Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.
Введение
Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра - и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)1. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри - и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рас....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Мичиганского университета.
1. Подготовка оборудования и материалов для мыши EHBD изоляции
- Подготовить посевной средних и стиральные буфера (Таблица материалов) в 50 мл конические трубы и держать их на 4 ° C или на льду до использования.
- Настройте таблицу хирургические (рис. 1B). Подготовьте стерилизации хирургических инструментов (рис. 1 c).
- Место стерильным 24-ну пластины в инкубатор культуры ткани 37 ° C для предварительного подо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наш протокол описывает поколения organoids EHBD мыши, ткане- и взрослых стволовых клеток. После искусственного organoids, формирования кистозных структуры могут наблюдаться как 1 день после EHBD изоляции. Загрязнение с фибробластов не наблюдается обычно во время создания культуры. EHBDO покрытие эффективность составляет примерно 2% при изоляции от новорожденных или взрослого (старше 2 месяцев) мышах (рис. 2B). Обшивка эффективность EHBD organoids производным .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового заражения и тщательной обработки после центрифугирования, чтобы избежать Потеря клеточного материала. Требуется закрыть соблюдение описанных температурных условий. Существуют некоторые ограничения на метод. EHBDs взрослых мышей н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.
Благодарности
Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| L-WRN среда для культивирования клеток | |||
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | 1% | Life Technologies | 10437-028 |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 Ед/мл | Life Technologies | 15140-122 |
| Буфер для стирки | |||
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | 50 мл | Life Technologies | 10010-023 |
| Пенициллин-стрептомицин | 125 Ед/мл | Life Technologies | 15140-122 |
| Амфотерицин B | 6.25 и микро; g/mL | Life Technologies | 15290-018 |
| Органоидная питательная среда | |||
| L-WRN Кондиционированная среда | 1:1 | ATCC | CRL-3276 |
| Advanced DMEM/F12 | 1:1 | Life Technologies | 12634-010 |
| Пенициллин-стрептомицин | 100 Ед/мл Life | Technologies | 15140-122 |
| N-глутамин | 10 & микро; л/мл | Life Technologies | 35050-061 |
| N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота, HEPES | 10 mM | Life Technologies | 15630-080 |
| B27 | 10 &; л/мл | Gibco | 17504-044 |
| N2 | 10 &; л/мл | Gibco | 17502-048 |
| Органоидная среда для посева | |||
| Органоидная питательная среда | |||
| Эпидермальный фактор роста (EGF) | 50 нг/мл | Invitrogen | PMG8041 |
| Fibroblast growth factor-10 (FGF10) | 100 нг/мл | PeproTech | 100-26 |
| Первичные антитела | |||
| Anti-Cytokeratin 19 (CK19) антитела, Rabbit | 1:250 | Abcam | ab53119 |
| Область, определяющая пол Антитело Y-Box 9 (SOX9), Кролик | 1:200 | Santa Cruz | sc-20095 |
| Антитело к панкреатической двенадцатиперстной кишке Homeobox 1 (PDX1), Кролик | 1:2000 | DSRB | F109-D12 |
| Антитело к E-кадгерину, Коза | 1:500 | Santa Cruz | sc-31020 |
| Ацетилированное антитело к альфа;-тубулину, Мышь | 1:500 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| Вторичные антитела | |||
| 488 меченый анти-кролик, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-21206 |
| 594 меченый анти-козлятник, Donkey IgG | 1:1000 | Invitrogen | A-11058 |
| 568 меченый анти-мышиный, козий IgG2b | 1:500 | Invitrogen | A-21144 |
| TopFlash Wnt репортер анализ | |||
| TopFlash HEK293 клеточная линия | ATCC | CRL-1573 | |
| Набор для анализа люциферазы | Biotium | 30003-2 | |
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Life Technologies | 25300054 | |
| 0,4% Трипан Blue Solution | Life Technologies | 15250061 | |
| <сильно>Дополнительные материалы и реагенты | |||
| Базовая матрица, безфенольный матригель | CORNING | 356237 | |
| Буфер для диссоциации, Accutase | Gibco | A1110501 | |
| Среда для замораживания клеточных культур, Recovery | Life Technologies | 12648010 | |
| Клеточный фильтр (70 & микро; m, стерилизованный) | Fisherbrand | 22363548 | |
| Guanidinium тиоцианат-фенольная РНК экстракция, TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| гель для обработки образцов, HistoGel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | |
| обнаружения микоплазмы | ATCC | 30-1012K | |
| 1,5 мл микроцентрифужная пробирка | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| 24-луночная пластина | США Scientific | CC7682-7524 | |
| 50 мл коническая центрифужная трубка | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| Флуоресцентный микроскоп | Nikon | Eclipse E800 | |
| Инвертированный микроскоп | Biotium | 30003-2 | |
| Лоток | Fisherbrand | 13-814-61 |
Ссылки
- Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
- Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
- DiPaola....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
