Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

36K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59519

⸱

16 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Department of Chemistry, Skidmore College, 3Candiac MR Center, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Культивированный первичных или установленных клеточных линий обычно используются для решения фундаментальных биологических и механистических вопросов, как первоначальный подход, прежде чем использовать модели животных. Этот протокол описывает, как подготовить целые Клеточные экстракты и субклеточные фракции к изучению цинка (Zn) и других микроэлементов с атомной спектроскопии поглощения.

Аннотация

Переходные металлы являются необходимыми микроэлементами для организмов, но могут быть токсичными для клеток в высоких концентрациях, конкурируя с физиологическими металлами в белках и генерируя восстановительный стресс. Патологические состояния, которые приводят к истощению или накоплению металла, являются причинные агенты различных заболеваний человека. Некоторые примеры включают анемию, акродерматит энтеропатии, и болезни Уилсона и Менкса. Поэтому важно иметь возможность измерять уровни и транспортировать переходные металлы в биологических образцах с высокой чувствительностью и точностью, чтобы облегчить исследования, исследуя, как эти элементы способствуют нормальным физиологическим функциям и Токсичность. Цинк (Zn), например, является кофактором во многих белков млекопитающих, участвует в сигнальных событиях, и является вторичным посыльным в клетках. В избытке, Zn является токсичным и может препятствовать поглощению других металлов, в то время как в дефиците, это может привести к целому ряду потенциально смертоносных условиях.

Графит печи атомной абсорбции спектроскопии (GF-ААС) обеспечивает высокочувствительный и эффективный метод для определения Zn и других концентраций переходных металлов в различных биологических образцов. Электротермическая атомизации через GF-ААС квантифицирует металлы путем распыления небольших объемов образцов для последующего выборочного анализа поглощения с использованием длины волны возбуждения элемента интересов. В рамках линейности закона Бир-Ламберта абсорбционные света металлом прямо пропорциональны концентрации анализатора. По сравнению с другими методами определения Zn содержание, GF-ААС обнаруживает как свободные и комплексность Zn в белки и, возможно, в небольших внутриклеточных молекул с высокой чувствительностью в небольших объемах выборки. Кроме того, GF-ААС также более доступными, чем индуктивно сочетании плазменной массы спектрометрии (ПМС-MS) или синхротрон основе рентгеновской флуоресценции. В этом методе описывается систематический образец подготовки различных культивируемых клеточных линий для анализа в GF-ААС. Вариации в этом трассированном элементе сравнивались как в целых клеточных лиях, так и в субклеточных фракциях пролиферирующих и дифференцированных клеток как доказательство принципа.

Введение

Переходные и тяжелые металлы, такие как Zn, Cu, MN и Fe, встречаются естественным образом в окружающей среде как в питательных веществах, так и в продуктах питания и загрязнителях. Все живые организмы требуют различного количества этих питательных микроэлементов; Однако воздействие высоких уровней является пагубным для организмов. Приобретение металла в основном через диету, но металлы также может быть вдыхании или всасывается через кожу1,2,3,4,5. Важно отметить, что присутствие металлов в атмосферных частицах возрастает и в значительной степени связано с риском для здоровья. В связи с антропогенной деятельностью в атмосферных твердых частиц, дождевой воде и почве6,7были обнаружены повышенный уровень тяжелых металлов, таких как АГ, как, CD, CR, гектограмм, Ni, Fe и ПБ. Эти металлы обладают потенциалом конкурировать с необходимыми физиологическими микроэлементами, в частности Zn и Fe, и они индуцируют токсические эффекты, инактивируя фундаментальные ферменты для биологических процессов.

Микроэлемент Zn является редокс нейтральным и ведет себя как кислота Льюиса в биологических реакциях, что делает его фундаментальным кофактором, необходимым для складывания белка и каталитической активностью в более чем 10% белков млекопитающих8,9, в 10 лет; Следовательно, она имеет важное значение для различных физиологических функций8,11. Однако, как и многие микроэлементы, существует хрупкое равновесие между этими металлами, облегчающ нормальную физиологическую функцию и вызывая токсичность. У млекопитающих, Zn недостатки приводят к анемии, замедление роста, гипогонадизм, кожные аномалии, диарея, алопеция, вкусовые расстройства, хроническое воспаление, и нарушениями иммунной и неврологических функций11,12, 13,14,15,16,17,18. В избытке, Zn является цитотоксическим и ухудшает поглощение других основных металлов, таких как медь19,20,21.

Кроме того, некоторые металлы, как Cu и Fe имеют потенциал для участия в вредных реакций. Производство реактивных видов кислорода (рос) через химию Фентона может помешать сборке белков железорудного кластера и изменению липидного метаболизма22,23,24. Чтобы предотвратить этот ущерб, клетки используют металлические связывания сопровождающих и транспортеров для предотвращения токсического воздействия. Несомненно, металлический гомеостаз должен быть жестко контролируется, чтобы гарантировать, что конкретные типы клеток поддерживать надлежащий уровень металлов. По этой причине существует существенная потребность в продвижении методов точного измерения микрометаллов в биологических образцах. В развивающихся и зрелых организмах существует дифференциальная биологическая потребность в микроэлементах на клеточном уровне, на различных стадиях развития, в нормальных и патологических условиях. Таким образом, точное определение тканей и системных уровней металла необходимо понять, организмы металлический гомеостаз.

Графитовой печи атомной поглощения спектрометрии (GF-ААС) является весьма чувствительным методом, используемым для малых объемов выборки, что делает его идеальным для измерения переходных и тяжелых металлов, присутствующих в биологических и экологических образцов25,26 , 27 , 28. Кроме того, из-за высокой чувствительности техники, было показано, что целесообразно для изучения тонких транспортных свойств Na+/K+-Atpase и желудочный H+/K+-atpase использованием ксенопус ооцитов в качестве типовой системы29. В GF-ААС, распыленных элементов в образце поглощают длину волны излучения, излучаемого источником света, содержащего металл интересов, с поглощенной излучения пропорционально концентрации элемента. Элементарное электронное возбуждение происходит при поглощении ультрафиолетового или видимого излучения в квантизованному процессе, уникальном для каждого химического элемента. В процессе одного электрона поглощение фотона включает электрон, двигающий от более низкого уровня энергии до более высокого уровня в пределах атома, и GF-ААС определяет количество фотонов, поглощающих образец, который пропорционален количеству излучения, поглощающего элементы, распыленных в графитовой трубе.

Избирательность этого метода опирается на электронную структуру атомов, в которой каждый элемент имеет специфическую спектральную линию поглощения/излучения. В случае Zn, длина волны поглощения составляет 213,9 Нм и может быть точно отличается от других металлов. В целом, GF-ААС может использоваться для количественной оценки Zn с адекватными ограничениями обнаружения (ОД) и высокой чувствительностью и избирательностью25. Изменения в поглощенной длине волны интегрированы и представлены как пики поглощения энергии на специфических и изолированных длинами волн. Концентрация Zn в данной выборке, как правило, рассчитывается от стандартной кривой известных концентраций в соответствии с законом Бир-Ламберта, в котором абсорбционные непосредственно пропорциональны концентрации Zn в образце. Однако применение уравнения Бир-Ламберта к анализу GF-ААС также представляет некоторые осложнения. Например, различия в концентрациях в атомизации и/или неоднородности образцов могут влиять на измерение металла.

Металлические атомизации, необходимые для GF ААС трассировки элементарного анализа состоит из трех фундаментальных шагов. Первый шаг – это опустошающей, где испаряется жидкий растворитель; оставляя сухие соединения после печи достигает температуры около 100 ° c. После этого, соединения испаряются путем нагревать их от 800 до 1 400 °C (в зависимости от элемента, котор нужно проанализировать) и становят газ. Наконец, соединения в газообразном состоянии распыляется с температурами, которые варьируются от 1 500 к 2 500 ° c. Как говорилось выше, повышение концентраций металлического интереса окажет пропорциональное увеличение поглощения, обнаруженного GF-ААС, но печь уменьшает динамический диапазон анализа, который является рабочим диапазоном концентраций, которые могут быть определяется инструментом. Таким образом, методика требует низких концентраций и тщательного определения динамического диапазона метода путем определения Лода и предела линейности (LOL) Закона Бир-Ламберта. ОД является минимальным количеством, необходимым для обнаружения вещества, определяемых как три раза стандартное отклонение Zn в матрице. LOL является максимальная концентрация, которая может быть обнаружена с помощью пива-Ламберт закона.

В этой работе мы описываем стандартный метод анализа уровней Zn в цельных клеточных экстрактах, цитоплазматических и ядерных фракциях, а так же в размножающихся и дифференцирующих культивируемых клетках (рис. 1). Мы адаптировали быструю изоляцию протокола ядер к разным сотовым системам, чтобы предотвратить потерю металла во время подготовки образца. Сотовые модели, используемые были первичные миобластов, полученных из клеток мыши спутник, Мурин нейрообластомы клетки (N2A или Neuro2A), Мурина 3T3 лаунематоцитов, человека, не-опухолевых клеток груди эпителиальной линии (MCF10A), и эпителиальных Мадин-Дарби почки собак ( Клеток). Эти клетки были созданы из разных линий и являются хорошими моделями для исследования линии конкретных вариаций уровней металлов в пробирке.

Первичные миобласты, полученные из клеток-спутников мыши, представляют собой хорошо подходящую в пробирке модель для исследования дифференциации скелетных мышц. Распространение этих клеток быстро, когда культивируемых в условиях высокой сыворотки. Дифференциация в мышечной линии затем индуцированных низкой сыворотки условиях30. «Мурина нейрообластома» (N2A), созданная клеточная линия, была получена из мыши нейронной гребень. Эти клетки представляют нейронов и аамбоид стволовых клеток морфологии. После стимулирования дифференциации, клетки N2A представляют несколько свойств нейронов, таких как нейронити. N2A клетки используются для исследования болезни Альцгеймера, неврит, и нейротоксичность31,32,33. 3T3-й Мурина предадипоциты, установленные клеточной линии обычно используется для исследования метаболических и физиологических изменений, связанных с адипогенез. Эти клетки настоящее фиброскомного типа морфологии, но как только стимулируется для дифференциации, они представляют ферментативной активации, связанной с синтеза липидов и накопления триглицеридов. Это можно наблюдать как морфологические изменения для производства цитоплазматических капель липидов34,35. MCF10A это не опухоль молочной эпителиальной клеточной линии, полученной от пременопаузы женщина с молочной фиброзно-кистозной болезни36. Он широко использовался для биохимических, молекулярных и клеточных исследований, связанных с карциногенеза молочной железы, таких как распространение, клеточная миграция и вторжение. Манин-Дарби собачьей почки (МДК) эпителиальной клеточной линии широко используется для исследования свойств и молекулярных событий, связанных с созданием эпителиального фенотипа. После достижения слияния, эти клетки становятся поляризованным и установить клетки ячейки спайки, характеристики млекопитающих эпителиальных тканей37.

Чтобы проверить способность ААС измерять уровни Zn в клетках млекопитающих, мы проанализировали целые и субклеточные фракции (цитозоль и ядро) этих пяти клеточных линий. Измерения ААС показали различные концентрации Zn в этих типах клеток. Концентрация была ниже в распространении и дифференцирующих первичных миобластов (от 4 до 7 нмоль/мг белка) и выше в четырех установленных клеточных линиях (от 20 до 40 нмоль/мг белка). Небольшое несущественное увеличение уровней Zn было обнаружено при дифференциации первичных мизобластов и нейростозмы клеток по сравнению с пролиферирующих клеток. Противоположный эффект был обнаружен в дифференцированных адипоцитов. Однако, пролиферирующих клетки 3T3-1, выставлены более высокие концентрации металла по сравнению с дифференцированными клетками. Важно отметить, что в этих трех клеточных линиях субклеточная фракционирование показала, что ЗН по-разному распределяется в цитозолу и ядре в соответствии с метаболическим состоянием этих клеток. Например, в пролиферирующих миобластов, N2A клеток, и 3T3-У1 до адипоцитов, большинство из металла локализован в ядро. После индукции дифференцировки используя специфические обработки клетки, Zn локализуется к цитозолу в этих 3 типах клетки. Интересно, что оба эпителиальных линий клеток показали более высокие уровни Zn во время распространения по сравнению с при достижении слияния, в котором характерный плотный монослой был сформирован. В пролиферирующих клетках эпителия, линия молочной клетки MCF10A имела равное распределение Zn между цитозолом и ядром, в то время как в клеточной линии почки, большая часть металла находилась в ядре. В этих двух типах клеток, когда клетки достигали слияния, Zn был преимущественно расположен к цитозолу. Эти результаты показывают, что GF-ААС является высокочувствительным и точным методом для выполнения элементарного анализа в малоурожайной образцах. GF-ААС в сочетании с подклеточной фракционирования и может быть адаптирована для изучения уровней следов металлических элементов в различных клеточных линий и тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клеток млекопитающих

  1. Общие соображения
    1. Следуйте асебтических методов для культуры клеток млекопитающих ранее рассмотрел38.
    2. Поддержание всех клеточных линий в увлажненный 5% CO2 инкубатор при температуре 37 ° c. Условия клеточной культуры различаются для каждого типа клеток. Важно, чтобы поддерживать соответствующие условия культуры для каждой клеточной линии, используемой, как вариации этих процедур приведет к аномальным фенотипов и провал клеточной культуры.
    3. Обеспечить знакомство с клеточной линией интереса, и следовать протоколам, которые предусмотрены для каждого типа клеток, отобранных для конкретных экспериментов (см. Некоторые примеры ниже).
  2. Общая процедура для трининизации и прохождения адепт клеток
    1. Извлекайте средства культуры клетки от плиты культуры устремленностью.
    2. Промойте клетки мягко, используя PBS без кальция и магния (5 мл на 10 см2 площадь поверхности культуры). Добавьте раствор для мытья в сторону пластины, чтобы избежать соединения монослоя ячейки; вихревой пластины для максимального охвата решения. Для эпителиальных клеток, необходимо инкубировать клетки для 10 до 15 минут в инкубаторе при температуре 37 ° c в PBS для облегчения диссоциации клеток в следующих шагах.
    3. Снимите стиральную раствор с помощью аспирации.
    4. Добавить достаточно реагента диссоциации (0,25% трипсин) в тарелку (примерно 0,7 мл на 10 см2). Аккуратно закружить пластину, чтобы получить полный охват ячейки монослоя.
    5. Инкубировать культуру при комнатной температуре от 2 до 5 минут. Фактическое время инкубации варьируется в зависимости от используемой клеточной линии, в случае эпителиальных клеток рекомендуется инкубировать от 10 до 15 минут в инкубаторе при температуре 37 ° c. Соблюдайте клетки под микроскопом для клеточного отряда.
    6. Когда большинство клеток отсоединяется, восстановить клеточную суспензию в 5 мл предварительно нагретого покрытия или роста среды (см. ниже для некоторых примеров). Механически отделить ячейки сгустки по пипетки над клеткой монослоя несколько раз.
    7. Перенесите клеточную подвеску к 15 мл конической трубки и центрифугу на 1 000 x g для 2 до 5 мин. Центрифугирования скорость и время меняются в зависимости от типа ячейки. Удалите средства массовой информации мягким стремлением, будучи осторожным, чтобы не коснуться ячейки гранул. Ресуспензируем ячейки гранулы в 5 до 10 мл соответствующего предварительно нагретого носителя роста и удалить образец для подсчета с помощью хемоцитометер или автоматической клеточной счетчика.
    8. Используйте соответствующий объем клеточной суспензии для посева рекомендуемой плотности для каждой конкретной клеточной линии (см. ниже для некоторых примеров). Добавка с адекватным объемом культуры средств массовой информации в соответствии с размером блюдо культуры и поместить клетки обратно в инкубатор.
  3. Первичные миобласты, полученные из клеток-спутников мыши
    1. Перед началом Подготовьте пластины с коллагеновым покрытием для первичного миобластного роста. Раствор, содержащий 0,02% коллагена, и 0,05 M ацететической кислоты в обоженной воде должны быть стерилизованы фильтрации с 0,22 мкм стерильный фильтр устройства. Инкубировать культуры пластин с раствором коллагена ночь на 37 ° c.
    2. На следующий день, аспирин раствор для коллагена, позволяют пластины высохнуть на воздухе в стерильном шкафу и хранить при температуре 4 ° c до использования.
      Примечание: минимальные объемы коллагена: для 35 мм = 1 мл; 60 мм = 2 мл; 10 см = 5 мл.
    3. Семян первичных миобластов на 1 х 104 клетки/см2 в 55 cm2 коллагена покрытием культуры пластин. Распространенческие средства массовой информации-это модифицированный Орлиный средний (ДМЕМ)/F12 питательной смеси питательных веществ, содержащий 20% фетальной бычьей сыворотки (ФПС), 25 нг/мл рекомбинантного базового фиброзного фактора роста (FGF) и 100 U/mL пенициллин/стрептомицина.
      Примечание: пролиферирующих и фондовых клеток должны быть сохранены в 50% от беглости. Контакт клетки вызывает приверженность клеток миогенными дифференцированием и ухудшает возможности роста культуры.
    4. Для дифференциации первичных миобластов, позволяют клеткам достичь 80% до 100% беглость, которая обычно происходит после 48 h покрытия. Затем, изменения в дифференциации средств массовой информации (ДМ, 2% конной сыворотки, 1% инсулина, трансферрин, Селена а. а. 100 U/мл пенициллин/стрептомицин). Обновляем средства массовой информации ежедневно до сбора урожая.
  4. Нейрообластома Мурина (N2A)
    1. Пластины N2A клеток при плотности 2 х 104 клетки/см2 в росте средств массовой информации, содержащие смесь средней сыворотки/дм, содержащие высокую глюкозу и L-глютамина (1:1, v:v), добавка с 10% ФБС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицин. Поддержание культуры фондовых под 50% беглость.
    2. Индуцировать дифференциацию N2A клеток после беглости достигла 25% до 40%. Изменения к дифференциации средств массовой информации, содержащие смесь из уменьшсывороточный средний/ДМЭМ, 1% ФПС, и 20 мкм ретиноевой кислоты в течение 7 до 10 дней. Обновите СМИ через день до сбора урожая.
      Примечание: как N2A клетки дифференцируются, некоторые клетки становятся круглыми, легко отделяются, и может подвергнуться апоптозу. Будьте осторожны при аспоте и добавлении культуры СМИ к пластикам.
  5. 3T3 1. Мурина до адипоцитов
    1. Поддержание клеток мыши 3T3/1 в ДДЭМ с высоким уровнем глюкозы, дополнено 10% ФПС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицина. Адипогенный процесс зависит от слияния клеток; Таким образом, не позволяйте фондовой культуры расти более 50% беглость, как высшее слияние будет нарушать способность клеток дифференцироваться.
    2. Пластина клетки на 2 х 104 ячейки/cm2. При этой плотности, клетки достигнет слияния в течение 3 дней.
    3. Индуцировать Адипогенную дифференциацию через два дня после клетки достигают 100% беглость. Индукционные носители состоят из ДМЭМ, содержащего 10% ФПС, 10 мкг/мл инсулина, 0,5 мм 3-изобутиля-1-метилксантин, 1 мкм дексаметазона и 10 мкм троглитазон.
    4. Замените индукционные носители после инкубации 48 h на средства дифференциации (ДМ, содержащие 10% ФПС, и 5 мкг/мл инсулина). Обновите средства массовой информации через день до сбора урожая. Репрезентативные образцы полной дифференциации обычно собираются между 7 и 10 днями после адипогенной индукции.
      Примечание: когда адипогенез прогрессирует, клетки становятся круглыми и легко отделяются. Будьте осторожны при аспоте и добавлении культуры СМИ к пластикам.
  6. MCF10A ячейки
    1. Пластины MCF10A клеток в ДМЕМ/F12 (1:1, v:v), дополнено 5% ФПС, 100 U/mL пенициллин/стрептомицин, 0,5 мкг/мл гидрокортизон, 10 мкг/мл инсулина, и 20 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF). Рекомендуемая плотность высева составляет 1 х 105 ячеек/см2. В этих условиях, клетки достигнет 100% беглость в течение 4 дней. Обновляем носители каждые 2 – 3 дня до сбора урожая.
      Примечание: MCF10A клетки трудно отделить. Рекомендуется для инкубации клеток в течение 10 до 15 минут при температуре 37 ° c в PBS, свободной от кальция с 0,5 mM ЭДТА до триссиненизации.
  7. Манин-Дарби собачьей почки клетки (МДК)
    1. Пластины МДК клеток в ДМЕМ дополнено 10% ФПС и 100 U/мл пенициллин/стрептомицина. Рекомендуемая плотность посева 1 х 105 клеток/cm2, где клетки достигнет 100% беглость в течение 3 дней. Обновляем носители каждые 2 дня до сбора урожая.
      Примечание: клетки МДК трудно отделить. Рекомендуется инкубировать клетки от 5 до 10 минут при температуре 37 ° c в PBS, свободной от кальция и магния до триссиненизации. Для предотвращения скопления клеток не агитировать пластины, нажав или встряхивая флягу в ожидании клетки для отсоединения.

2. Подготовка образцов клеточных культур млекопитающих для ААС: вся клеточная и субклеточная фракционирование

  1. Культура клетки интереса в 55 cm2 плиты. Использование более мелких пластин культуры может принести образцы с уровнями металлов в пределах обнаружения пределов GF-ААС.
  2. Весь экстракт клеток
    1. Аспоте культуры СМИ с помощью вакуумной ловушки. Обязательно удалите все следы носителя. Промыть клетки от желаемых точек времени или культурные условия три раза с ледяной PBS без кальция и магния.
    2. Сразу же очистить клетки от пластины с помощью новой пластиковой ячейки скребок в 1 мл PBS без кальция и магния. Перенесите образец в трубку микроцентрифуги 1,5 мл и центрифугу на 2 мин при 2 000 х г и аспоте супернатант. Протокол может быть приостановлен здесь. Храните образцы гранул при температуре-20 °C или переходите к шагу 2,4.
  3. Подклеточная фракционирование
    1. Аспоте культуры СМИ с помощью вакуумной ловушки. Обязательно удалите все следы носителя. Промыть клетки от желаемых точек времени или культурные условия три раза с ледяной PBS без кальция и магния. Очистите клетки от пластины с 1 мл ледяной PBS без кальция и магния.
    2. Передача образцов на 1,5 мл трубки микроцентрифуги и держать на льду. Центрифуга для 10 s на 10 000 x g. Продолжайте быструю изоляцию ядер, если желательно металлический анализ цитоплазматических и ядерных фракций. Эта процедура позволит свести к минимуму потенциальную потерю металлов из-за извлечения ячейки39, 40.
    3. Удалить супернатант по аспирации и ресуспензируем ячейки гранул в 400 МКН ледяной PBS без кальция и магния, содержащий 0,1% nonidet P-40 (НП-40), неионного моющего средства. Перенесите 100 мкл на новую микроцентрифугу и рассмотрите ее как образец всей ячейки. Это Алиготе представляет 25% образца.
    4. Изолируйте ядра, поглаживая клеточную суспензию 5 до 10 раз на льду с P1000 наконечником. Ядра изоляция эпителиальных клеток требует концентрации 0,5% НП-40. Достижения клеточной диссоциации путем прохождения клеточной суспензии через 26 3/4 G иглы 10 до 15 раз, после 10 до 15 проходов через 30 1/2 G иглы.
      Примечание: Проверка целостности ядер с помощью световой микроскопии с использованием 40x цели.
    5. Центрифуга оставшейся ячейки lysate подвеска (300 мкл) для 10 s при 10 000 x g. Супернатант будет содержать цитозолольку фракции. Перенесите 300 мкл на новую пробирку микроцентрифуги.
    6. Промыть гранулы, содержащие ядерную фракцию в 500 мкл PBS без кальция и магния, содержащий 0,1% НП-40, затем центрифуга для 10 s при 10 000 x g. Удалите супернатант и ресуспензируем гранулы, содержащие ядра, в 100 мкл одного и того же раствора.
      Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. Образцы могут храниться при температуре-20 °C.
  4. Lyse клетки по трем циклов ультразвуковых (30 s на/30 s выключен, на 50 кГц, 200 W) в течение 5 мин. Количественная оценка общего содержания белка в образце Брэдфорда41.
  5. Выполните контроль качества чистоты фракций Западной помаркой, используя антитела, специфичные либо для ядерного (гистоны, ремонтом хроматина, нуклеарные белки), либо для цитозолольных фракций (b-тубулин, b-Actin) (рис. 2).
    Примечание: не используйте sonicators с металлическим наконечником. Они могут загрязнять образец металлами.

3. Zn содержание анализа всей клеточной и субклеточных фракций культур клеток млекопитающих по атомной спектроскопии поглощения

  1. Минерализоваться образцы клеточной культуры (целые ячейки или ядерные фракции) путем переваривания кислоты, используя равный объем концентрированного HNO3 металлического сорта (осторожность) для 1 ч при температуре 80 ° с, затем на ночь при температуре 20 °c.
  2. Остановите реакцию, добавив 30% от объема реакции H2O2. Доведите объем выборки до 500 мкл с очищенной водой 18 млн.
    Примечание: HNO3 обработка должно быть сделано ношение очков химической безопасности, лицевой щит для защиты от брызг, перчатки, и утвержденных паров респиратор, если адекватной вентиляции (вытяжка) не имеется. Протокол может быть приостановлен здесь. Образцы могут храниться при комнатной температуре (RT).
  3. Подготовка стандартных решений и экспериментальных образцов для измерений Zn ААС, оснащенная графитовой печью.
    1. Используйте 2% (v/v) HNO3 раствор в деионизированной воде, исходя из той же партии, используемой для стандартной кривой как пустое решение для калибровки во всем. Использование стандартов аналитического класса, разбавленных очищенной водой 18 МВт.
    2. Подготовка стандарта 1 000 частей на миллиард Zn из коммерчески доступных 1 000 промилле Zn складе решение с 2% (v/v) HNO3 решение в деионизированной воде. Подготовка рабочих стандартных решений от 100 частей на миллиард стандартных путем разбавления его 5, 8, 10, 15, 20 и 25 частей на миллиард непосредственно с 2% (v/v) HNO3 решение в деионизированной воде. Подготовьте стандарты Zn и бланк с 0,1% (1 g/L) мг (NO3)2 матричных модификатора.
      Примечание: Лоде Zn составляет 0,01 частей на миллиард (мкг/л). Увеличивая концентрацию стандартов, предел линейности Zn был определен как 20 частей на миллиард (Рисунок 3).
    3. Измерение стандарта и образцов при тех же оптимизированных условиях: скорость потока введения 250 мл/мин, температура впрыска 20 °C, и температура GF 1 800 ° c.
      Примечание: температура GF была увеличена до 2450 ° c для очистки шаги, до инъекции нового образца или стандарта.
    4. Оптимизируйте лампу (C-СОВМЕСТИМОГО) до тока 20 A, длина волны 213,9 Нм и разрез 0,7 Нм.
    5. Измерение минерализованных образцов с использованием стандартной кривой Zn для определения содержания металлов. При измерении малых объемов образцы могут испаряться, если измерения занимают длительное время. Поэтому рекомендуется добавлять воду в пробы. Разбавить пробы с 18 очищенной водой с момом, обработали 0,01% HNO3 (аналитический сорт), если полученные данные находятся за пределами Лода.
      Примечание: как правило, образцы разбавляют на объем 500 мкл, помещенный в автоматизированном аутокамплер ААС для измерения сразу после того, как стандартная кривая установлена. Необходимый объем должен определяться пользователем и должен учитывать окончательные расчеты концентраций. Рекомендуется закончить определение Zn ААС полного эксперимента в одной попытке. Приостановка измерений может привести к большим экспериментальным изменениям и несогласованности.
  4. Преобразование частей на миллиард измерений моллярности как полученные от Zn измеряется через ААС. Рассмотрим массу Zn (65,39 Аму). Разделите количество частей на миллиард, полученные ААС по 63 390 000. В клетках концентрации ЗН варьируются от единиц птмоль до мкмоль.
    1. Разделите концентрацию ЗН (пфмоль или мкмоль) на начальную массу белка в образце, определяем Брэдфорд (шаг 2,4). Этот расчет будет оказывать количество металла (плмоль или мкмоль Zn) содержится в мг белка образца.
      Примечание: важно рассмотреть факторы разведения, используемые во время определения металла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы протестировали способность GF-ААС обнаруживать мельчайшие уровни Zn в клетках млекопитающих (рис. 1). Таким образом, мы культивируемые первичных миобластов, полученных из клеток мыши спутник, и установленных клеточных линий N2A (нейрообластома производные), 3T3 Л1 (адипоцитов), MCF10A (эпителий молочной железы), и МДК клеток (эпителий почки собаки). Во-первых, мы изолировали целую клетку, цитозололику и ядерные фракции всех этих типов клеток и оценивали чи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Атомная спектроскопия поглощения является высокочувствительным методом для количественной оценки Zn в малом объеме/массе биологических образцов. Описанная оптимизация измерения Zn делает применение этого метода простым и гарантирует идеальные аналитические условия. Здесь, используя GF-ААС, мы определили концентрацию Zn в целых клетках, а в цитозололиях и ядерных фракциях, с разных клеточных линий. Результаты показывают, что этот метод оказывает сопоставимо с тем, полученные флуоресцентными зондами и ПМС-MS. Например, нес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана факультета разнообразии ученых награду от университета Массачусетса медицинская школа Т.П.-B. Н.Н.-T. поддерживается Сен-КОНАСИТ, Грант 279879. J. G. N поддерживается Национальным фондом науки Грант DBI 0959476. Авторы благодарны доктору Дэрилу а. Боско за предоставление линии N2A и Даниэлла Кангуссу за техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-изобутил-1-метилксантинSigma Aldrichi5879
Уксусная кислотаSigma Aldrich1005706
Anti Brg1-антитело (G7)Santa Cruz biotechnologiessc-17796
Anti b-тубулин-антитело (BT7R)Thermo ScientificMA5-16308
BradfordBiorad5000205
ДексаметазонСигма ОлдричD4902
модифицированная среда Дульбекко (DMEM)ThermoFischer-Gibco11965092
модифицированная смесь питательных веществ Dulbecco (DMEM/F12)ThermoFischer-Gibco11320033
фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS)ThermoFischer-Gibco14190144
Эпидемальный фактор роста (EGF)Sigma AldrichE9644
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)ThermoFischer-Gibco16000044
Фактор роста фибробластов-основной (FGF) (AA 10-155)ThermoFischer-GibcoPHG0024
Сыворотка для лошадейThermoFischer-Gibco16050122
ГидрокортизонSigma AldrichH0888
Перекись водорода (H2O2)Sigma Aldrich95321
ИнсулинSigma Aldrich91077C
Инсулин-трансферрин-селен-АThermoFischer51300044
азотной кислотой (HNO3)Sigma Aldrich438073
Nonidet P-40 (NP-40)Thermo Scientific85125
OptiMEM (восстановленная сывороточная среда)ThermoFischer-Gibco31985070
пенициллин-стрептомицинThermoFischer-Gibco15140148
PureCol (коллаген)Advanced BioMatrix5005
Реионная кислотаSigma AldrichPHR1187
троглитазонSigma Aldrich648469-M
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйThermoFischer-Gibco25200056
Чистый одноэлементный стандарт цинка (Zn), 1 000 и микро; г/мл, 2% HNO3Perkin ElmerN9300168
Established Cell Lines
3T3-L1Американская коллекция типовых культурCL-173
MCDKАмериканская коллекция типовых культурCCL-34
MCF10AАмериканская коллекция типовых культурCRL-10317
N2AАмериканская Типовая коллекция культурCCL-131
Equipment
Атомный абсорбционный спектрофотометрPerkinElmerAanalyst 800
BioruptorDiagnodeUCD-200

Ссылки

  1. Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
  2. Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
  3. Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
  4. Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
  5. Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
  6. McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
  7. Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
  8. Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
  9. Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
  10. Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
  11. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  12. Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
  13. Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
  14. Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
  15. Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
  16. Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
  17. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  18. Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
  19. Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
  20. Fischer, P. W., Giroux, A., L'Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
  21. Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
  22. Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
  23. Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
  24. Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
  25. Yang, W., Ni, Z. Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. 17 (2), 104-110 (1997).
  26. Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
  27. Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
  28. Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
  29. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201(2013).
  30. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  31. Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614(2015).
  32. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  33. Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer's and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
  34. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  35. Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
  36. Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Research. 50 (18), 6075-6086 (1990).
  37. Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
  38. Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1 (2001).
  39. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  40. Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
  41. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  42. Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
  43. Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
  44. Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
  45. Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542(2018).
  46. Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
  47. Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
  48. Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
  49. Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
  50. Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
  51. Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
  52. Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Атомно-абсорбционная спектроскопияанализ цинкафракционирование клетоксубклеточные фракциивалидация вестерн-блоттингомминерализация азотной кислотойграфитовая печьопределение микроколичеств металловподготовка клеточных культур
Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.