Method Article

Изоляция и количественная оценка клеток кисти от мыши Tracheas

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки кисти являются редкими холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, встречаемыми в наивной трахееемышиной. Из-за их ограниченного числа, ex vivo оценки их функциональной роли в иммунитете дыхательных путей и ремоделирования является сложной задачей. Мы описываем метод изоляции клеток трахеальной кисти цитометрией потока.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки трахеальной кисти являются холинергическими химиосенсорными эпителиальными клетками, готовыми передавать сигналы из просвета дыхательных путей в иммунную и нервную системы. Они являются частью семейства химиосенсорных эпителиальных клеток, которые включают пучки клеток в слизистой оболочке кишечника, клетки кисти в трахеее, а также одиночные химиосенсорные и микровильные клетки в слизистой оболочке носа. Химиосенсорные клетки в различных эпителиальных отсеках имеют ключевые внутриклеточные маркеры и основную транскрипционную подпись, но также демонстрируют значительную транскрипционную неоднородность, вероятно отражающую местную тканевую среду. Изоляция клеток трахеальной кисти от одноклеточных суспензий требуется для детального определения функции этих редких эпителиальных клеток, но их изоляция является сложной задачей, потенциально из-за тесного взаимодействия между клетками трахеальной кисти и нервными окончаниями или из-за состава плотных и адополителей дыхательных путей. Здесь мы описываем процедуру изоляции клеток кисти от эпителия трахеи мыши. Метод основан на первоначальном отделении трахеального эпителия от субмукозы, что позволяет последующую более короткую инкубацию эпителиального листа папаном. Эта процедура предлагает быстрое и удобное решение для цитометрической сортировки потока и функционального анализа жизнеспособных клеток трахеальной кисти.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки кисти принадлежат к классу химиосенсорных эпителиальных клеток, характеризующихся выражением рецепторов горького вкуса и трансдукционного механизма вкусовых рецепторов, найденных в клетках вкусовых рецепторов. В отличие от вкусовых рецепторов, химиосенсорные эпителиальные клетки разбросаны по эпителиальным поверхностям и называются одиночными химиосенсорными клетками (SCCs) и микровилусовыми клетками в носовом эпителии1,2, клетками кисти в трахее 3,4, и пучка клеток в кишечнике5,6. Эпителиальные клетки, выражающие рецепторы горького вкуса и механизмы с переводом горького вкуса, также находятся в мочеиспускательном канале 7,8 и слуховой трубке9. Клетки кисти дыхательных путей имеют уникальные функции в нейрогенных и иммунных дыхательных путей реакции. Они ацетилхолина производства химиосенсорных клеток, которые вызывают защитные дыхательные рефлексы при активации с горькими соединениями и бактериальных метаболитов, как кворум зондирующих веществ10. Клетки кисти дыхательных путей также являются доминирующим эпителиальным источником IL-25, который регулируетвоспаление аэроаллергена 2 типа в дыхательных путях 3.

Характеристика полного транскриптома нижних клеток кисти дыхательных путей и их реакция на экологические раздражители была ограничена их низким числом в эпителии трахеи и очень ограниченное число за пределами больших бронхов10. Методы, используемые для изоляции химиосенсорных клеток от кишечного эпителия, не дали пропорционально высоких чисел от трахеи, возможно, из-за интимных контактов клеток трахеальной кисти с нервными окончаниями10 или других ткани конкретных факторов в дыхательной слизистой оболочки, таких как состав приверженцев и плотные белки соединения. Последние сообщения об успешной изоляции клеток трахеальной кисти в более высоких числах для одноклеточного анализа секвенирования РНК использовали либо 2 ч инкубации с папаин или 18 ч инкубации с pronase11,12. Поскольку более длительные инкубации с пищеварительными ферментами могут снизить жизнеспособность клеток и изменить транскрипционный профиль клеток из переваренных тканей13,это может предвзято сравнительный анализ с другими химиосенсорными эпителиальными популяциями.

Здесь мы сообщаем метод для изоляции клеток трахеи кисти для секвенирования РНК3. Лечение трахеи с высокодозной дезасе отделяет эпителий от субмукозы. Последующее переваривание эпителиального листа с папаином позволяет отлично восстановить эту структурную клетку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перед проведением следующих экспериментов убедитесь, что все виды использования и протоколы по уходу за животными будут одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и выполнены в соответствии с «Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию Лабораторные животные" (8-е издание, 2011) и руководящие принципы ARRIVE. Все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Бригамской и женской больнице.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка Dispase пищеварения решение, которое является раствором PBS, содержащим 16 U/mL dispase и 20 мкг/мл DNase I. Убедитесь, что порошок диспазы полностью растворяется перед разогревом раствора в водяной бане при 37 градусах Цельсия.
  2. Добавьте 5% теплоинактивированной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), чтобы сделать остановочный раствор.
  3. Подготовка Tyrode I буфер: добавить 26 U/mL папаин (20 л/мл 48 U/mg папаин раствор) и 10 Л / мЛ L-цистеин в буфер HEPES-Tyrode без кальция.
  4. Приготовьте буфер Tyrode II: добавьте 2 леупептина (5 мг/мл) в буфер HEPES-Tyrode с кальцием.
  5. Подготовка FACS буфер: использовать Хэнкса сбалансированное решение соли (HBSS) без кальция, магния и фенола красный, дополненный 2 ММ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА) и добавить 2% FBS.

2. Рассечение мыши Трачея

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этом протоколе, являются ChAT(BAC)-eGFP (B6. CG-Tg (RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J), 3-6 месяцев в возрасте обоих полов. Свести к минимуму воздействие ткани на прямой свет, чтобы уменьшить фотоотбеление eGFP.

  1. Эвтанизировать мышь с 100 мг/кг пентобарбитальной эвтаназии раствор вводят интраперитоневую или с помощью стандартных протоколов, утвержденных IACUC.
  2. Зафиксните мышь на хирургической доске в положении лежа с 21 G иглами с расширенными верхними и нижними конечностями. Спрей меха с 70% EtOH для дезинфекции области.
  3. Используя прямые щипцы, поднимите кожу и мех живота и сделайте разрез в центре с рассекающими ножницами (прямые ножницы, 3 см). Используя ножницы, отделите кожу от подкожной ткани от живота к мандибуле. Удерживая подкожную ткань с помощью щипцы, сделайте небольшой разрез ножницами в центре брюшной стенки.
  4. Откройте перитонеум V-образным разрезом. Используя щипцы, аккуратно переместить тонкой кишки в сторону, найти брюшной аорты и полы вены и сделать разрез с рассекающими ножницами, чтобы обеспечить быстрое exsanguination.
  5. Найдите диафрагму. Используя 18 G иглы, сделать отверстие в диафрагме чуть ниже грудины, чтобы сдуть легкие. Тщательно отделить диафрагму от грудной клетки с помощью острых остроконечных прямых вскрытия ножницами, чтобы разрезать вдоль основания ребер.
  6. Используя щипточки, поднимите открытый конец грудины и вырезать грудину продольно от основания грудной клетки к шее. Сделайте центральный разрез шейки матки короткими прямыми ножницами (2 см) и разделите две доли подчелюстной железы.
  7. Тщательно удалите окружающие соединительной ткани и тимуса над кариной с парой тонкой точки высокой точности щипцов.
  8. Вскрыть трахею бесплатно сначала путем разделения проксимального конца на уровне epiglottis, а затем путем вскрытия дистального конца на уровне бифуркации трахеи.
  9. Найдите эпиглоттис и вырежьте трахею продольно от эпиглоттиса до карины.

3. Трахеальная эпителиальная пищеварение

  1. Поместите трахею в трубку 1,5 мл, содержащую 750 л предварительно разогретого (до 37 градусов по Цельсию) растворить раствор пищеварения. Инкубировать на шейкере при 200 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Обложка трубки с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света.
  2. Добавьте 750 л холодных DMEM с 5% FBS, чтобы остановить реакцию. Место на льду.
  3. Перенесите трахею в чашку Петри (100 мм х 15 мм) и поместите под рассекающий микроскоп. Ориентируйте трахею с эпителиальной стороной вверх. Продольно расчлененные трахеи имеет полуцилиндрическую форму, поддерживаемую хрящевыми кольцами. Эпителий находится на вогнутой поверхности.
  4. Прикрепляйте область эпиглоттиса трахеи прямыми щипками к чашке Петри и используя размер 22 одноразового скальпеля, соскребите эпителий от трахеи. Эпителиальный слой отделяется как полупрозрачный лист.
  5. Фарш эпителия скальпелем. Перенесите эпителиальный слой в трубку 2 мл.
  6. Промыть чашку Петри с 750 л буфера Tyrode I и перенесите в трубку 2 мл, содержащую эпителиальный слой.
  7. Инкубировать трахеальный эпителиальный слой в буфере Tyrode I в течение 30 мин при 37 градусах По Цельсию на шейкере при 200 об/мин. Обложка трубки с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить воздействие прямого света.
  8. Добавьте 750 л холодного буфера Tyrode II. Вихрь переваренной ткани энергично в течение 20-30 с. Тритурировать гоменат с шприцем, прикрепленным к 18 G иглы 10 раз.  Переключитесь на иглу 21 G и на тритуре еще 10-20 раз.
  9. Фильтр клетки через 100 мкм ситечко в 50 мл конической трубки. Добавьте 30:1 vol/vol холодного буфера FACS.
  10. Спин на 350 х г в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию и отбросить супернатант. Отрежь гранулы в холодном буфере FACS и перенесите подвеску на полистиролную трубку 12 мм x 75 мм (5 мл). Спин снова на 350 х г в течение 10 минут при 4 кв и отбросить супернатант.
  11. Повторно приостановить гранулы в 100 л буфера FACS.
  12. Добавьте 1 зл анти-мыш CD16/32 блокирующих антител, чтобы блокировать неспецифические связывания и инкубировать в течение 15 минут на льду. Не мыть.
  13. Добавьте следующие антитела и соответствующие элементы управления изотипом: тихоокеанский синий анти-мышонок CD45 или крыса IgG2a, k (0,25 мкг/106 ячеек в объеме 100 л) и аллофикоцианин (APC) анти-мышь EpCAM или крыса IgG2b, k (0,5 мкг/106 клеток в объеме 100 л) моноклональные антитела. Инкубировать в течение 45 минут на льду защищены от прямого света. Добавьте 4,5 мл холодного буфера FACS, перемешайте и закрутите при 350 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от буфера FACS и повторно приостановите гранулы в 300 л холодного буфера FACS.
  14. Добавить пропидий йодид (PI) (5 мкг/мл) непосредственно перед потоком цитометрической сортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки кисти имеют неправильную форму с несколькими процессами, которые потенциально могут увеличить их присоединение к фильтрам(рисунок 3C). Мы сравнили 30 мм с 70 мм и 100 мм фильтры и обнаружили, что большие поры фильтры обеспечивают лучшие урожаи. Кроме того, тщательное трикуляции клеточной подвески после переваривания папанов значительно улучшает урожайность клеток кисти. Мы рекомендуем использовать 18G иглу для первоначальной тритурации с последующим меньшим отверстием (21 или 23 G иглы) для тонкой диссоциации клеток.

4. Поток Цитометрия Gating Стратегия

  1. Определите клетки из мусора по углу переднего и бокового рассеяния. Исключите дублеты, используя высоту и ширину переднего рассеяния, а высоту и ширину бокового рассеяния. Дублеты будут ячейками с высокими значениями ширины.
  2. В одиночных клетках, определить живые клетки, как популяция, которая ЯВЛЯЕТСЯ Pi отрицательным.
  3. В живых одиночных ячеек, определить CD45 от низкого до отрицательного клеток на основе контроля изоттипа.
  4. В CD45 низких/отрицательных ячеек, определить EpCAM положительные клетки, которые также eGFP положительные (в канале FITC). Это популяция клеток кисти(рисунок 2A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура была успешно реализована для изоляции клеток трахеальнойкисти для секвенирования РНК 3. После изоляции трахеи и пищеварения тканей с 2-ступенчатым протоколом(рисунок1), клетки были собраны и окрашены флуоресцентно помечены CD45 и EpCAM после исключения мертвых клеток с PI. После gating из дублетов на основе вперед и стороны рассеяния характеристики, мы определили клетки кисти как низкий / отрицательный для CD45, положительный для EpCAM и положительный дл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы обнаружили, что сочетание высокодозного лечения диспазы в течение 40 минут с последующим коротким лечением папаина (30 мин) обеспечивает оптимальный протокол для пищеварения трахеи и изоляции клеток кисти. Эта комбинация позволяет избежать обширного пищеварения и производит наивысший урожай клеток кисти, по сравнению с альтернативными протоколами.

В то время как пищеварение легких для извлечения гематопогетических клеток классически полагалось на мягкие пищеварительные ферменты, такие как к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Адама Чикиоэ (Adam Chicoine) из Бригама и женского центра иммунологии Flow Core за помощь в сортировке цитометрической сортировки потока. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения Гранты R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) и K08 AI132723 (L.G.B), а также Американской академией аллергии, астмы и иммунологии (AAAAI)/ Премия по респираторным заболеваниям (N.A.B.), лауреатом премии Фонда ААААИ (L.G.B.), премией молодых новаторов Стивена и Джуди Кайе (N.A.B.), Фондом Джойслин К. Остин для развития карьеры женщин-медиков (L.G.B.), а также премией щедрое пожертвование семьи Виник (L.G.B.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<сильные>антитела
анти-GFP (поликлональные козьи Ig)Abcamcat# ab5450
APC anti-mouse CD326 (EpCAM)  (Г8.8)Biolegendcat#118214
APC Крыса IgG2a, k контроль изотипаBiolegendcat#400511
DAPIBiolegendcat#422801
Donkey anti-goat IgG (H+L) Высокоадсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 488Life Technologies/Molecular Probescat#A-11055
Нормальная коза IgGR& D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k контроль изотипаBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) АнтителоBiolegendcat#101320
Химические вещества, пептиды и рекомбинантные белки
диспазуютGibcocat# 17105041 
ДНКаза IСигма cat# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Буфер без кальция (10 мМ HEPES, 135 мМ NaCl, 2,8 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 12 мМ NaHCO3, 0,4 мМ2PO4, 0,25% BSA, 5,5 мМ глюкозы. Приготовлен в воде с давлением 18,2 МОм и отфильтрован через 0,22 мкм; м фильтрBoston BioProductscat# PY-912
Tyrode' s раствор (HEPES-Buffered) 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ HEPES, 2 мМ CaCl<суб>2, 2 мМ MgCl<суб>2 и 10 мМ глюкозы. Приготовлен в воде с давлением 18,2 МОм и отфильтрован через 0,22 мкм; м. )Boston BioProductscat# BSS-355
L-CysteineSigmacat# C7352
Лейпептин трифторацетат сольSigmacat# L2023
Папаин из папайи латексSigmacat# P3125
Propidium iodide Sigmacat# P4170
Экспериментальные модели: организмы/штаммы
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)Лаборатория Джексона7902
Equipment
LSM 800 с конфокальной системой Airyscan  на a  Zeiss Axio Observer Z1 Инвертированный микроскопZeiss
LSRFortessaBD647465
Одноразовое оборудование
1,5 мл стерильные пробиркиThomas Scientific1157C86
5 мл Пойстерен Круглодонная трубка, 12 мм x 75 мм стильFalcon14-959-1A
50 мл Полипропиленовая коническая трубка, 30 мм x 115 мм Falcon352098
Feather Одноразовый скальпель No12Fisher ScientificNC9999403
чашка Петри, 100 мм x 15 мм StyleFalcon351029
Стерильное клеточное ситечко, 100 μ mFisherbrandcat#22363549

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490(2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tracheal Brush CellsEpithelial IsolationPapain DigestionFlow Cytometric SortingDispase TreatmentCell ViabilityChAT eGFP ReporterFACS BufferPropidium IodideEpCAM Positive

Related Articles