Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59555

⸱

30 апреля 2019 г.

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Department of Life Science and Medical Bioscience, Waseda University

В этой статье

Краткое содержание

Мы демонстрируем одноклеточную культуру бактерий внутри гигантских пузырьков (ГВ). ГВ, содержащие бактериальные клетки, были подготовлены методом передачи капель и были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате для прямого наблюдения за бактериальным ростом. Этот подход также может быть адаптирован к другим клеткам.

Аннотация

Мы разработали метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков (ГВ). Культура бактериальных клеток важна для понимания функции бактериальных клеток в естественной среде. Из-за технологических достижений, различные бактериальные функции клеток могут быть выявлены на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства. GVs представляют сферические микроразмерные отсеки, состоящие из амфифильных липидных молекул и могут содержать различные материалы, в том числе клетки. В этом исследовании, одна бактериальная клетка была инкапсулирована в 10-30 мкм GVs методом передачи капель и GVs, содержащие бактериальные клетки были обездвижены на поддерживаемой мембране на стеклянном субстрате. Наш метод полезен для наблюдения за ростом в реальном времени отдельных бактерий внутри ГВ. Мы культивировали клетки Escherichia coli (E.coli)в качестве модели внутри GV, но этот метод можно адаптировать к другим типам клеток. Наш метод может быть использован в научно-промышленных областях микробиологии, биологии, биотехнологии и синтетической биологии.

Введение

Культура бактериальных клеток на одноклеточном уровне получила все большее внимание. Культирование бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ограниченного пространства может выяснить бактериальные функции, такие как фенотипическая изменчивость1,2,3,поведениеклеток5, 6 , 7 (г. , 8 , 9, и устойчивость к антибиотикам10,11. Из-за последних достижений в области техники культуры, культура отдельных бактерий может быть достигнута внутри ограниченного пространства, например, в хорошо чип4,7,8, гель капли12,13 , и вода в масле (W / O) капля5,11. Для содействия пониманию или использованию отдельных бактериальных клеток необходимы дальнейшие технические разработки методов выращивания.

Везикулы, имитирующие мембрану биологических клеток, представляют сферические отсеки, состоящие из амфифильных молекул, и могут содержать различные материалы. Везикулы классифицируются в зависимости от размера и включают в себя небольшие пузырьки (SVs, диаметр йlt; 100 нм), большие пузырьки (LVs, lt;1 мкм), и гигантские пузырьки (GVs, SVs или LVs обыкновенно использованы как несущие снадобья из-за их сродства к биологической мембране клетки14. GVs также были использованы в качестве реакторной системы для строительства протоэлементов15 или искусственных клеток16. Инкапсуляция биологических клеток в GVs было сообщено17,18, и, таким образом, GVs показать потенциал в качестве системы клеточной культуры в сочетании с реакторной системой.

Здесь, наряду с видео экспериментальных процедур, мы описываем, как GVs могут быть использованы в качестве новых сосудов клеточной культуры19. GVs, содержащие бактерии были сделаны методом передачи капель20, а затем обездвижены на поддерживаемой мембране на крышке стекла. Мы использовали эту систему для наблюдения за ростом бактерий на одноклеточном уровне внутри ГВ в режиме реального времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка ГВ, содержащих бактериальные клетки методом передачи капель

  1. Подготовка липидных стоковых растворов 1-пальмитоила-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфохолин (POPC, 10 мМ, 1 мл) и 1,2-дистеэроил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-биотиниол (полиэтиленегликоль) -2000" (биотин-ПЕГ-ДСПЕ, 0,1 мм, 1 мл) в хлороформе/ метанол раствор (2/1, v/v) и хранить акции при -20 градусах Цельсия.
  2. Приготовление липидосодержащего масляного раствора
    1. Налейте 20 зл раствора POPC и 4 зл раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянную трубку(рисунок 1b (i)).
    2. Испарите органический растворитель потоком воздуха, чтобы сформировать липидную пленку и поместите пленку в обезвреживание на 1 ч, чтобы полностью испариться с органическим растворителем(рисунок 1b (ii)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо испарять органический растворитель в дымовом капюшоне.
    3. Добавьте в стеклянный флакон 200 л минерального масла (0,84 г/мл, таблицаматериалов) (рисунок1b (iii)).
    4. Оберните открываюшую часть стеклянного флакона пленкой и снизите ее в ультразвуковую ванну (120 Вт) не менее 1 ч(рисунок 1b (iii)). Окончательные концентрации POPC и biotin-PEG-DSPE составляют 1 мМ и 0,002 мМ соответственно.
  3. Предкультура бактериальных клеток
    1. Прививать кишечную палочку в 1x LB среды (1 г дрожжевого экстракта, 2 г бакто триптона, и 2 г хлорида натрия в 200 мл деионизированной воды) из пластины LB и инкубировать при 37 кс для 12-14 ч (ночь).
    2. После инкубации соберите 20 юл культурного раствора и перенесите в 1,98 мл свежей 1x LB-среды и снова засучив клетки на 2 ч.
    3. Проверьте оптическую плотность на уровне 600 нм (OD600)значения докультурного решения (подготовлено в шаге 1.3.2). Следует использовать предкультурное решение OD600 и 1,0-1.5.
  4. Подготовка внешних и внутренних водной решений GVs
    1. Растворите глюкозу в среде 1x LB для подготовки внешнего водиного раствора GVs. Подготовьте 20 мл раствора глюкозы (500 мм).
    2. Разбавить бульонный раствор глюкозы 1x LB среднего до 200 мМ(таблица 1).
    3. Растворите сахарозу в 1x LB среде для подготовки внутреннего вкового раствора GVs. Подготовьте 20 мл раствора сахарозы (500 мм).
    4. Смешайте предкультурное решение (OD600 и 1,0-1,5), сахарозный раствор (500 мМ) и 1x LB средний(таблица 1). Окончательное значение OD600 культурного решения должно состочиться 0,01-0,015, а конечная концентрация сахарозы должна сосуна 200 мМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы избежать осмотического давления. Необходимо сбалансировать концентрацию между внутренним и внешним ваквным раствором.
  5. Приготовление капель water-in-oil (W/O), содержащих бактериальные клетки
    1. Добавьте 2 ql внутреннего водного раствора ГВ (подготовленного в шаге 1.4.4) к 50 л масляного раствора, содержащего липиды (минеральное масло с POPC и biotin-PEG-DSPE) в пластиковой трубке с крышкой 0,6 мл(рисунок 1b (iv)).
    2. Эмульгировать два компонента в пластиковой трубке, нажав трубку вручную(рисунок 1b (v)).
  6. Формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки
    1. Добавьте 50 qqueous solution of GVs (подготовленного в шаге 1.4.2) в пластиковой трубке 1,5 мл(рисунок 1b (vi)) и мягко слой 150 л масляного раствора, содержащего липиды (минеральное масло с POPC и биотин-PEG-DSPE) на поверхности внешнего aqueous решение(рисунок 1b (vii)). Инкубировать этот образец при комнатной температуре (RT, 25 градусов по Цельсию) в течение 10-15 мин. Проверьте, чтобы убедиться, что интерфейс масла и водной раствор ы плоский.
    2. Добавьте 50 кл. раствора капли W/O (подготовленного в шаге 1.5.2) на интерфейсе масла и водного раствора с помощью пипетки(рисунок 1b (viii)).
    3. Centrifuge 1,5 мл крышкой пластиковой трубки (от шага 1.6.2) в течение 10 минут на 1600 х г на RT в центрифуге рабочего стола (рисунок1b (ix)). После центрифугирования, аспирировать масло (верхний слой) из 1,5-мл крышкой пластиковой трубки с помощью пипетки, и собирать GVs, содержащие бактериальные клетки(Рисунок 1b (x)).

2. Подготовка системы наблюдения GV (Система культуры бактериальных клеток)

  1. Подготовка небольших пузырьков (SVs) для конструктивов нг а поддерживаемая двухслойная мембрана
    1. Налейте 20 зл раствора POPC и 4 зЛ раствора биотин-PEG-DSPE в стеклянную трубку (используя тот же липидный состав, который используется для подготовки ГВ в шаге 1.1).
    2. Испарите органический растворитель потоком воздуха, чтобы сформировать липидную пленку и поместите этот образец в обезврежье в течение 1 ч, чтобы полностью испариться органического растворителя.
    3. Добавьте 200 мл глюкозы 200 мМ в 1x LB среде (внешний вакаусальный раствор ГВ) в стеклянный флакон.
    4. Оберните открываюшую часть стеклянного флакона пленкой и снизите ее в ультразвуковую ванну (120 Вт) не менее 1 ч.
    5. Подготовьте SVs методом экструзии21 с использованием мини-экструдера и поликарбонатной мембраны с размером 100 нм пор.
  2. Приготовление камеры ручной работы
    1. Просверлите отверстие 7 мм с полым ударом на двуликую уплотнитель (10 мм x 10 мм х 1 мм).
    2. Вставьте двуликую печать с отверстием на крышке стекла (30 мм х 40 мм, толщина 0,25-0,35 мм).
  3. Приготовление поддерживаемой двухслойной мембраны на крышке стекла в отверстие камеры
    1. Добавьте 30 зЛ раствора SV в отверстие камеры (подготовлено в разделе 2.2) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
    2. Аккуратно промыть отверстие дважды с 20 Зл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (внешний ваквоковой раствор GVs) путем pipetting.
  4. Иммобилизация GVs на поддерживается двухслойная мембрана на крышке стекла в отверстие камеры
    1. Ввести 10 зЛ нейтравидина с внешним вквокевым раствором ГВ (1 мг/мл) в отверстие и инкубировать на RT в течение 15 минут.
    2. Аккуратно промыть отверстие дважды с 20 Зл 1x LB среды, содержащей 200 мМ глюкозы (внешний ваквоковой раствор GVs) путем pipetting.
    3. Добавьте в отверстие камеры все растворы, содержащие ГВ (подготовленный в шаге 1.6.3) и запечатайте крышкой (18 мм х 18 мм, толщина 0,13–0,17 мм)(рисунок 2b).
  5. Микроскопическое наблюдение роста бактериальных клеток внутри ГВ
    1. Установите микроскопическую систему стадии нагрева с перевернутым микроскопом, оснащенным объективной линзой 40x/0.6 numerical aperture (NA) с большим рабочим расстоянием (рис.2б).
    2. Поместите камеру на микроскопическую систему стадии нагрева(рисунок 2b). Инкубировать GVs, содержащие бактериальные клетки в камере в статичном состоянии в течение 6 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Захват и запись микроскопа изображения роста бактериальных клеток внутри GVs каждые 30 минут с помощью научного дополнительного полупроводника оксида металла (sCMOS) камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы представляем простой метод для генерации ГВ, содержащих отдельные бактериальные клетки с помощью метода передачи капель(рисунок 1). На рисунке 1а показано схематическое изображение осадков ГВ, содержащих бактерии. W / O капель, содержащих бактерии передаются через масло-вода (липидный монослой) интерфейс центрифугации для формирования GVs. Разница в плотности между сахарозой (внутренним водным раствором) и глюкозой (внешнее во...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод культивирования бактериальных клеток на одноклеточном уровне внутри ГВ. Этот простой метод включает в себя формирование ГВ, содержащих бактериальные клетки на одноклеточном уровне с помощью метода передачи капель. По сравнению с другими подходами к получению ГВ, содержащих бактериальные клетки, этот метод имеет два преимущества: (i) легко развивается, и (ii) для подготовки GVs требуется небольшой объем (2 кВ) выборки. Метод передачи капель20 для подготовки ГВ, содержащих б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана ведущей инициативой для превосходных молодых исследователей (ЛИДЕР, No 16812285) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) Японии, Грант-в-помощь для молодых ученых исследований (No 18K18157, 16K21034) от Японского общества содействия науке (JSPS) до M.M., и Грант-в-помощи от MEXT до K.K. (No 17H06417, 17H06413).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BactotryptoneBD Biosciences211705
ChloroformWako Pure Chemicals032-21921
Защитное стекло (18 & 18 мм)Matsunami Glass Ind.толщина C0181810,13– 0,17 мм
Покровное стекло (30 & 40 мм)Matsunami Glass Ind.толщина под заказ0.25–
Настольная центрифугаHi-Tech Co.ATT101тип поворотного ротора
Двустороннее уплотнение (10 & 10 & 1 мм)NitomsT4613
Стеклянный флаконAS ONE6-306-01Даремская ферментационная трубка
ГлюкозаWako Pure Chemicals049-31165
Инвертированный микроскопOlympusIX-73
МетанолWako Pure Chemicals133-16771
Микроскопическая нагревательная система TOKAIHITTP-110R-100
Минеральное маслоNacalai Tesque23334-85
Мини-экструдерAvanti Polar Lipids610000
НейтравидинThermo Fisher Scientific31000
ОбъективOlympusLUCPLFLN 40×/0.6 NA
Поликарбонатные мембраныAvanti Polar Lipids610005размером пор 100 нм
sCMOS камераAndorZyla 4.2 plus
Sodium chlorideWako Pure Chemicals191-01665
СахарозаWako Pure Chemicals196-00015
Ультразвуковая ваннаAS ONEASU-3D
Экстракт дрожжейBD Biosciences212750
0,6 мл пластиковая туба с крышкойWatson130-806C
1,5 мл пластиковая туба с крышкойSumitomo Bakelite Co.MS4265-M
1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфоколинAvanti Polar Lipids850457PPOPC
1,2-дистеароил-snglycero-3-фосфоэтаноламин-N-[биотинил(полиэтиленгликоль)-2000]Avanti Polar Lipids880129Pбиотин-PEG-DSPE
0,35 мм

Ссылки

  1. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).
  2. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962-1965 (2005).
  3. Eldar, A., Elowitz, M. B. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 467, 167-173 (2010).
  4. Hashimoto, M., et al. Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).
  5. Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).
  6. Christopher, M., Waters, B. L. B. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  7. Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. On-chip culture system for observation of isolated individual cells. Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).
  8. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).
  9. Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. Cell shape dynamics in Escherichia coli. Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).
  10. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch. Science. 305, 1622-1625 (2004).
  11. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  12. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15681-15686 (2002).
  13. Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).
  14. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).
  15. Szostak, J. W., Bartel, D. P., Luisi, P. L. Synthesizing life. Nature. 409, 387-390 (2001).
  16. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  17. Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles. Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).
  18. Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique. ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).
  19. Morita, M., Katoh, K., Noda, N. Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures. ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).
  20. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  21. Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).
  22. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).
  23. Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles. Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).
  24. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).
  25. Kurokawa, C., et al. DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).
  26. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).
  27. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  28. Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors. Interface Focus. 8, 20180024(2018).
  29. Elani, Y., et al. Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules. Scientific Reports. 8, 4564(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Escherichia coli
Бактериальная культура клеток на одноклеточном уровне внутри гигантских пузырьков
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.