research Centre, Malmö University HospitalMalmö, 3Institute of Neuroscience of Physiology, Department of Physiology, Metabolic Research Unit, University of Göteborg, 4Oxford National Institute for Health Research, Biomedical Research Centre, 5Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для визуализации и количественной оценки динамики кальция в неоднородных популяциях клеток, таких как клетки островков поджелудочной железы. Флуоресцентные репортеры поставляются в периферийный слой клеток внутри наиксхота, который затем обездвиживается и образуется, и на одного клетка проводится анализ динамики интенсивности флуоресценции.

Аннотация

Гормоны островков поджелудочной железы регулируют гомеостаз глюкозы в крови. Изменения в глюкозе в крови вызывают колебания цитозоля кальция в клетках поджелудочной железы, которые вызывают секрецию трех основных гормонов: инсулина (из клеток), глюкагона (я-клеток) и соматостатина (я-клетки). Клетки, которые составляют большинство клеток-излиемжителей и электрически связаны друг с другом, реагируют на стимул глюкозы как единое целое. Возбудимость незначительных субпопуляций, я-клеток и к-клеток (составляет около 20% (30%) и 4% (10%) общего числа грызунов1 (человек2) номера клеток аклетов, соответственно) является менее предсказуемым и, следовательно, представляет особый интерес.

Датчики кальция поставляются в периферийный слой клеток в изолированном изолированном изолированном изолированном изолированном изолированном раздатчике. Островок или группа островков затем обездвижены и изображены с помощью флуоресцентного микроскопа. Выбор режима визуализации находится между более высокой пропускной стоимостью (широкое поле) и лучшим пространственным разрешением (конфокальным). Условно, лазерное сканирование конфокальной микроскопии используется для визуализации тканей, так как она обеспечивает лучшее разделение сигнала между соседними клетками. Можно также использовать широкополевой систему, если свести к минимуму загрязняющий сигнал от доминирующей популяции к-клеток.

После того, как динамика кальция в ответ на конкретные стимулы были зарегистрированы, данные выражаются в численной форме, как интенсивность флуоресценции по сравнению со временем, нормализованы к первоначальной флуоресценции и базовые коррекции, чтобы удалить эффекты, связанные с отбеливанием фторофор. Изменения частоты спаза или частичной области под кривой (pAUC) вычисляются по сравнению со временем, для количественной оценки наблюдаемых эффектов. PAUC является более чувствительным и довольно надежным в то время как частота пикирования обеспечивает больше информации о механизме увеличения кальция.

Незначительные субпопуляции клеток могут быть определены с помощью функциональных реакций на маркер соединений, таких как адреналин и грелин, которые вызывают изменения в цитосолико кальция в конкретных популяциях клеток-разыски.

Введение

Целью метода является изображение изменений в реальном времени в концентрации цитосолика кальция (Ca2 иcyt) в небольших субпопуляциях клеток поджелудочной железы. Это позволяет раскрыть механизмы, регулирующие секрецию гормонов в этих клетках, раскрывая детали о перекрестном разговоре между различными типами клеток и, потенциально, вводя измерение населения в более широкую картину сигнализации на изовсехили.

Островки состоят из нескольких типов клеток. Помимо более известных инсулиноседающих клеток, есть по крайней мере две субпопуляции, которые также имеют решающее значение в регулировании глюкозы в крови3. К-Клетки (которые составляют около 17% клеток газолетов) выделяют глюкагон, когда уровень глюкозы в крови становится слишком низким, что сигнализирует о высвобождении глюкозы в кровоток из складов в печени. Чрезмерный уровень глюкагона (гиперглукогонония) и нарушение контроля глюкагона-релиза сопровождают (и, технически, могут способствовать) предиабетическое состояние нарушения чувствительности инсулина4. К-Клетки (около 2%) выделяют соматостатин в ответ на повышение уровня глюкозы. Этот вездесущий пептидный гормон, вероятно, присутствует при высоких концентрациях в непосредственной близости от клеток в островках, который имеет сильное Gi рецепторо-опосредованного затмения на глюкагон и секрецию инсулина.

Я-Клетки и клетки разделяют большую часть механизма зондирования глюкозы с их близкими родственниками, клетками. Все три типа клеток оснащены аТПл-чувствительными каналамиK, сложными метаболическими датчиками5, которые контролируют потенциал плазменной мембраны этих возбудимых клеток. В то же время, секреция инсулина, соматостатина и глюкагона регулируется по-разному глюкозой. Таким образом, визуализация динамики Ca2 в двух незначительных субпопуляциях клеток-аклетов может дать представление о перекрестном разговоре между глюкозой крови и выходом на просторы.

Ранние попытки мониторинга возбудимости я- и q-клеток с помощью патч-зажим электрофизиологии вскоре последовали изображения Ca2 "в одном - и й-клеток. Идентичность клеток в этих экспериментах была проверена с помощью заднего окрашивания анти-глюкагоном или анти-соматостатин антитела. Эти усилия часто затруднялись выводом о том, что в пределах простота и как одиночные клетки ведут себя очень по-разному. Хотя к-клетки могут показаться главными благодетелями расположения на иктов (из-за их подавляющего большинства, которое лежит в основе их сильной электрической связи), основное несоответствие было, что удивительно, было обнаружено в клетках. В нетронутом наиклете эти клетки постоянно и настойчиво активируются при низкой глюкозе, что верно только для около 7% отдельных рассеянных6. Таким образом, считается, что сообщение о активности я-и-клеток в нетронутых островках представляет собой более близкое приближение условий in vivo.

В целом, существует два способа отчетности Ca2 "динамики конкретно от ячеек или я-клеток субпопуляций: (i) выражение генетически закодированных Датчик Ca2 " через ткани конкретных промоутер или (ii) с использованием маркера соединений. Более элегантный прежний подход добавляет существенное преимущество истинного 3D-изображения и, следовательно, изучения распределения клеток в пределах наикса. Однако он не может быть применен для нетронутого человеческого газолетного материала. Другой потенциальной проблемой является «утечка» промоутера, особенно когда существует трансдифферециация к/-х-клеток или реакция на высокий уровень глюкозы. Последний подход может быть использован со свежеизолилой ткани, включая образцы человека или культивированных островков. Данные, однако, собираются исключительно из периферического слоя клеток аклетов, так как доставка молекулы красителя/маркера в более глубокие слои без изменения архитектуры на дорогах является сложной задачей. Неожиданным преимуществом последнего подхода является совместимость с широкоугольным режимом визуализации, что позволяет масштабировать эксперименты для одновременного изображения десятков или сотен островков (т.е. от тысяч до десятков тысяч клеток).

Кальций изображен в vivo с помощью генетически закодированных GCAMP7 (или перикам8) семейные датчики, которые являются вариантами круговой пермутентного зеленого флуоресцентного белка (GFP) сливается с кальцием-связывающий белок calmodulin и его целевой последовательности, M13 фрагмент миозина свет цепи киназы7,9. GCaMPs имеют превосходные соотношения сигнала к шуму в диапазоне концентраций наномоллярного Ca2 и высокое 2-фотон поперечное сечение, что делает их идеальным выбором для работы in vivo10,11. Сложным аспектом использования рекомбинантных датчиков является их доставка в клетки. Гетерологические выражения требует использования вирусного вектора и многочасового ex vivo культивирования, что часто вызывает озабоченность в связи с потенциальной дедифференциацией или ухудшением функций клеток. Хотя модели мыши предварительно разработаны, чтобы выразить GCaMP решить эту проблему, они добавляют новые проблемы, увеличивая время работы существенно и ограничивая работу нечеловеческой модели. Очень высокая чувствительность к изменениям внутриклеточного рН является еще одной неблагоприятной стороной белковых датчиков12, что, однако, меньше проблем для зондирования колеблющихся сигналов, таких как Ca2 ".

Преимущество ловушки красителей (таких как зеленый флуоресцентный Fluo4) является то, что они могут быть загружены в свежеизолаженной ткани в течение часа. Как и следовало ожидать, ловушки красители имеют более низкие соотношения сигнала к шуму и (гораздо) ниже фотостабильности, чем их рекомбинантные аналоги. Мы не можем подтвердить13 сообщений о токсичности ловушки красителей14, однако, красителя перегрузки является частой проблемой.

Красный рекомбинантных датчиков Ca2 "на основе круговой перестановки быстро развиваются с 201115, и самые последние события представляют собой сильную конкуренцию GCaMPs16 для визуализации тканей, учитывая более высокую глубину проникновения красного света. Коммерчески доступные красные рекреты могут быть надежно использованы для одноклеточного изображения, но, на уровне тканей, не может хорошо конкурировать с зелеными аналогами.

Существует, казалось бы, очень мало выбора технологии визуализации для экспериментов в тканях, где вне фокуса свет становится критической проблемой. Конфокальная система обеспечивает приемлемое одноклеточное разрешение путем отмены внефокусного света с любой целью на NA выше 0.3 (в случае GCaMP6) или 0.8 (ловушка красителя). В техническом смысле, обычный конфокальный микроскоп может быть использован для одновременного изображения «Ca2»cyt из сотен (GCaMP) или десятков островков (ловушке красителя). Единственной реалистичной альтернативой конфокального режима в случае 3D-выражения датчика в тканях, возможно, является светолистовая микроскопия.

Вещи немного отличаются в случае, когда датчик выражается в периферийном слое клеток в области области области, а также для области. Для ярких рекомбинантных датчиков, которые имеют яркий внутриклеточный рисунок выражения, использование широкоугольного режима визуализации с целью с низким уровнем NA может обеспечить достаточное качество и вознаградить исследователя значительным увеличением области поля зрения и, следовательно, Пропускной способности. Широкополевой системы обеспечивает более слабое пространственное разрешение, так как свет вне фокуса не отменяется; поэтому визуализация тканей с высокой na (низкой глубиной резкости) целей является менее информативным, так как одноклеточный сигнал значительно загрязнен соседними клетками. Загрязнение гораздо меньше для целей с низким уровнем na (высокая глубина поля).

Однако существуют задачи, для которых высокая пропускная информация и/или частота выборки становятся критическим преимуществом. Кеты и к-клетки обладают существенной неоднородностью, что создает спрос на высокие размеры выборки, чтобы выявить вклад субпопуляций. Широкоугольное изображение является быстрым и более чувствительным, с промышленным масштабом большой поле зрения системы визуализации сотни (GCaMP) или десятки (Fluo4) островков в том же соотношении сигнала к шуму, как конфокальные эксперименты на десяти или одного островка, соответственно. Эта разница в пропускной связи делает широкополевую систему выгодной для визуализации населения с одноклеточным разрешением, что может быть особенно важным для небольших субпопуляций, таких как кон-клеточный. Аналогичным образом, попытки реконструировать электрическую активность от Ca2 'spiking 17 выиграют от более высокой частоты отбора проб, обеспечиваемых широкоугольным режимом визуализации. В то же время, несколько "нишевых" проблем, таких как активность поджелудочной железы и клеток при стимуляции доминирующей субпопуляции клеток, требуют использования конфокальной системы. Фактором, влияющим на решение о конфокальном режиме, является наличие существенного загрязняющих сигнала от субпопуляции к-клеток.

Хотя использование гормона конкретных антител окрашивания для проверки личности клеток после визуализации экспериментов по-прежнему вариант, незначительные субпопуляции клеток могут быть определены с помощью функциональных соединений маркера, таких как адреналин и грелин, которые были показаны избирательно стимулировать Динамику Ca2 "в No- 18 и No-клеток19,20, соответственно.

Анализ данных по замедленной визуализации направлен на предоставление информации, выходящих за рамки тривиальной фармакологии, такой как популяционная неоднородность, корреляция и взаимодействие различных сигналов. Условно, данные изображения анализируются как интенсивность по сравнению со временем и нормализуется до первоначальной флуоресценции (F/F0). Базовая коррекция часто необходима, в связи с обесцвечиванием сигнала фторрора или загрязнения изменениями в автофлюоресценции или рН (обычно индуцированных миллимолярных уровней глюкозы12). Данные Ca2 могут быть проанализированы по-разному, но три основные тенденции – это измерение изменений частоты спаеля, фракции плато или области под кривой, вычисленном по сравнению с временем. Мы сочли последний подход выгодным, особенно в применении к сильно недовыборным конфокальных данным. Преимуществом метрики PAUC является ее чувствительность к изменениям частоты сигнала и амплитуды, в то время как вычисление частоты требует значительного количества колебаний21, что трудно достичь с помощью обычных изображений. Ограничивающим фактором анализа PAUC является его высокая чувствительность к базовым изменениям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были разработаны в соответствии с Законом Соединенного Королевства о животных (научные процедуры) (1986 год) и этическими руководящими принципами Оксфордского университета.

1. Изолят мышонковые островки поджелудочной железы

  1. Подготовьте культурную среду и решение изоляции.
    1. Составьте культурную среду: RMPI1640 (см. Таблица материалов),дополненный 10% сыворотки плода теленка, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Распределите среду на две пластиковые блюда Петри по 60 мм (не обработанные клеем) и держите посуду в инкубаторе (37 градусов по Цельсию, 5% CO2,абсолютная влажность).
    2. Составьте изоляционный раствор (50 мл/мышь): среда Хэнкса с глюкозой 5 мМ, 100 единиц/мл пенициллина 100 мкг/мл стрептомицина. Храните на льду (4 градуса по Цельсию).
    3. Составьте ферментный раствор (например, Liberase): 0,2 мг/мл в изоляционном растворе, 2 мл на мышь. Храните на льду (4 градуса по Цельсию). Дополнительно, предварительно проверить активность liberase, и оптимизировать параметры инкубации для каждой партии фермента22.
  2. Введите ферментный раствор в желчный проток мыши.
    1. Пожертвуйте мышью (12-недельная самка, C57Bl/6J) через вывих шейки матки.
    2. Под микроскопом вскрытия, разрезать кожу и мышечные слои с помощью тонких ножниц и найти желчный проток.
    3. Свагтите кишечник с обеих сторон соединения с желчным протоком, используя хлопчатобумажную нить.
    4. Поднимите желчный проток осторожно с изогнутыми щипцы тонкой часовщика и ввести ледяной фермента раствор в проток е с помощью шприца 2 мл с иглой 30G. Инфляция поджелудочной железы должна наблюдаться на этом этапе.
    5. Соберите надувные поджелудочная железа, используя комбинацию тупых носовых щипцы большого пальца и щипцы тонкой часовщика в 15 мл соколиной трубки и держать его на льду (4 кК). Добавьте 1 мл ферментного раствора в трубку.
  3. Освободите и соберите островки поджелудочной железы из поджелудочной железы.
    1. Инкубировать панкреату, надуваемую ферментным раствором в течение 16 мин в водяной бане, при 37 градусах Цельсия. Нежная встряхивания может быть использована, но не является критическим, при условии, что инфляция была хорошей.
    2. Остановить пищеварение путем добавления раствора ледяной изоляции, до 10 мл. Аккуратно встряхните дайджест: он должен выпасть на мелкие кусочки.
    3. Вымойте дайджест три раза в 10 мл изоляционистского раствора, дайте постоять 5 мин при 1 х г, чтобы осадок освобожденных островков, на льду. Аспирируй супернатант мягко, с серологической пипеткой 10 мл.
    4. Добавьте холодный RPMI в дайджест (чтобы сделать до 10 мл).
    5. Используйте пластиковые блюда Петри (шаг 1.1.1), чтобы выбрать островки. Decant RMPI среды от одного из блюд Петри, и осторожно залить некоторые (4-5 мл) дайджест вместо. Соберите освобожденные островки, которые появляются как круглые, гладкие и высокой плотности штук, с пипеткой P10 во второй чашке Петри.
    6. Культура островков в инкубаторе (37 кВ, 5% CO2,абсолютная влажность). Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе. Оставив островки в течение 1-2 часов, как полагают некоторые, чтобы помочь оправиться от механического стресса во время изоляции.

2. Загрузите краситель или выразите датчик

  1. Приготовьте краской.
    1. Растворите аликот (обычно, 50 мкг) краппируемого красителя (например, Fluo-4) в ДМСО до концентрации запасов 2 мМ. Добавьте плуроновой кислоты к окончательной концентрации 1% (с использованием 20% бульона в DMSO), чтобы улучшить растворительизацию красителя.
    2. Aliquot красителя в небольших трубках ПЦР (2 qL в каждом). Краситель можно хранить замороженным (-20 градусов) в течение нескольких недель.
  2. Кроме того, подготовьте рекомбинантный датчик.
    1. Распределите датчик (например, аденовирусный вектор, кодирующий GCaMP6f) на 10 аликотов и храните при -80 градусов по Цельсию.
    2. (По желанию) предварительно проверить титр вирусного запаса, заражая островки (как ниже) с помощью нескольких серийных разбавлений, чтобы выявить оптимальную концентрацию для инфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные датчики, закодированные различными векторами (лентивирус, БакМам, AAV), требуют другого протокола инфекции. Убедитесь в том, чтобы проверить это с векторным поставщиком и оптимизировать соотношение рабочих для ваших нужд. "Рабочий" запас аденовируса может храниться при -20 градусов по Цельсию и несколько раз замерзать/размораживаться. Чрезмерная заморозка оттепели велосипеде снижает эффективный титр вируса.
  3. Подготовьте решение для визуализации.
    1. Составьте решение для визуализации, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl2, 1.2 MgCl2, 12PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7.4, с NaOH).
    2. Составьте запас глюкозы (0,5 М) и маннитола (0,5 М) в растворе визуализации. Бульон можно хранить в холодильнике (4 градуса По Цельсию) в течение нескольких недель.
  4. Загрузите краской.
    1. Составьте рабочий раствор красителя, растворив 2 л красителя в 600 л раствора визуализации, содержащего 6 мМ глюкозы. Раствор можно нагревать или вихрем для улучшения растворения.
    2. Загрузите островки, изолированные в шаге 1, в рабочий раствор красителя. Погрузка может быть сделано с помощью многоцветной тарелки или чашку Петри. В последнем случае поместите в капельку 100 л рабочего раствора на дно неклейкового блюда Петри (35- или 60 мм) и пипетку 10-30 островков в капельку.
    3. В случае различных групп островков (например, дикого типа/выбивания) организуйте несколько скважин и несколько капель, чтобы погрузка можно было сделать одновременно.
    4. Инкубировать островки в краситель рабочего раствора при комнатной температуре в темноте в течение 70-90 минут. Не перенасытить.
    5. Проверьте погрузку под флуоресцентным микроскопом; островки должны получить легкую флуоресценцию, с некоторыми клетками ярче, чем остальные. Округление клеток и ядерная локализация красителя являются признаками перегрузки.
    6. Перенесите островки в раствор без красителя, содержащий глюкозу 6 мМ. Островки могут быть использованы для визуализации немедленно, но по желанию краситель можно оставить для деэстерификат еще на 10-15 минут. Островки сохранят краситель в течение нескольких часов и поэтому могут быть использованы для визуализации в несколько смен.
  5. Кроме того, заразить островки с рекомбинантным вектором.
    1. Плита островков в каплях в RPMI культивирования среды (шаг 1.1.1) (например, 30 л), чтобы свести к минимуму объем переносчика необходимо.
    2. Добавить вектор в соотношении примерно 105 инфекционных единиц / наипятие, что в идеале должно привести к множественности инфекции В идеале соотношение должно быть оптимизировано к минимальному соотношению, которое обеспечило бы выражение в периферийном слое. Помогут предварительные действия (шаг 2.2.3).
    3. Ввести 20-50 островков в каплю и культуру на 8-48 часов. (В идеале, на ночь). Островки должны развивать слабый зеленый флуоресценции в большинстве клеток, без изменений в морфологии клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успех инфекции и экспрессии зависит от времени воздействия раствора вируса. В идеале, вирус должен оставаться в растворе на ночь, но может быть дополнительно удалены всего через 15 минут. Тем не менее, инфекционность, и, следовательно, выражение, вероятно, будет значительно ниже.

3. Динамика визуализации Ca2

  1. Обездвижить островки под (перевернутым) микроскопом.
    1. Соберите камеру изображения для перевернутой микроскопии. Расположите стеклянную крышку (толщина 1 или 1,5) внутри камеры и убедитесь, что интерфейс стеклянной камеры водонепроницаемый. Убедитесь, что coverslip находится в пределах досягаемости цели микроскопа (критически для случая громоздкой высокой цели NA).
    2. Подготовьте иммобили аксессуары. Отрежьте небольшие прямоугольники (20 мм х 20 мм) из тонкой сетки и грубой сетки. Введите два прокладки "стены" на тонкой сетке с помощью 45-50 мкм толщиной липкой лентой. Используйте двойные слои прокладки, если размер островков, которые будут изображены значительно превышает обычные 100 мкм.
    3. Погрузите сетку и вес в решение для визуализации, используя 35-мм чашку Петри. Убедитесь, что пластик и металл мокрые.
    4. Под микроскопом вскрытия, переверните тонкую сетку с прокладкой "стены" вверх дном, прокладки лицом вверх. Выберите несколько островков, загруженных крабируемым красителем или выражающим рекомбинантный датчик с пипеткой P20 и аккуратно расположите их поверх тонкой сетки, между двумя прокладками. Убедитесь, что сетка и шайбы не содержат чрезмерного количества решения изображения на них.
    5. Возьмите сетку с островками, используя щипцы часовщика, и расположите ее вверх ногами внутри камеры изображения, так что прокладки лицом вниз и сидеть прямо на камере крышкой. Убедитесь, что островки оказались в ловушке между прокладками и сеткой, в середине coverslip.
    6. Расположите грубую сетку и вес поверх тонкой сетки внутри камеры. Введите решение для визуализации в камеру. Убедитесь, что островки обездвижены и готовы к изображению. Избегайте чрезмерного встряхивания камеры (небольшие возмущения, такие как перенос камеры к микроскопу и вставка в нагретую стадию, являются приемлемыми).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный механизм иммобилизации может быть применен для вертикальной системы.
  2. Навязай микроскоп.
    1. Выберите режим изображения и цель, положение камеры с островками от шага 3.1 на контролируемой температурой стадии микроскопа.
      1. Установите контроль температуры (в идеале, между 30 и 36 градусов по Цельсию) и перифузии. Для перевернутой системы, положение притока ниже, чем отток внутри камеры, и установить поток оттока, чтобы быть больше, чем у притока (который обычно достигается с помощью трубки более широкого внутреннего диаметра на перистальтический насос).
      2. Убедитесь, что отток имеет минимальную контактную поверхность с раствором, так что он удаляет раствор в нескольких последовательных мелких капель, избегая длительных интервалов непрерывного удаления раствора. Последний является основным источником артефактов при замедленной визуализации периодических сигналов, поскольку они представляются как регулярные периодические колебания интенсивности каждого изображенного пикселя и часто интерпретируются как "медленные волны".
      3. Инициировать перифузию с помощью визуализации раствор, содержащий 3 мМ глюкозы.
    2. Выберите световой путь и фильтры для визуализации зеленых фторофоров; возбуждение между 470 и 500 и выбросов между 505 и 550 будет работать для каждого из них.
    3. Запустите живую визуализацию, чтобы настроить параметры изображения. Отрегулируйте представление для захвата островков интереса.
    4. Оптимизируйте соотношение сигнала к шуму изображения. С этой целью отрегулируйте интенсивность возбуждения света, время экспозиции и связующий. Убедитесь, что настройки позволяют четкую визуализацию каждой ячейки в пределах нагорья при минимально возможной интенсивности света и экспозиции.
    5. Выполните приобретение изображения. В зависимости от задачи, изображения могут быть приняты на 0,1 до 5 Гц. Это значительно ниже критериев Nyquist для быстрых колебаний Naиуправляемых в я-и-и-клетках (зgt;300 Гц), что означает, что данные недопроизбытываемы по умолчанию. Тем не менее, увеличение частоты приобретения, чтобы соответствовать этому требованию не представляется возможным в многоклеточной / многоэтажной визуализации с большим полем зрения. GCaMP можно отобразить быстрее, в то время как Fluo4 будет неизбежным отбеливателем при быстрых условиях приобретения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая, чтоколебания цитав клеток острова обусловлены электрической активностью, использование низких темпов приобретения может показаться контрпродуктивным. В действительности, однако, скорость приобретения на уровне около или выше 1 Гц может быть достаточно для решения хет-трик пики поведение13, в то время как порог для обнаружения натрия канала управляемых колебаний в К- и Й-клеток значительно выше 300 Гц. Независимо от того, приобретаютсяли колебанияцита в 1 Гц или 0,1 Гц, они будут сильно недопробиваемы мистрацией и отражать обработку Ca2 ячейкой, а не электрической активностью.
      1. Проверьте качество полученных данных: при глюкозе 3 ММ активность контора должна быть четко видна/обнаруживаемая. Убедитесь, что это так, и приступайке к полномасштабной визуализации замедленного времени.
  3. Визуализация замедленного времени
    1. Используйте онлайн-график динамики сигнала, реализованный в программном обеспечении приобретения, если это доступно. Если онлайн-график и не является вариантом, примените таблицу поиска, которая отображает интенсивность сигнала наиболее полным образом (например, "радуга").
    2. Примените стимулы в обратимым способом: запишите восстановление сигнала на базальном уровне. Игнорировать артефакты в самом начале и в конце записи; последний может выглядеть как необратимое "увеличение"/"уменьшение" флуоресценции зонда из-за изменений рН или клеточной смерти.
    3. Дифференцировать к-клетки по колеблющейся динамике Ca2 ,, при низкой глюкозе. Ввести адреналин или глутамат в раствор ванны, обратимо в течение 2-5 мин. За этим последует стремительный скачок в «Ca2»с последующим замедлением или отменой колебаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адреналин является признанным маркером соединения для к-клеток, что имеет селективное положительное влияние на эту субпопуляцию клеток абонестом, опосредовано освобождение Ca2 "из внутриклеточных депо18. Глютамат был выдвинут в качестве еще одного агониста23.
    4. Добавить/удалить грелин, который недавно сообщил, чтобы активировать к-клеток избирательно19,20. Обратите внимание на быстрое обратимое увеличение в «Ca2»cyt в небольшой субпопуляции клеток-изогеников.
    5. Добавить/удалить 20 мМ глюкозы. Наблюдайте скоординированный колебательный ответ в субпопуляции я-клеток. Обратите внимание на реакцию клеток, которые ранее были активированы адреналином или глутаматом и грелином.
    6. Сохранить последовательность изображений. Рассмотрите возможность использования "AutoSave" во время записи.

4. Анализ данных

  1. Проанализируйте замедленное изображение.
    1. Импортируйте замедленное изображение в программное обеспечение для анализа изображений, например, с открытым исходным кодом ImageJ/FIJI.
    2. Если во время записи произошло существенное/быстрое движение, отбросьте данные как невосстановимые. Используйте плагины StackReg или TurboReg24 для коррекции незначительных сугробов.
    3. Создайте изображение маски для обнаружения клеток и области, представляющих интерес (ROI) отображение. Предпочтительным способом достижения этой цели было бы сделать изображение стека, используя одну из функций, таких как "средняя интенсивность" или "максимальная интенсивность". Функция, которая будет использоваться является тот, который обеспечит лучшее признание отдельных клеток.
    4. Заменяйте изображение маски, удалите все данные за пределами области наикстов. Функция работает в автоматическом режиме для 32-битных изображений.
    5. Обнаружить максиму в изображении порога. Максима может быть представлена точками, регионами или даже секторами, если изображение плотное.
    6. Примените функцию «найти максиму» без каких-либо ограничений по размеру и вставьте обнаруженную максиму в интересуемый регион (ROI) редактор.
    7. Гладкая/интерполировать каждую из ROIs на карте; возможно, ROIs потребует расширения. Простой скрипт может быть написан для (4.1.6-4.1.8) и запустить несколько раз, чтобы обеспечить лучшие результаты обнаружения ячейки. Несколько ROIs может перекрываться, но это редко.
    8. Проанализируйте положение ROIs и вставьте соответствующие данные X и Y в программное обеспечение электронной таблицы (например, Microsoft Excel).
    9. Проанализируйте серую интенсивность по сравнению со временем для всех ROIs и вставьте данные в программное обеспечение электронной таблицы.
  2. Проанализируйте численные данные.
    1. Импортируйте данные в программное обеспечение для анализа данных. В зависимости от выбора программного обеспечения и продолжительности/выборки/размера эксперимента, это может быть простая операция копирования-вставки или автономная процедура. Обеспечить расположение и хранение численных данных.
    2. Импортируйте временные отметки или заметки о времени, если они доступны.
    3. Нормализовать данные интенсивности необработанных флуоресценции ("F") до начального значения флуоресценции ("F0"). Это не должно быть флуоресценции в самой первой точке, но может быть в среднем несколько первых точек. Нормализация должна уменьшить изменчивость данных и, в идеальном случае (без дрейфующих базовых) привести к анализируемому набору данных ("F/F0").
    4. Если вариативность ячейки к ячейке набора данных F/F0 все еще существенна (длительная запись, отбеливание), выполняйте коррекцию исходной линии. С этой целью определите область контроля, т.е. диапазон времени, в течение которого применялся контрольный раствор (для островков поджелудочной железы мыши, 3 ММ глюкозы без агонистов/антагонистов).
      1. Если область управления имеет четкий не колебляный сигнал, предположим, что F/F0 возвращался к первоначальному значению (F/F0No1) после каждого применения решения управления. Исправьте данные замедленного времени для каждой ячейки, разделив данные на сегменты, разделенные точками при добавлении решения управления, и применяя линейную коррекцию к каждому сегменту. Не используйте полиномиальную или другую нелинейную коррекцию, так как это приводит к артефактам.
      2. Если диапазон управления имеет четкие колебания или дополнительные факторы (такие как автофлуоресценция FAD), используйте алгоритм обнаружения шипов17. Тривиальный и быстрый бег вокруг для этого является максима чувствительных волнообразность преобразования(Рисунок 3A).
    5. Количественная оценка данных. Несмотря на то, что Ca2' является высокодинамическим сигналом, представление данных Ca2 с точки зрения абсолютных значений F/F0 является широко приемлемым в биомедицинской литературе. Если результаты нескольких экспериментов необходимо сравнить, выберите метрику.
      1. Измерьте частоту спайков Ca2 (рисунок 4A,D),и его ответ на добавление (муравей) агонистов. С этой целью разделите запись на равные временные интервалы и вычислите временной курс частичной частоты (частота пикирования в каждом из интервалов) путем подсчета шипов в интервале и нормализации к интервальной продолжительности.
      2. Кроме того, установите порог и вычислите фракцию плато (pf) для каждого из указанных выше интервалов(рисунок 4B,F). Фракция указывает процент времени в интервале, который ячейка провела в "возбужденном" состоянии.
      3. Кроме того, вычислить частичную область под кривой (pAUC) для каждого из интервалов, определенных выше(Рисунок 4C,G). Эта метрика чувствительна к изменениям как частоты, так и амплитуды пиков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из предостережений для измерения частоты является отсутствие чувствительности для продолжительности шипа и плохой стабильности. Поскольку данные сильно undersampled по сравнению с электрическим пиком, количество шипов на интервал довольно мал и, следовательно, единственный дополнительный всплеск может резко повлиять на результат. «Узким местом» ПАУК является его чувствительность к изменениям в базовом уровне. Несмотря на то, что pAUC менее подвержены артефактам и более чувствительны к изменениям в «Ca2»cyt, чем частота, PAUC, тем не менее, не очень информативны о характере динамики Ca2. Фракция плато является расширением концепции открытой вероятности в цельноклеточной системе. Это менее надежным, чем PAUC, хотя, из-за его зависимости от порогового значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Островки загружаются довольно хорошо с ловушками красителей(Рисунок 1А), если липидный состав мембраны был затронут (например, в результате хронического воздействия жирных кислот). Вектор аденовируса человека типа 5 (Ad5) также нацелен на все клеток-разыскных займ(рисунок 1В). Проблемы могут возникнуть, когда в одной клетке выражается более одного рекомбинантного датчика. Кроме того, островки, как правило, очень хорошо обездвиже...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В протоколе есть три этапа, которые имеют решающее значение для общего успеха. Успешная инъекция фермента Liberase в желчный проток определяет не только количественный успех процедуры изоляции, но и влияет на качество изолированных островков. Нераздутая панкреата может привести к отсутствию некоторых важных метаболических реакций в изолированных островках. Во-вторых, загрузка красителя/выражения датчика определяет соотношение сигнала к шуму записи замедленного времени. Сигналы отсутствуют или ослаблены в перегруженных ос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

AH был получателем Диабет Великобритании PhD Studentship, EV была поддержана OXION-Wellcome Целевой учебной программы, AIT провел Оксфорд биомедицинских исследований Совета постдокторской стипендий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40x/1.3
Axiovert 200 микроскоп
излучение
Возбуждение
Фетальная бычья сывороткаSigma-AldrichF7524-500ML
Fluo4Thermo Fisher (Life Technologies)F14201
GCaMP6f, in (тип человека 5) аденовирусный векторVector Biolabs1910
ХэнксаThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
ЛиберазаСигма-Олдрич5401020001
пенициллин/стрептомицинThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)15140122
средний RPMIThermo Fisher (GibCo, Life Technologies)61870044
Конфокальная система Zeiss LSM510-METACarl Zeiss
Объектив раствор

Ссылки

  1. Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629(1995).
  2. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).
  3. Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).
  4. Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).
  5. Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).
  6. Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).
  7. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137(2001).
  8. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  9. Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97(2014).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
  13. Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).
  14. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11 (515), 2039(2018).
  15. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  16. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727(2016).
  17. Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).
  18. Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  19. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  20. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  21. Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9 (4), 93826(2014).
  22. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  23. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  24. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  25. Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).
  26. Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. , (2018).
  27. Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).
  28. Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8 (2), 48-56 (2016).
  29. Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).
  30. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  31. Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).
  32. Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).
  33. Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).
  34. Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).
  35. Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).
  36. Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).
  37. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
  38. Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).
  39. Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  40. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  41. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  42. van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи