Ячейки бесплатно белка выражение с использованием быстро растущих бактерией Vibrio natriegens

Краткое содержание

Ячейки свободного выражения системы являются мощными и экономически эффективных инструментов для высок объём синтез и проверка важных белков. Здесь мы описываем подготовку системы выражение протеина, клетки бесплатно, с помощью Vibrio natriegens для быстрого белок производства с использованием плазмида ДНК, линейной ДНК и мРНК шаблон.

Аннотация

Морских бактерией Vibrio natriegens получил большое внимание как возникающих микробной хост для биотехнологии из-за ее быстрые темпы роста. Это общий протокол описан для подготовки V. natriegens сырой клеточных экстрактов с использованием общего лабораторного оборудования. Этот высокий уступая протокол был специально оптимизирован для доступа пользователя и снижение стоимости. Синтез белков, клеток бесплатно (СЛТ) может осуществляться в малых масштабах 10 мкл пакетного реакции в формате 96 - или 384-Ну и можно воспроизвести дает концентрации > 260 мкг/мл супер папки GFP (sfGFP) в течение 3 ч. в целом, сырой сотовый экстракт подготовка и СЛТ может быть достигнуто в 1−2 суток одним пользователем. Этот протокол может быть легко интегрированы в существующие трубопроводы синтез белков для облегчения достижения в био производство и синтетической биологии приложений.

Введение

Синтез белков, клеток бесплатная является универсальным и экономичным методом для выражения ценные белки и пептиды^1,2,3,4. Исторически синтез белков, клеток бесплатно была выполнена с помощью кишечной палочки выражение систем; Однако был недавний всплеск в использовании альтернативных, -модель организмов с Роман свойствами в качестве шасси для свободных клеток выражение^{5,6,,78,9 , 10 , 11 , 12}. организмы с уникальными метаболические профили являются первоочередными кандидатами альтернативных систем свободных клеток кишечной палочки . Например морской бактерией Vibrio natriegens является самым быстрорастущим всех известных организмов с наблюдаемыми удвоение время менее чем 10 минут¹³. Это получил V. natriegens значительное внимание как возникающих микробной хост для исследований и биотехнологии^{14,,1516,17,18}. Учитывая, что быстрый прирост V. natriegens были связаны с высоким уровнем синтеза белка и метаболические эффективность^19,20,21, использование ее клеточными для клеток бесплатно синтез может значительно расширить инструментарий для быстрой белок производства и высокопроизводительного скрининга.

Недавно, клетки бесплатно V. natriegens выражение системы была продемонстрирована, который способен производить супер папку GFP (sfGFP) в концентрациях > 260 мкг/мл в 3 h с T7 промоутер⁹. Общая цель разработки этого метода было предоставить пользователям весьма доступными, экономически эффективным, воспроизводимые и высокоурожайных свободных клеток белка выражение системы, которая может быть подготовлен с использованием общих лабораторное оборудование в короткий промежуток времени. Этот протокол использует 1 Л культур в колбах, трясти, лизис клеток, пульс sonication и мелкие партии реакции в формате 96 - или 384-Ну чтобы максимизировать распараллеливания и скрининг пропускную способность. Длинные, устойчивый белков стало возможным благодаря добавок 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA)^22,8,источник энергии²³. После успешного завершения этот протокол, пользователь будет иметь возможность выразить желаемого белка или извлечь набор белков в формате свободной ячейки с использованием V. natriegens сырой клеток.

Начиная от глицерина запас, V. natriegens сырой клеточных экстрактов готовятся из клеток, собирают в оптической плотности на 600 Нм (₆₀₀OD) 1.0. 1 Л культура даст около 2−3 мл экстракт, который является достаточным для более чем 800 свободной ячейки реакций на 25% сырой сотовый экстракт. Белки могут быть выражены с помощью плазмида ДНК, линейной ДНК или шаблон мРНК; Однако линейная ДНК шаблон деградации эндогенного nucleases остается основным недостатком при использовании системы дикого типа V. natriegens сотовый бесплатно⁹. Начиная от V. natriegens культур, белка для нисходящие приложения может быть достиган одного пользователя в 1−2 суток.

Протокол

1. Подготовка V. natriegens сырой клеток экстракты – бактериальной культуры

1. Подготовьте V. natriegens бактериальных питательных сред LB-V2 согласно таблице 1. Стерилизация автоклавированием роста средств массовой информации. Разрешить СМИ достичь комнатной температуры (RT). Хранить излишки средств массовой информации на RT.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Носите надлежащей индивидуальной защиты (СИЗ) и консультироваться лаборатории конкретные инструкции при работе в автоклаве.
2. Используйте глицерин запас дикого типа V. natriegens для инокуляции 3 мл LB-V2 средств массовой информации. Растут на ночь при 30 ° C при встряхивании в 225 об/мин.
3. Вымыть 1 мл ночь культуры центрифугированием в 10 600 x g на настольная центрифуга за 1 мин аспирата супернатант не нарушая результате гранулы и Ресуспензируйте в 1 мл свежего LB-V2 средств массовой информации.
4. В газобетона 4 L озадачен колбу Эрленмейера с стерильные Обложка, добавить 1 Л свежих LB-V2 питательных сред. Прививать с использованием 1 мл промывают ночь культуры (1:1, 000 коэффициент разрежения). Расти культура при 30 ° C при встряхивании в 225 об/мин.
   Примечание: V. natriegens культур может масштабироваться вверх или вниз при сохранении коэффициента разрежения 1:1,000. Например добавьте, что 250 мкл промывают ночь культуры до 250 мл свежего LB-V2 питательных сред в 2 L озадаченного колбу Эрленмейера с стерильных крышкой.
5. Контролировать культуры ОД₆₀₀ с помощью спектрофотометра. Когда культура достигает₆₀₀ OD = 1,0 ± 0,2, урожай культуры через центрифугирования в 3500 x g 20 мин при 4 ° C. Пелле место на льду.
   Примечание: V. natriegens растет быстрыми темпами, поэтому пристальное наблюдение за культуры является необходимым. Рост к ОД₆₀₀ = 1.0 должно быть приблизительно 1.5−2 h 1:1,000 коэффициент разрежения.
6. Аспирационная супернатант и сразу же хранить полученный бактериальных Пелле-80 ° c или непосредственно перейти к ячейке лизиса, описанные в разделе 2.
   Примечание: Этот шаг является хорошим остановочный пункт; Однако рекомендуется, что гранулы обрабатываться немедленно или в течение 1−2 дней для достижения наилучших результатов.

2. Подготовка V. natriegens сырой клеток экстракты – Lysis клетки

1. Подготовка буфера lysis S30 согласно таблице 1 в стерильной деонизированной воды (DI) и Отрегулируйте пэ-аш до 7,7 с использованием уксусной кислоты кристаллизированной.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Ледниковая укусная кислота следует подходить с надлежащей СИЗ при корректировке pH.
2. Прохладный S30 литического буфера до около 4 ° C в холодильнике или на льду перед началом процедуры лизис клеток.
   Примечание: Для быстрого охлаждения, лизис буфера могут быть размещены в-20 ° C. Не позволяйте буфер для замораживания.
3. Место клетки окатышей на льду 10−20 мин, или до тех пор, пока полностью разморозить. Ресуспензируйте все гранулы, вытекающие из той же культуры 1 Л, используя 10 мл холодного буфера lysis S30, затем передать подвеска 50 мл трубки. Если гранулы не замораживания в морозильной камере при температуре-80 ° C на шаге 1.6, перейти непосредственно к ресуспендирования.
   Примечание: Увеличьте объем буфера lysis S30 используется для первоначально Ресуспензируйте гранул при необходимости.
4. Центрифуга подвеска на 3500 x g 10 мин при 4 ° C. Аспирационная супернатант не нарушая гранулы. Помойте лепешка во второй раз с помощью 10 мл холодного буфера lysis S30. Пелле место на льду.
5. В холодной комнате добавьте 500 мкл буфера lysis холодной S30 в Пелле в Тюбик 50 мл. С помощью пипетки широкий родила подсказка, Ресуспензируйте гранул и тщательно передавать весь Пелле подвеска в 2-мл пробирку.
   Примечание: Если широкий родила пипетки не доступен, используйте ножницы, чтобы сократить к концу 1 мл наконечник пипетки увеличить диаметр гранул передачи.
   1. Передавать столько Пелле как можно без существенного увеличения объема; Однако Пелле следует высокомобильна в достаточное количество жидкости для sonicated, как указано в однородной взвеси в 2-мл пробирку. Не переполняйте 2-мл пробирку. Подвеска не должен превышать 1,5 мл; разделить на несколько трубок при необходимости.
6. Держите клетки гранул на льду и работать в холодной комнате. Заполните 600 мл стакан со льдом и место 2 мл Трубодержатель поверх льда.
   Примечание: Это полезно поместить Трубодержатель вблизи стороны стакан, так что подвеска Пелле будет видна во льду, чтобы следить за sonication (см. Рисунок 1).
7. Вихревой приостановлено Пелле в 2-мл пробирку кратко для гомогенизации клетки, открыть Флик трубы, чтобы удалить любые клетки в нижней части крышки и место в держатель трубы с крышкой. Нижний sonicator наконечник в подвески, так что это просто под поверхностью жидкости.
8. Подготовьте sonication настройки, как показано на рисунке 2 с помощью sonicator и зонд с диаметра кончика ⅛-дюймовый. Введите следующие параметры в sonicator управления: 20 кГц частоты и амплитуды 50%, пульс на время: 10 s, время выключения импульса: 60 s.
9. Запустите протокол sonication импульса для трех циклов. Если общий объем Пелле подвеска > 500 мкл, запустите протокол sonication пульс шесть раз.
   Примечание: Как правило 3−6 импульсов достаточно, чтобы лизировать V. natriegens окатышей; Дополнительные импульсы могут потребоваться в зависимости от sonicator. Во время sonication используют платформу ручку регулировки для перемещения зонда вверх и вниз, чтобы лизировать Пелле, которые могут поселились в нижней части трубки. Трубы могут быть удалены из держателя и кратко vortexed для повторного гомогенизировать подвеска между импульсами. Смотрите обсуждение ниже для нужной консистенции sonicated клеток.
   ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Носите средства защиты органов слуха соответствующие при активном sonicator.
10. После sonication центрифуги сырой сотовый экстракт на 16000 x g для 30−45 мин при температуре 4 ° C или до тех пор, пока lysate свободной от любой сотовой мусора, как изображено на рисунке 3.
11. В холодной комнате, аликвота 50 мкл результате supernatants для новых 2 мл трубки не нарушая гранулы.
    Примечание: любой мусор, которые передаются случайно в новой трубы 2 мл резко снизит экстракт в емкость для высокой уступая синтеза белка.
    1. При необходимости, отложите 10 мкл ячейки извлечь для количественной оценки после лизиса белка в отдельном 2 мл трубки (см. шаг 2.13 ниже).
12. Вспышки заморозить сырой клеточных экстрактов, поместив трубы в держатель трубы с окуная строку прилагается как изображено на рисунке 4. Погружаться трубы в Дьюара с жидким азотом и сразу же место в холодильнике при температуре-80 ° C до использования.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты для обработки жидкого азота, включая лаборатории пальто, защитные очки, защитная маска, криогенное фартук и перчатки.
13. При необходимости количественного определения общего белка клетки lysate используя 10 мкл задать помимо шаг 2.11.1 путем разбавления образца масштаба 1: 100 в 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и с помощью количественной оценки пробирного любого стандартного общего белка как assay Брадфорд, bicinchoninic кислота анализа (BCA), и т.д.

3. подготовка компонентов реакции клеток бесплатно

1. Общие реакции компонентов
   1. Подготовка рабочих запасов мг-глутаминовой кислоты и K-глутамата в трубы 50 мл стерильной водой ди в концентрациях 100 мм, 2000 мм, соответственно.
   2. Подготовьте рабочий запас 50% (w/v) полиэтиленгликоля (PEG) -8000, добавив 100 мл стерильного ди воды в стакан 250 мл. Место небольшой магнитной мешалкой в стакан. Весят, 50 г, ПЭГ-8000 и добавить 100 мл воды в стакан.
   3. Поместите стакан на набор плита с подогревом перемешать до 100 ° C и размешать в 250 об/мин до ПЭГ-8000 в растворе. Разрешить ПЭГ-8000 жидкой смеси остыть перед передачей 50 мл трубки.
2. Мастер энергоносителей решение
   1. Подготовьте 5 М растворе KOH, добавив 140 g Кох гранул до 500 мл стерильной воды ди.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Готовить это решение в химические вытяжки и носить СИЗ при обработке прочные основы. Решение будет нагреваться так крышку бутылки должны быть свободными для предотвращения повышения давления. Дайте раствору Кох достичь RT перед использованием.
   2. Подготовьте буфера HEPES-Кох 1750 мм, добавив 20.85 g HEPES бутылка 100 мл. Медленно добавьте стерильной ди воды до тех пор, пока объем достигает 40 мл. Вихревой бутылка распустить HEPES. Используйте 5 M Кох решение скорректировать рН 8.0 и затем доводят объем раствора до 50 мл.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Кох должны обрабатываться с надлежащей СИЗ при корректировке pH.
   3. Подготовить остальные 10 x компонентов мастер смесь запасов энергии в концентрациях, указанных в таблице 2 в стерильной воде ди и место каждой акции на льду. Оттепель запасов АТФ, ГТФ, CTP и UTP 100 мм на RT и место на льду.
      Примечание: Распустить реагентов в раствор при необходимости может использоваться thermomixer, 37 ° C и 350 об/мин. Не перегреть или оставить реагентов на thermomixer для длительного периода времени.
   4. В 15 мл трубку добавьте каждый компонент Мастер смесь энергии решения в соответствии в порядке и объеме, указанных в таблице 2. Вихрь решение после добавления каждого компонента. Это позволит сделать 5 мл 10 x решения мастер энергобаланса.
   5. 10 x мастер энергоносителей решение разделите 200 мкл аликвоты в 2 мл пробирок. Вспышки заморозить каждый Алиготе, выполненной на шаге 2.12. Немедленно поместите их в морозильную камеру-80 ° C до использования.
3. Мастер смесь аминокислот
   1. Для приготовления свежих 4 x мастер смесь аминокислот, начните оттаивания каждой аминокислоты акции в RT и затем помещая каждый на льду. Использование вихря и/или thermomixer установить при 37 ° C и 350 об/мин для обеспечения всех запасов аминокислоты полностью растворены.
      Примечание: Цистеин не может полностью раствориться; его можно добавить в мастер смесь аминокислот как подвеска. Не перегреть или оставить реагентов на thermomixer для длительного периода времени.
   2. В 15 мл трубку, добавить соответствующий объем аминокислоты в стерильной воде ди так что конечная концентрация каждого составляет 8 мм в следующем порядке: Ала, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, его, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, Чет, Валь, ТРП, TYR , Леи и КМС. После добавления каждой аминокислоты, вихревой мастер смешать раствор. Тома, перечисленные в таблице 2 составит 2,4 мл мастер смеси аминокислот.
   3. Делят 4 x мастер смесь аминокислот на 200 мкл аликвоты в 2 мл пробирок. Вспышки заморозить каждый Алиготе, выполненной на шаге 2.12. Сразу же место в холодильнике при температуре-80 ° C до использования.
4. Производство реакции готовые плазмида ДНК шаблона
   Примечание: Выражение протеина, клетки бесплатно в этой системе была оптимизирована с помощью вектора выражения Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) супер папку T7-pJL1-sfGFP (Таблица материалов). Рекомендуется использовать этот плазмида как элемент управления для эффективности реакции свободных клеток и pJL1 основой для клонирования и выражение других белковых последовательностей. Можно использовать другие шаблоны ДНК плазмиды; Однако важно отметить, что транскрипция контролируется последовательность промоутер T7 и наличие полимеразы T7 RNA. Ниже приводится простой протокол для крупномасштабного производства любой шаблон плазмида ДНК из преобразованного E. coli .
   1. Очищайте желаемого vector, используя комплект для очистки плазмида согласно инструкции производителя (Таблица материалов).
      Примечание: Концентрации плазмида ДНК шаблон как можно больше рекомендуется встретиться плотный объем ограничений реакции клеток бесплатно. В общем цель 750−1500 нг/мкл рабочего запас.
5. Производство реакции готовый шаблон мРНК
   Примечание: Этот раздел является необязательным. Выражение протеина был протестирован с помощью шаблона mRNA полученные в vitro транскрипция плазмида T7-pJL1-sfGFP, перечисленных T7 РНК-полимеразы (Таблица материалов).
   1. Подготовка шаблона mRNA от плазмидной ДНК, шифруя протеин интереса, с использованием компонентов реакции в vitro транскрипция в таблице 3. Инкубируйте реакций за 1 ч при 37 ° C в Термоциклер.
      Примечание: Рекомендуется для выполнения 8−10x этих реакций параллельно для создания достаточно материала.
   2. Объединить все транскрипции реакций. Очищают с помощью мРНК очищения и концентратор kit согласно инструкции производителя (Таблица материалов). Элюировать шаблона mRNA в стерильную воду ди. Сохранить шаблон мРНК-80 ° c до использования.

4. выполнение свободных клеток с помощью реакции белков Eexpression V. natriegens сырой экстракт

1. Бесплатный мобильный белков с помощью линейной ДНК шаблон или плазмиды
   1. Удаление 10 x энергоносителей решение мастер и 4 x аликвоты мастер смесь аминокислот из морозильной камеры-80 ° C, оттепель в РТ и место на льду. Удаление T7 РНК-полимеразы и АБС битор РНКазы запасов из морозильной камеры-20 ° C и место на льду. Оттепель ДНК шаблон в RT и место на льду.
   2. Подготовка мастер смесь свободных клеток реакции согласно таблице 4 каждого компонента, добавив их в 2-мл пробирку на льду в следующем порядке: мастер смесь аминокислот, мастер энергоносителей решение, мг глутамата, K-глутамата, ДНК шаблон, ПЭГ-8000, T7 РНК-полимеразы и РНКазы ингибитор. Осторожно проведите трубки после каждого дополнения в главный микс.
      Примечание: Если линейный шаблон будет использоваться для выражения протеина, клетки бесплатно, добавьте 5−10x, дает больше материала по сравнению с плазмида шаблон для получения ощутимого белка.
   3. Удаление V. natriegens сырой клеток lysate подготовлен на шаге 2.12 от-80 ° C морозильники и место на льду для 10−20 мин до тех пор, пока растаяло. Добавьте соответствующий объем сырой ячейки извлечь в реакции клеток бесплатный мастер смесь согласно таблице 4 и осторожно перемешать, стряхивая или закупорить вверх и вниз.
   4. Концевой свободных клеток белков с помощью Термоциклер
      1. Пипетка 10 мкл реакции клеток бесплатный мастер смеси в нижней части пластины ПЦР 96 - или 384-хорошо. Между каждой передачи ПЦР-планшете, смешать Мастер микс, стряхивая трубка мягко.
         Примечание: Бесплатный сотовый реакция мастер смесь следует хорошо смешиваются во все времена для максимальной реакции воспроизводимость и выражения протеина, клетки бесплатно во всех образцах.
   5. Кратко центрифуга пластину на 1000 x g 10 s объединить любой мастер смесь, которая может стать застрял на сторонах скважин. Уплотнение скважин с клейкой пластины для предотвращения испарения и затем поместить пластину ПЦР в Термоциклер заход в 26 ° C с подогревом крышкой на 105 ° C.
      Примечание: Равномерное распределение тепла и подогревом крышка Термоциклер значительно улучшает урожайности выражения протеина.
   6. Инкубируйте реакции клеток бесплатно как минимум 3 ч. После инкубации выраженной белки могут очищенный, количественно и используется для технологических процессов.
      Примечание: Выраженная белки могут быть непосредственно количественно в реакции свободных клеток с помощью метода выбора пользователя. Например флуоресцентные белки могут быть количественно с помощью внешних калибровочной кривой или радиоактивности могут быть измерены при использовании radiolabeled аминокислоты в реакции клеток бесплатно. Спектроскопия УФ видимым или анализов общего белка обычно не рекомендуется для непосредственно измерения производства белка в свободной ячейке реакции без начальной очистки.
   7. Кроме того отслеживать клетки бесплатно белка кинетики выражение с помощью пластины читателя.
      1. Пипетка 10 мкл реакции клеток бесплатный мастер смеси в нижней части плиты черного 384-ну пробирного с ясно стеклянный днищами. Держите пробирного пластины на льду или работать в холодной комнате при добавлении мастер смесь, чтобы обеспечить, что получается полная кинетическая профиль. Уплотнение скважин с четкой плиты клей для предотвращения испарения и затем поместить пластину пробирного в тарелку читателя на 26 ° C.
   8. Инкубируйте реакции клеток бесплатно для 3−6 h контролируя длин волн соответствующие флуоресцентные возбуждения/выбросов, соответствующие выраженным белком. Например, мониторинг в Ex / Em = 485 Нм/528 Нм для sfGFP.
2. Выражение протеина, клетки бесплатно, с использованием шаблона mRNA
   1. Оттепель мРНК шаблон подготовлен на шаге 3.5.2 в RT и место на льду.
   2. Выполните шаг 4.1.1 через шаг 4.1.6, ранее указанное для линейных или плазмида ДНК шаблон с помощью таблицы 4 подготовить альтернативные реакции клеток бесплатно Мастер смесь для шаблона mRNA.

5. Калибровка V. natriegens клеток свободной реакции с sfGFP

Примечание: Этот раздел является необязательным. Концентрация ионов оптимальной реакции свободных клеток может незначительно отличаться для каждого незрелая выдержка подготовки на основании условий, используемых для лизиса клеток. Рассмотрите возможность выполнения протокол калибровки Факультативный свободных клеток реакции Ион описанные ниже, используя sfGFP, если реакция урожайности значительно ниже, чем ожидалось (концентрации < 1,0 мкг/мл).

1. Подготовьте мг^{2 +} и K⁺ Ион калибровочные растворы, указанных в таблице 5 в стерильной воде ди от 2000 мм и 100 мм Mg глутамата K-глутамата запасов, подготовленную на этапе 3.1.1. Место калибровочные растворы на льду, пока он не понадобится.
2. После калибровки карту в таблице 6 Пипетка 1 мкл мг-глутамата и 2 мкл K-глутамата Ион калибровки решений в соответствующих скважины в 384-ну ПЦР-планшете.
   1. Порядок операций этот шаг является следующим: Пипетки мг глутамата Ион калибровочный раствор в нижней части каждой хорошо следуют калибровочный раствор ионов K-глутамата на стороне хорошо без касатьться жидкость уже присутствует в скважинах.
   2. Уплотнение скважин, поместив клей поверх плиты для предотвращения испарения при подготовке калибровки реакции клеток бесплатный мастер микс. Аккуратно нажмите пластину 384-хорошо смешать мг - и K-глутамата калибровочные растворы.
      Примечание: Репитер пипетки настоятельно рекомендуется для завершения этого шага можно воспроизвести и быстро.
3. Подготовьте калибровки реакции клеток бесплатный мастер смеси, указанных в таблице 5 с помощью шаблона дна плазмиды T7-pJL1-sfGFP в 2-мл пробирку. Добавить в мастер смесь каждого компонента в следующем порядке: мастер смесь аминокислот, мастер энергоносителей решение, шаблон T7-pJL1-sfGFP ДНК, ПЭГ-8000, T7 РНК-полимеразы и АБС битор РНКазы. Осторожно проведите трубки смешивать после каждого добавления компонента.
   Примечание: Не добавляйте мг^{2 +} или K⁺ для калибровки ячеек бесплатный мастер микс.
4. Удалите клей от пластины. Тщательно Пипетка 7 мкл калибровки реакции клеток бесплатный мастер смеси на сторонах скважин без касатьться смешанных Ион калибровочный раствор уже присутствует в скважинах. Запечатывание скважин с клеем и аккуратно коснитесь пластину ПЦР 384-хорошо смешать клетки бесплатный мастер микс с Ион калибровочный раствор.
   Примечание: Репитер пипетки настоятельно рекомендуется для завершения этого шага можно воспроизвести и быстро.
5. Кратко центрифуга плиты 1000 x g 10 s объединить любой несмешанных жидкости, которая может стать застрял на сторонах скважин. Место пластину 384-Ну в Термоциклер заход в 26 ° C с подогревом крышкой на 105 ° C.
6. Инкубируйте реакций клетки бесплатно для 3 h. После инкубации, передавать содержимое каждой скважины на черный 384-ну пробирного пластины с стеклянный днищами с многоканальные пипетки и читать флуоресценции sfGFP на Ex / Em = 485 Нм/528 Нм, с помощью читатель пластины для определения комбинации концентрации ионов, дает наибольшее количество белка.

Результаты

Описывается протокол для производства белка, используя V. natriegens свободных клеток выражение системы может выполняться в 1−2 суток одним пользователем, начиная от прививки культуры белка для нисходящие приложения. Подготовка сырой клеточных экстрактов и мастер смесь запасы составляют значительную часть этого времени; Однако после подготовки, большинство массовых реагентов может быть хранимой долгосрочной перспективе (Таблица 7) и используется по мере необходимости, сократить время необходимо завершить работу над протоколом.

Выражение системы, описываемой лучше всего использовать с плазмида ДНК шаблон или мРНК, порожденных в vitro транскрипция реакций. В то время как линейная ДНК также может использоваться в качестве шаблона для производства белка, он дает значительно меньшее количество белка. Например в условиях оптимальной реакции на 26 °C, один 10 мкл реакции свободных клеток может производить > 260 мкг/мл sfGFP в 3 часа, используя 0,3 пмоль плазмида ДНК шаблона или сопоставимых > 125 мкг/мл sfGFP, используя 14 пмоль мРНК Стенограмма (Рисунок 5A Б). Тем не менее 0,3 пмоль линейной ДНК будет производить значительно меньше белка (< 20 мкг/мл). Для каждого шаблона типа большинство белка будет производиться в рамках 1−1.5 h; Однако рекомендуется, что реакция выполняется как минимум 3 часа. Бесплатный сотовый реакция концентрации sfGFP были определены через линейная регрессия с использованием очищенной sfGFP калибровочной кривой измерения флуоресценции в Ex / Em = 485 Нм/528 Нм.

Доходность производства белка значительно зависит от концентрации ионов калия и магния (K⁺ и мг^{2 +}, соответственно). Оптимизированных условиях было установлено, что оптимальным мг^{2 +} и концентрации ионов K⁺ будет 3,5 мм и 80 мм, соответственно (рис. 6A, B). Отклонения от оптимального ионной концентрации может привести к снижение потенциала для ячейки свободного выражения системы для производства белка с заметных урожайности. Дополнительная калибровка может быть необходимо, если реакция урожайности значительно ниже, чем ожидалось. Факультативный протокол для иона калибровки описан в разделе 5. Это позволяет обеспечить определенную гибкость при возмещении сырой сотовый экстракт изменчивость понесенных от отдельных клеток лизис оборудования и условий.

Рисунок 1: В увеличенном держателя стакан и трубка на платформе sonication. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: экстракт Sonication оборудования установки подготовки нефти клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: представление Пелле после sonication и центрифугирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Flash замораживания провал для хранения экстракт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Представитель результаты для V. natriegens свободных клеток белкового синтеза, с использованием различных шаблонов типов. (A) конечной точки Пробирная sfGFP производства с использованием эквимолярных концентрации плазмиды и линейной ДНК шаблон (0,3 пмоль), а также повышение концентраций мРНК шаблона. Концентрация свободных клеток sfGFP был определен с использованием стандартной кривой очищенный sfGFP измеренные на Ex / Em = 485 Нм/528 Нм после 180 минут инкубации на 26 ° C в условиях оптимальной реакции в 10 томах мкл. (B) кинетического анализа sfGFP производства с использованием эквимолярных концентрации плазмиды и линейной ДНК шаблон, а также повышение концентраций мРНК шаблона. sfGFP измерения проводились каждые 3 минуты на Ex / EM = 485 Нм/528 Нм более 180 минут время всего инкубации в условиях оптимальной реакции в 10 томах мкл. Для конечной точки и кинетические анализов образцы были пустыми корректируются с помощью свободных клеток реакций, дополняют все компоненты за исключением шаблона. Показано среднее значение и стандартное отклонение (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: представитель результаты для калибровки концентрация иона. (A) V. natriegens клеток свободной реакции были дополнены с увеличением концентрации Mg^{2 +} и инкубированы на 26 ° C 180 минут в 10 мкл реакциях. Общая концентрация K⁺ был 160 мм для всех мг^{2 +} концентрации. Концентрация свободных клеток sfGFP был определен с использованием стандартной кривой очищенный sfGFP измеренные на Ex / Em = 485 Нм/528 Нм. (B) V. natriegens свободных клеток реакции были дополнены с увеличением концентрации K⁺ и инкубированы на 26 ° C для 180 мин в 10 мкл реакциях. Общая концентрация Mg^{2 +} было 3,5 мм для всех K⁺ концентрации. Для обоих калибровок образцы были пустыми корректируются с помощью свободных клеток реакций, дополняют все компоненты за исключением шаблона. Показано среднее значение и стандартное отклонение (n = 3). Этот рисунок был изменен с Wiegand et al.⁹. Перепечатано с разрешения Wiegand, D.J., ли, Его Высочество, остров, н., Церковь, г.м., создания свободных клеток Вибрио natriegens выражение системы. ACS синтетической биологии. 7 (10), 2475−2479 (2018). Авторское право 2018 американского химического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1 а	Подготовка LB-V2 бактериальных питательных сред
Компонент	Количество (g)	Конечная концентрация (мм)	Окончательный объем (Л)
LB отвара (Миллер)	25		1
NaCl	11,69	200
2 MgCl	2.20	23.1
ДКК	0.31	4.2
Таблица 1 B	Подготовка S30A буфера Lysis
Компонент	Количество (g)	Конечная концентрация (мм)	Окончательный объем (Л)
Tris раствор (pH 8.0) - 1 M (мл) *	25	50	0.5
MG-глутаминовой кислоты	2.72	14
K-глутаминовой кислоты	6.10	60
Дитиотреитол (DTT) - 1 M (мл) *	1	2

Таблица 1: Реагенты для подготовки 1 LB-V2 бактериальных питательных сред и 0,5 Л буфера lysis клетки S30A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel. 

	Подготовка 10 x энергии решения Мастер микс
Компонент	Концентрация запасов (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл)	Окончательный объем (мкл)
HEPES-Кох рН 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA от кишечной палочки ОРЖМО 600 (мг/мл) *	100	2	100.00
Коэнзим А гидрат	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
Лагерь	650	7.5	57.69
Folinic кислота	100	0,7	35.00
Спермидина	1600	10	31.25
3-PGA	2000 года	300	750.00
Стерильные деионизированной воды			49,99
	Подготовка 4 x аминокислоты Мастер микс
Компонент	Концентрация запасов (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл)	Окончательный объем (мкл)
АЛА	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
АСЦ	168	8	114.3
ASP	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
ЕГО	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
ВСТРЕТИЛ	168	8	114.3
ПЛАСТИНЧАТЫЕ ТЕПЛООБМЕННИКИ	168	8	114.3
PRO	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
ЧЕТ	168	8	114.3
ВАЛ	168	8	114.3
ГТО	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
ЛЕЙ	140	8	137.1
КМС	168	8	114.3
Стерильные деионизированной воды			91.4

Таблица 2: Реагентов для приготовления 5 мл 10 x решение энергии мастер смесь и 2,4 мл 4 x мастер смесь аминокислот.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

	T7 РНК-полимераза в реакциях транскрипции Vitro
Компонент	Складе (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 50 x реакции
10 x буфер реакции RNAPol			1.00	50
ATP	100	0.5	0.10	5
GTP	100	0.5	0.10	5
CTP	100	0.5	0.10	5
UTP	100	0.5	0.10	5
Шаблон ДНК (нг/мкл) *	1000	500	0,50	25
T7-РНК-полимеразы	200	2.6	2.00	100
АБС битор РНКазы, мышиных	200	3.3	0,50	25
Стерильные деионизированной воды			15.60	780
Объем реакции (мкл):	20

Таблица 3: In vitro транскрипция компоненты для поколения мРНК.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

	Бесплатный сотовый реакция Мастер микс
Компонент	Концентрация запасов (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 50 x реакции
Экстракт (%) *		25	2,50	125.00
MG-глутаминовой кислоты	100	3.5	0,35	17.50
K-глутаминовой кислоты	2000 года	80	0,40	20.00
4 x аминокислоты Мастер микс	8.0	2	2,50	125.00
10 x энергии решения Мастер микс			1.00	50.00
Плазмидной ДНК (нг/мкл) *	1000	500	0,50	25.00
50% ПЭГ-8000 (%) *	50	2	0,40	20.00
T7-РНК-полимеразы			1.00	50.00
АБС битор РНКазы, мышиных			0.10	5.00
Стерильные деионизированной воды			1.25	62.50
Объем реакции (мкл):	10
	Альтернативные бесплатно сотовый реакция Мастер микс для шаблона mRNA
Компонент	Концентрация запасов (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 50 x реакции
Экстракт (%) *		25	2,50	125.00
MG-глутаминовой кислоты	100	3.5	0,35	17.50
K-глутаминовой кислоты	2000 года	80	0,40	20.00
4 x аминокислоты Мастер микс	8.0	2	2,50	125.00
10 x энергии решения Мастер микс			1.00	50.00
мРНК шаблон (нг/мкл) *	2000 года	4000	2.00	100.00
50% ПЭГ-8000 (%) *	50	2	0,40	20.00
АБС битор РНКазы, мышиных			0.10	5.00
Стерильные деионизированной воды			0.75	37,50
Объем реакции (мкл):	10

Таблица 4: Компоненты оптимизированный V. natriegens клеток бесплатные мастер смесь реакции для мРНК и ДНК шаблон.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

Мг 2 + Калибровка		Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 100 x реакции	Количество (мкл) 100 x реакции
Финал (мм)	Фондовая	100 мм Mg-Glu	diH 2 0	100 мм Mg-Glu	Дейонизированной H2O
2.5	0	0.00	1.00	0	100
3.5	1	0.10	0.90	10	90
4.5	2	0,20	0,80	20	80
5.5	3	0.30	0,70	30	70
Объем реакции (мкл):	10
K + Калибровка		Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 100 x реакции	Количество (мкл) 100 x реакции
Финал (мм)	Фондовая	K-Glu 2000 мм	diH 2 0	K-Glu 2000 мм	Дейонизированной H2O
40	30	0,15	1.85	12	148
80	70	0,35	1.65	28	132
160	150	0.75	1.25	60	100
320	310	1.55	0,45	124	36
Объем реакции (мкл):	10
	Ион калибровки бесплатно сотовый реакция Мастер микс
Компонент	Концентрация запасов (мм)	Конечная концентрация (мм)	Количество (мкл) 1 x реакция	Количество (мкл) 50 x реакции
Экстракт (%) *		25	2,50	125.00
MG-глутаминовой кислоты	Переменная	Переменная	1.00	50.00
K-глутаминовой кислоты	Переменная	Переменная	2.00	100.00
4 x аминокислоты Мастер микс	8.0	2	2,50	125.00
10 x энергии решения Мастер микс			1.00	50.00
Плазмидной ДНК (нг/мкл) *	1000	250	0.25	12,50
50% ПЭГ-8000 (%) *	50	2	0,40	20.00
T7-РНК-полимеразы			1.00	50.00
АБС битор РНКазы, мышиных			0.10	5.00
Стерильные деионизированной воды			0.00	0.00
Объем реакции (мкл):	10

Таблица 5: Ионная концентрация калибровки мастер смесей.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

Ион CF карта калибровки		40 мм K+			80 мм K+			160 мм K+			320 мм K+
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
2.5 мм Mg2 +	A
3,5 мм Mg2 +	B
4.5 мм Mg2 +	C
5,5 мм Mg2 +	D

Таблица 6: Ион калибровки карта.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

	Условия хранения и полки жизни компоненты CF
Компонент	Место хранения	Срок годности
Средства роста стерильные LB-V2	4 ° C	3-6 месяцев
V. natriegens сырой сотовый экстракт	-80 ° C	1-3 недели
100 мм Mg-глутаминовой кислоты	Комнатной температуре	6 месяцев
2000 мм K-глутаминовой кислоты	Комнатной температуре	6 месяцев
50% ПЭГ-8000	Комнатной температуре	6 месяцев
10 x энергии решения Мастер микс	-80 ° C	3-6 месяцев
4 x аминокислоты Мастер микс	-80 ° C	3-6 месяцев
Плазмиды/линейная ДНК шаблон	-20 ° C	6-12 месяцев
мРНК шаблон	-80 ° C	3-4 недели

Таблица 7: Свободных клеток условий хранения и полки жизнь.    Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл в Excel.

Обсуждение

Этот протокол был оптимизирован для одичал тип V. natriegens и бактериальных питательных сред, состоящая из LB дополнена V2 солей (Таблица материалов). Другие штаммы V. natriegens можно аналогичным образом культивировали для создания сырой клеточных экстрактов для свободных клеток реакций; Однако их использование требует дополнительной оптимизации этого протокола. Кроме того эта система выражения протеина, клетки бесплатно была оптимизирована с помощью 3-phosphoglyceric кислоты (3-PGA) как источника первичной энергии регенерации. Могут использоваться другие источники энергии регенерации; Однако оптимизация реагентов и калибровки, вероятно, будет необходимо получить высокие урожайность белка выражение^10,11.

Особое внимание на несколько важных шагов в этот протокол обеспечит максимальное извлечение производительности для высокоурожайных свободной ячейки производства белка. Во-первых экстракт сырой ячейки должны быть готовы от V. natriegens клеточных культур собирают в середине экспоненциальной фазе роста; белка урожай максимальна, когда культур достигают ОД₆₀₀ = 1,0 ± 0,2. Хотя производство клеток бесплатно белка возможен из клеток, собирают в диапазон оптических плотностей, мы ранее нашли что клетки собирают в состоянии экспоненциального роста урожайности значительно больше белков⁹. Наблюдаемые эффекты оптической плотности на сырой сотовый экстракт производительности согласуются с данным для других систем ячейки свободного выражения, полученные из клеток, выращенных в партии культуры условия¹. Потому что V. natriegens растет быстрыми темпами, важно внимательно следить за культур оптических плотностей. В целом ожидается, что V. natriegens культур можно воспроизвести должен достичь ОД₆₀₀ 1.0 в пределах 1−1.5 h, используя этот протокол; Однако индивидуального роста условий, таких как использование озадаченного против-озадаченного колбы, который затрагивает аэрации, или воздуха и воды инкубации, которая влияет на скорость и стабильность температуры инкубации, может изменить время роста. Кроме того обычно рекомендуется культуры по крайней мере 250 мл против natriegens в 1 Л озадачен колбу для обеспечения крупноклеточный лепешки на урожай для легкой обработки и передачи. Это значительно повышает успех экстракт подготовка сырой клетки, а также увеличивает общий объем экстракт получают из гранул. При использовании меньших масштабах подготовки, условий культуры и реагенты могут быть скорректированы соответствующим. Для крупномасштабных ферментации дальнейшей оптимизации условий культуры могут потребоваться. Наконец чтобы обеспечить доходность высоким содержанием белка, важно, что гранулы клетки обрабатываются сразу же после сбора урожая, или в течение 1−2 дней хранения при температуре-80 ° C.

Надлежащего lysis клетки Пелле, пульс sonication имеет решающее значение для успешной экспрессии белков, клеток бесплатно и часто является самым трудным аспектом этого протокола для новых пользователей. Как правило хорошо лизированных Пелле даст значительный объем жидкого экстракта, который свободен от мусора. Выписка должна быть слегка вязкая, но может быть легко накапаны, когда aliquoting в хранилище трубы до вспышки, замораживание в жидком азоте. На рисунке 3 изображена представление хорошо лизированных Пелле (Рисунок 3А) по сравнению с плохо лизированных Пелле (рис. 3B) после центрифугирования шаг лизис пост. Основным показанием лизис полного клеток является ячейку сырой экстракт общего белка концентрацию > 20 мг / мл определяется общий белок пробирного (шаг 2.13). Чрезмерная sonication или чрезмерного нагрева сырой сотовый экстракт повредит клеточными, который не может быть определено без выполнения реакции клетки бесплатно. Таким образом это очень полезно для тестирования экстракта эффективность управления реакцией прежде чем посвятить значительное время и усилия вниз по течению белка выражение приложений. В то время как дополнительные оптимизации могут быть необходимы для различных sonication оборудования, пульс sonication шаги, описанные были весьма воспроизводимые в наших руках.

Использование линейного шаблона дна, производный от амплификации PCR, дайджест энзима ограничения или синтеза коммерческую генов может значительно увеличить потенциал для производства высокой пропускной способностью и быстрым белка в ячейки свободного выражения систем²⁴. Несмотря на то, что было продемонстрировано производство белка от PCR усиливается линейный шаблон, доходность этих реакций являются примерно 13.5-fold ниже по сравнению с реакции, с помощью плазмида ДНК шаблон в эквимолярных соотношениях⁹. Это главным образом обусловлено нестабильностью линейной ДНК шаблон, который является вероятно деградировали эндогенного nucleases присутствует в V. natriegens экстракт сырой клеток. Хотя фага лямбда белка GamS ранее использовалась для защиты линейной ДНК шаблон^24,25было обнаружено, несовместимыми с V. natriegens извлекает⁹. Кроме того в то время как увеличение концентрации линейной ДНК шаблон может позволить более высокую урожайность белка, его быстрой деградации в сырой сотовый экстракт по-прежнему будет серьезной проблемой.

Решение для преодоления линейный шаблон деградации ДНК может быть дополнить реакций клетки бесплатный шаблон мРНК, образующиеся в vitro транскрипция линейной ДНК. С другой стороны использование битор РНКазы обеспечивает существенную защиту от деградации мРНК Стенограмма и заметных белка урожай может быть получен в формате бесплатно сотовый реакция 10 мкл (Рисунок 5AB). Клонирование линейной ДНК в круговой шаблон через TA перевязки, клонирование TOPO, Золотые ворота Ассамблеи или другие методы рекомбинации может использоваться для обхода шаблон деградации. Тем не менее дальнейшее подходы для ингибирование активности нуклеиназы будет необходимо для эффективного белков с помощью линейной ДНК шаблона.

На сегодняшний день, были предложены несколько различных подходов для подготовки сырой экстракт для свободных клеток белка выражение^9,10,11,26. В разработке этого протокола, мы стремились максимизировать доступность пользователей, снизить общую стоимость и сведения к минимуму времени шаги. К примеру высоким содержанием белка урожая достигается с помощью простой двухэтапный процесс sonication центрифугирования и не требует клеток гомогенизаторы, длительные диализа шаги или реакция стока. Это просто выполнить в течение короткого времени и не требует высокого уровня знаний лаборатории. Таким образом это может помочь облегчить ячейки свободного выражения в качестве стандарта для трансляционного академических исследований и проектирования промышленных процессов.

Этот протокол расширяет инструментарий для расследования и полезности V. natriegens, организм-модель с уникальными биологическими свойствами. Высокую урожайность белка может быть достигнуто путем использования полу - или полностью непрерывной свободной ячейки реакций, для регенерации энергии, снабжении аминокислоты, и удаление отходов^3,5,27. Кроме того инженерные одичал тип V. natriegens производить DNAse - или РНКазы недостаточным штаммов, устранение пагубных и конкурирующие метаболических и выражение дополнительных tRNAs может значительно повысить производство белков в Эта система^28,29. Как мы разгадать биологии, лежащие в основе его быстрый рост, дальнейшее развитие систем V. natriegens свободных клеток может ускорить биопродукции возможности и позволить надежное выражение терапевтического пептидов, малые молекулы и синтетические материалы.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
15 мл пробирки	Corning	352196
2 мл пробирки	Eppendorf	22363352
384-луночные черные пробирные пластины	Corning	3544
384-луночные ПЦР-пластины	Eppendorf	951020702
50 мл пробирки	Corning	352070
96-луночные ПЦР-пластины	Eppendorf	30129300
Аденозин 3',5'-циклический монофосфат моногидрат соли	натрия Sigma	A6885
Аденозин 5'-трифосфат - 100 мМ	NEB	N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-луночный термоциклер	ThermoFisher	4388444
Адгезивы для пробирных пластин	BioRad	MSB1001
&бета;-никотинамида аденин Гидрат динуклеотида (НАД)	Sigma/Roche	10127965001
Коэнзим А гидрат	Sigma	C4283
Цитидин 5'-трифосфат - 100 мМ	NEB	N0450L
D-(-)-3-Фосфоглицериновая кислота динатриевая соль (3-PGA)	Sigma	P8877
Фляга Дьюара - 4 л	ThermoScientific	10-194-100C
DL-Дитиотреитол раствор - 1 М	Sigma	42816
Фолиевая кислота Кальций соль гидрат	Sigma	47612
Ледяная уксусная кислота	Sigma	A6283
Гуанозин 5'-трифосфат - 100 мМ	NEB	N0450L
HEPES	Sigma	H3375
L-глутаминовая кислота гемимагния соль тетрагидрат	Sigma	49605
L-глутаминовая кислота соль калия моногидрат	Sigma	G1149
LB Бульон (Miller)	Sigma	L3522
Магния хлорид (MgCl2)	Sigma	M8266
Plasmid pJL1-sfGFP	Addgene	69496
Plasmid Plus Maxi kit	Qiagen	12963
Поли(этиленгликоль) (ПЭГ)-8000	Sigma	89510
Хлорид калия (KCl)	Sigma	P9333
Гранулы гидроксида калия	Sigma/Roche	1050121000
Q125 Соник и зонд CL-18 с ?-дюймовым наконечником	Qsonica	4422
RNA Clean and Concentrator Kit	Zymo	R1013
Ингибитор РНКазы, мышиный	пробник аминокислот NEB	M0314
RTS	Biotechrabbit	BR1401801
хлорид натрия (NaCl)	Sigma	S7653
спермидин	Sigma	S0266
T7 РНК-полимераза	NEB	M0251
раствор триса (pH 8,0) - 1 м	Invitrogen	AM9856
тРНК из E. coli MRE 600	Sigma/Roche	10109541001
Uridine 5'-трифосфат - 100 мМ	NEB	N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock	ATCC	14048