Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59544

⸱

23 апреля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Internal Medicine, The University of Michigan, 2Molecular & Integrative Physiology, The University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает производства система 3-мерного органоид мыши внепеченочных желчных протоков. Эти желчных organoids может поддерживаться в культуре для изучения биологии cholangiocyte. Желчных organoids Экспресс маркеры прародителем и желчных клетки и состоят из поляризованные эпителиальных клеток.

Аннотация

Cholangiopathies, которые затрагивают внепеченочных желчных протоков (EHBDs), включают в себя Билиарной атрезией, первичный склерозирующий холангит и холангиокарцинома. Они имеют без эффективных терапевтических вариантов. Инструменты для изучения EHBD весьма ограничены. Нашей целью было разработать органоспецифическая, универсальный, взрослых стволовых клеток, доклинические cholangiocyte модели, которые могут быть легко сгенерированы от дикого типа и генетически мышей. Таким образом мы сообщаем о Роман методика разработки системы культуры органоид (EHBDO) EHBD от взрослых мыши EHBDs. Модель является экономически эффективным, могут легко анализироваться, и имеет несколько нисходящие приложения. В частности мы описываем методологии мыши EHBD изоляции и одноклеточного диссоциации, органоид культуры посвящения, распространения и долгосрочного обслуживания и хранения. Этот манускрипт также описывает EHBDO обработки для иммуногистохимии, флуоресцентной микроскопии и мРНК изобилие количественный реального времени Количественная обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (qRT ПЦР). Этот протокол имеет значительные преимущества в дополнение к производству EHBD-конкретных organoids. Использование условных среды от клеток L-WRN значительно снижает стоимость этой модели. Использование мыши EHBDs обеспечивает практически неограниченные ткани для формирования культуры, в отличие от человеческих тканей. Сгенерированный мышью EHBDOs содержат чисто населения эпителиальных клеток с маркерами эндодермы прародителя и дифференцированной желчных клетки. Культивированный organoids поддерживать однородные морфология через множественные проходы и могут быть восстановлены после долгосрочного хранения в жидком азоте. Модель позволяет для изучения желчных прародитель пролиферации клеток, можно манипулировать фармакологически и может быть создан из генетически мышей. Будущие исследования необходимы для оптимизации условий культуры с целью повысить эффективность покрытия, оценки функциональных клеток зрелости и прямой клеточная дифференцировка. Желательно также разработка совместного культуры моделей и более биологически нейтральной внеклеточного матрикса.

Введение

Cholangiopathies являются неизлечимой хронической прогрессивного расстройств, которые влияют на желчных клеток, расположенных в интра - и внепеченочных желчных протоков (EHBDs)1. Некоторые cholangiopathies, как первичный склерозирующий холангит, холангиокарцинома, Билиарной атрезией и Киста холедоха, преимущественно влияет на EHBDs. Разработка терапии для cholangiopathies ограничивается ограниченное наличие доклинических моделей. Кроме того, предыдущие исследования сосредоточены на cholangiopathies, сгруппированных вместе: печень, интра- и EHBDs. Однако внутри - и EHBDs имеют собственный эмбриональное происхождение и, таким образом, следует рассматривать в качестве отдельных молекулярной патологии. Внутрипеченочных желчных протоков развиваются из внутрипеченочных протоковой пластины и черепной частью печеночная дивертикул, весь EHBDs развивать из хвостовой части печени дивертикул2. Они также полагаются на разных прародителя клеточных компартментов для взрослых гомеостаза, включая каналы Геринга внутрипеченочных желчных протоков и peribiliary желез в EHBDs2,3. Использование животных моделей для доклинических исследований ограничивается расходами и должно быть сведено к минимуму, по этическим соображениям. Таким образом упрощенный, воспроизводимость, время и экономически эффективным в пробирке модели являются весьма желательно.

Большинство предыдущих исследований cholangiopathies использованы нормальные мыши или крысы рака модели или человека холангиокарцинома клеточных линий, полученных от интра - и EHBDs4,5,6,7. Однако эти модели трансформированных клеток и не повторить, нормальный cholangiocyte биологии гомеостаза или в здоровом состоянии. Недавний прогресс в разработке моделей organotypic культуры позволил развитие 3-мерных структур из тканей различных типов, включая гепатобилиарной тканей, хотя не нормальные мыши EHBDs8,9, 10. Эти структуры «орган как» направленные на пародирование основной ткани и выращиваются в искусственной ниши, поддержки самообновления органоспецифическая стволовых/прогениторных клеток11.

«Organoid»-это широкий термин, наиболее часто описывает модели 3-мерной ткани, полученные из стволовых клеток. Organoids могут быть сгенерированы из перенесенной плюрипотентных стволовых клеток представлено эмбриональных стволовых клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Они также может быть создан из12органоспецифическая взрослых стволовых клеток. Некоторые cholangiocyte органоид модели были предложены в предыдущих исследований. Таким образом organoids, производный от человеческих плюрипотентных стволовых клеток были сообщил7,9,13 и предоставить ценные, время эффективным инструментом, который позволяет для одновременной генерации различных типов клеток. Однако эти плюрипотентных стволовых клеток organoids не в полной мере отражает структуру и функциональность основного взрослого EHBD cholangiocytes.

Organoids производным от взрослых стволовых клеток человека9 и кошачьих10 печени были также предложены. Кошачий модели не широко доступны и имеют ограниченный инструмент взята для целей исследования. Кроме того эти функции печени производные взрослых стволовых клеток, полученных organoids не модель внепеченочных cholangiocytes, но скорее внутрипеченочных cholangiocytes.

EHBD органоид поколения было сообщено от человека нормальный EHBDs14 и мыши EHBD холангиокарцинома15. Однако чрезвычайно ограничен доступ к EHBD ткани человека, и organoids производным от генетических мышиных модель холангиокарцинома15 не представляют здорового cholangiocyte биологии гомеостаза и являются производными от генетически модифицированные клетки.

Для устранения ограничений плюрипотентных стволовых клеток и печени, полученных cholangiocyte органоид моделей и ограниченный доступ к ткани человека, необходимо в доклинических моделях, мы разработали модель мышиных EHBD органоид (рис. 1A). Эта рукопись описывается разработка методики для мыши EHBD-производные organoids от взрослых ткани. Эти EHBD organoids с именем EHBDOs будет важным инструментом в пробирке для изучения механизмов, лежащих в основе EHBDs cholangiocyte гомеостаза и болезней процессов, таких как cholangiopathies.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Мичиганского университета.

1. Подготовка оборудования и материалов для мыши EHBD изоляции

  1. Подготовить посевной средних и стиральные буфера (Таблица материалов) в 50 мл конические трубы и держать их на 4 ° C или на льду до использования.
  2. Настройте таблицу хирургические (рис. 1B). Подготовьте стерилизации хирургических инструментов (рис. 1 c).
  3. Место стерильным 24-ну пластины в инкубатор культуры ткани 37 ° C для предварительного подогрева.
  4. Место Алиготе подвале матрицы на льду. Подвале матрицу следует используйте только тогда, когда он полностью сжиженный.

2. EHBD изоляции и желчных органоид культура

  1. Изоляция и приготовление суспензии одну ячейку мыши EHBD
    1. Усыпить взрослых (старше 2 месяцев) мыши согласно институциональных руководящих принципов. Поместите указатель мыши в лежачем положении. Откройте брюшной полости, используя подход срединной и убрать печени отдохнуть на диафрагму.
    2. Определение общего желчного протока, расположенный сразу под печени рубчика, осторожно потянув проксимальной двенадцатиперстную кишку с кровоостанавливающий. Отделите EHBD от окружающих тканей, с использованием лезвием скальпеля. Проведению проксимального конца общего желчного протока с щипцами, вскрыть его дистально чуть выше его этапе с двенадцатиперстную кишку, а затем вскрыть проксимальный конец воздуховода из печени (рис. 1 d). Сразу же место изолированные EHBD (Рисунок 1E) в холодной отмывающего буфера.
    3. Удалить EHBD из Отмывающий буфер и фарша 0.5 мм разделов с помощью лезвия стерильным скальпель. Место ткани на стеклянную пластину на льду во время процедуры (рис. 1B).
    4. Место разделы EHBD в пробирку, содержащую 500 мкл буфера диссоциации. Проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C. Нейтрализовать диссоциации буфера, добавив 500 мкл ледяной клеток питательной среды.
    5. Нарезанных суспензию клеток вверх и вниз прогрессирует через 18 G и 20 G иглы, 20 раз каждый. Фильтрации суспензии клеток через стрейнер ячейки 70 мкм и собирать потока через в 50 мл трубки.
      Примечание: Предварительное условие ситечко с 500 мкл стерильных фосфат амортизированное saline (PBS) до фильтрации для облегчения прохождения суспензию клеток.
  2. Создание EHBD organoids
    1. Центрифуга потока через от шага 2.1.5 на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
    2. Осторожно удалите супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл ледяной стерильные PBS. Перенесите ресуспендирования в новой 1,5 мл трубки. Повторите шаг 2.2.1.
    3. После центрифугирования тщательно удалите супернатант промывают ячеек, собранные в нижней части трубки. Ресуспензируйте Пелле клеток в 120 мкл сжиженного ледяной подвале матрицы, закупорить вверх и вниз с помощью Р200 советы.
      Примечание: Клетки Пелле ресуспендирования в подвале матрица должна быть выполнена на льду баня.
    4. Пластина 40 мкл клетки ресуспендирования в подвале матрицы в центр хорошо в подогретым пластине 24-хорошо.
      Примечание: Избегайте отсоса воздуха во время манипулирования подвале матрицы для предотвращения формирования пузыря.
    5. Возвращение пластину с клетками высокомобильна в подвале матрицы в инкубатор культуры ткани 37 ° C 15 минут или пока не затвердевших подвале матрица. Добавьте 600 мкл посева носителя нагревают до 37 ° C для каждой скважины (Таблица материалов). Возвращение пластину в инкубатор культуры ткани 37 ° C.
    6. Замените средство заполнения 600 мкл свежие органоид питательной среды в 3 дней и каждые 3 дней после этого. Монитор органоид рост с инвертированным микроскопом. Использование organoids течению приложения или Сплит каждые 7 до 9 дней до накопления мусора и органоид распада внутрипросветная наблюдаются (рис. 2A).

3. EHBD органоид прохода и хранения

  1. Прохождение EHBD organoids 1:3 до 1:4 каждые 7 до 9 дней
    1. Удалите носитель из колодца и 400 мкл ледяной PBS. Ресуспензируйте organoids, нежно дозирование смеси вверх и вниз 10 раз в колодец. Передача смеси 1.5 мл.
    2. Проход смесь через иглу 25 G 4 раза не присоединяться organoids. Центрифуга смеси на 400 x g 4 мин при 4 ° C.
    3. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в подвале матрица (1:3 до 1:4) для дальнейшего культивирования (шаг 2.2.4.) или вымыть клетки с лед холодной PBS для дальнейшей обработки.
      Примечание: Как правило 250-300 клетки покрыты в пластину 24-хорошо для нисходящие приложения. Покрытие эффективность может оцениваться по микроскопии яркие поля с помощью инвертированного микроскопа на 3-5 день после пассированый путем подсчета количества organoids и расчета их процент от количества первоначальных клеток. мРНК могут быть изолированы от EHBDOs, промывают в PBS, используя стандартный протокол, с помощью Гуанидиновые тиоцианат фенол хлороформ добычи.
  2. Длительное хранение EHBD organoids
    1. Удалите носитель из колодца и мыть organoids с комнатной температуре PBS. Удаление PBS из колодца не нарушая падение матрица подвале.
    2. 500 мкл ледяной ячейки замораживание среднего колодец. Нежно ресуспензируйте organoids в сжиженный подвале матрицы и замораживание среднего и перенесите смесь в криогенных флаконов.
    3. Храните флаконов на-80 ° C в течение 48 ч. Передача пузырьки азота бак для длительного хранения в паровой фазе.

4. EHBD органоид Pprocessing для встраивания парафин

  1. Ресуспензируйте EHBDOs в 500 мкл ледяной PBS (4 ° C), закупорить вверх и вниз 5-10 раз. Сбор ресуспензированы EHBDO в матрице сжиженного подвал в 1,5 мл.
    Примечание: Чтобы избежать нарушения organoids, отрезать дно 2-3 мм кончика P1000 и очень тщательно удалить супернатант.
  2. Центрифуги EHBD organoids на 350 x g 5 мин тщательно удалить супернатант не нарушая органоид Пелле.
  3. Добавьте 1 mL ледяной параформальдегида 4% (PFA) organoids и инкубировать organoids в 4%, PFA на ночь при 4° C. Удалите 4% PFA от organoids с помощью кончика P1000 после ночи инкубации.
  4. Добавить 1000 мкл комнатной температуры PBS в трубку с organoids и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Центрифуга трубку с organoids в PBS на 350 x g 5 мин повторить этот процесс еще два раза.
  5. Удаление PBS и добавьте 1 мл 30% этанола organoids. Инкубируйте 5 мин на RT.
  6. Центрифуга трубки на 350 x g 5 мин на RT. Remove 30% этанола. Добавить 1 мл 70% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
  7. Центрифугировать на 350 x g для 5 минут удалить 70% этанола. Добавьте 1 mL 100% этанола и инкубировать в течение 5 мин на RT.
    Примечание: Organoids может храниться в 100% этанола при комнатной температуре до 48 ч. перед дальнейшей обработкой.
  8. Тепла образец обработки гель в микроволновую печь на 20 s или до тех пор, пока сжиженный. Добавьте 50 мкл образца обработки гель в трубку с organoids. Поместите трубки на льду, до тех пор, пока образец обработки гель затвердевает.
  9. Удаление капля образца обработки гель с organoids из трубки и место между колодками синий Губка в кассету для дальнейшей обработки в ткани процессора. Использовать 15 минут для каждого шага в парафин embedder во время дальнейшей обработки...
  10. Раздел organoids парафин врезанных в образец обработки гель на 4 µm. Продолжайте с применением иммуногистохимического окрашивания как описано16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наш протокол описывает поколения organoids EHBD мыши, ткане- и взрослых стволовых клеток. После искусственного organoids, формирования кистозных структуры могут наблюдаться как 1 день после EHBD изоляции. Загрязнение с фибробластов не наблюдается обычно во время создания культуры. EHBDO покрытие эффективность составляет примерно 2% при изоляции от новорожденных или взрослого (старше 2 месяцев) мышах (рис. 2B). Обшивка эффективность EHBD organoids производным ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта работа описывает поколение 3-мерной модели мыши EHBD cholangiocytes organotypic. Важные шаги в EHBDO культуры поколения включают в себя тщательное EHBD рассечение во избежание заражения клеток поджелудочной железы, поддержание стерильных условий для предотвращения бактериального и грибкового заражения и тщательной обработки после центрифугирования, чтобы избежать Потеря клеточного материала. Требуется закрыть соблюдение описанных температурных условий. Существуют некоторые ограничения на метод. EHBDs взрослых мышей н...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана американской ассоциации исследование печени заболевания Pinnacle премии (чтобы н.р.) и национальных институтов здравоохранения, национального института диабета и пищеварения и заболевания почек (награды Р30 DK34933 н.р., P01 DK062041 до J.L.M.). Мы благодарим д -р Рамон Ocadiz-Руис (Мичиганский университет) за его помощь в разработке этой методологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
L-WRN среда для культивирования клеток
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
Фетальная бычья сыворотка (FBS)1%Life Technologies10437-028
Пенициллин-стрептомицин100 Ед/млLife Technologies15140-122
Буфер для стирки
Фосфатно-солевой буфер (PBS)50 млLife Technologies10010-023
Пенициллин-стрептомицин125 Ед/млLife Technologies15140-122
Амфотерицин B 6.25 и микро; g/mLLife Technologies15290-018
Органоидная питательная среда
L-WRN Кондиционированная среда 1:1ATCCCRL-3276
Advanced DMEM/F121:1Life Technologies12634-010
Пенициллин-стрептомицин100 Ед/мл LifeTechnologies15140-122
N-глутамин10 & микро; л/млLife Technologies35050-061
N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этан сульфоновая кислота, HEPES10 mMLife Technologies15630-080
B2710 &; л/млGibco17504-044
N210 &; л/млGibco17502-048
Органоидная среда для посева
Органоидная питательная среда 
Эпидермальный фактор роста (EGF)50 нг/млInvitrogenPMG8041
Fibroblast growth factor-10 (FGF10)100 нг/млPeproTech100-26
Первичные антитела
Anti-Cytokeratin 19 (CK19) антитела, Rabbit1:250Abcamab53119
Область, определяющая пол Антитело Y-Box 9 (SOX9), Кролик1:200Santa Cruzsc-20095
Антитело к панкреатической двенадцатиперстной кишке Homeobox 1 (PDX1), Кролик1:2000DSRBF109-D12
Антитело к E-кадгерину, Коза1:500Santa Cruzsc-31020
Ацетилированное антитело к альфа;-тубулину, Мышь1:500Sigma-AldrichT6793
Вторичные антитела
488 меченый анти-кролик, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-21206
594 меченый анти-козлятник, Donkey IgG1:1000InvitrogenA-11058
568 меченый анти-мышиный, козий IgG2b1:500InvitrogenA-21144
TopFlash Wnt репортер анализ
TopFlash HEK293 клеточная линияATCCCRL-1573
Набор для анализа люциферазыBiotium30003-2
0,05% Трипсин-ЭДТАLife Technologies25300054
0,4% Трипан Blue SolutionLife Technologies15250061
<сильно>Дополнительные материалы и реагенты
Базовая матрица, безфенольный матригельCORNING356237
Буфер для диссоциации, AccutaseGibcoA1110501
Среда для замораживания клеточных культур, RecoveryLife Technologies12648010
Клеточный фильтр (70 & микро; m, стерилизованный)Fisherbrand22363548
Guanidinium тиоцианат-фенольная РНК экстракция, TRIzolInvitrogen15596026
гель для обработки образцов, HistoGelThermo Fisher ScientificHG-4000-012
обнаружения микоплазмыATCC30-1012K
1,5 мл микроцентрифужная пробиркаFisherbrand05-408-129
24-луночная пластинаСША ScientificCC7682-7524
50 мл коническая центрифужная трубкаFisher scientific14-432-22
Флуоресцентный микроскопNikonEclipse E800
Инвертированный микроскопBiotium30003-2
ЛотокFisherbrand13-814-61
Универсальный набор для для вскрытия

Ссылки

  1. Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. The Cholangiopathies. Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).
  2. Carpino, G., et al. Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration. Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).
  3. DiPaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
  4. Venter, J., et al. Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats. Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).
  5. Glaser, S. S., et al. Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium. Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).
  6. Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
  7. De Assuncao, T. M., et al. Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes. Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).
  8. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  10. Kruitwagen, H. S., et al. Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  11. Spence, J. R. Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).
  12. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  13. Sampaziotis, F. Building better bile ducts. Science. 359 (6380), 1113(2018).
  14. Sampaziotis, F., et al. Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids. Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).
  15. Nakagawa, H., et al. Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands. Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).
  16. Razumilava, N. Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice. Hepatology Communications. , (2018).
  17. Boyer, J. L. Bile formation and secretion. Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).
  18. Carpino, G., et al. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).
  19. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  20. Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Wan, A. C. A. Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable? Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внепеченочный желчный протоккультура органоидоввыделение внепеченочного желчного протока мыширазмножение органоидовхранение органоидовиммуногистохимический анализколичественная ОТ-ПЦРбазальная мембранапассирование органоидовкриоконсервация
Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.