Этот протокол описывает высокопроизводительную плазмидную трансфекцию клеток млекопитающих в 384-хорошую пластину с использованием акустической технологии выброса капель. Трудоемкий, подверженный ошибкам раздавливание ДНК и мультиплексирование, а также дозирование реагентов трансфекционного реагента, являются программным обеспечением и выполняются нанодайзером. Клетки затем посеяны в этих предварительно заполненных скважин.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокопроизводительная ДНК плазменный мультиплексирование и трансфекция с использованием акустической технологии нанодозирования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Трансфекция клеток, незаменимая для многих биологических исследований, требует контроля многих параметров для точного и успешного достижения. Чаще всего выполняется при низкой пропускной их, это к тому же трудоемкие и подверженные ошибкам, тем более при мультиплексации нескольких плазмидов. Мы разработали простой, быстрый и точный метод для выполнения трансфекции клеток в 384-хорошо макет пластины с использованием акустических капель катапульты (ADE) технологии. Устройство nanodispenser используемое в этом изучении основано на этой технологии и позволяет точно поставку nanovolume на высокой скорости от плиты скважины источника к назначению одному. Он может обойтись и мультиплекс ДНК и трансфекционного реагента в соответствии с заранее разработанной таблицы. Здесь мы представляем оптимальный протокол для выполнения ADE основе высокой пропускной способностью плазмидтранса, что позволяет достичь эффективности до 90% и почти 100% котрансфекции в котрансфекционных экспериментов. Мы расширяем первоначальную работу, предлагая удобный для пользователя макрос на основе электронных таблиц, способный управлять до четырех плазмидов/колодцев из библиотеки, содержащей до 1536 различных плазмидов, и приложения для планшетного нахлыстое направляющее приложение. Макрос разрабатывает необходимый шаблон (ы) исходной пластины (ы) и генерирует готовые к использованию файлы для нанодайзера и планшетного приложения. Четырехэтапный протокол трансфекции включает в себя i) разбавитель обойтись с классическим жидким обработчиком, ii) плазмидное распределение и мультиплексирование, iii) трансфекционный реагент распределяется нанодсером, и iv) клеточное покрытие на предварительно заполненных скважинах. Описанный программно-основанный контроль мультиплексирования и трансфекции Плазмидных плазмидных aDE позволяет даже неспециалистам в полевых условиях быстро и безопасно выполнять надежную трансфекцию клеток. Этот метод позволяет быстро определить оптимальные настройки для данного типа ячейки и может быть перенесен на более высокие и ручные подходы. Протокол облегчает применение, такие как человеческий белок ORFeome (набор открытых кадров чтения в геноме) или CRISPR-Cas9 на основе генной функции проверки, в непулированных стратегий скрининга.
Введение
Представленный здесь метод подробно описывает, как выполнять мультиплексирование и трансфекцию ДНК в клетках млекопитающих при высокой пропускной состоянии с помощью жидкого нанодайзера на основе акустической системы в 384-хорошей пластине, даже для неспециалистов в этой области. Этот недавно опубликованный метод1 позволяет выполнять столько, сколько 384 независимых плазмидных мультиплексирования ДНК и трансфекции условиях в одном эксперименте, менее чем за 1 ч. Одиночные или котрансфекционные эксперименты были успешными, достигнув почти 100% котрансфекция в популяции трансинфицированных клеток. Этот протокол упрощает трансфекцию, поскольку бол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Предварительная подготовка
- Подготовка программ перистальтических жидкостных обработок
ПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавитель ныхивательных и клеточных этапов протокола должна быть подготовлена специальная программа с учетом высоты дозирующей головки к используемой пластине и намерения шага.- Для шага разбавителя с 1 злицы установите кассету номиналу 1 л и подготовьте программу с настройками, описанными в шагах 1.1.1.1 и 1.1.1.2.
- Отрегулируйте параметр скорости потока до максимума для лучшей пропускной связи, так как на этом этапе не ожидается никакого биологического материального ущерба. Отрегулируйте высоту дозир....
- Для шага разбавителя с 1 злицы установите кассету номиналу 1 л и подготовьте программу с настройками, описанными в шагах 1.1.1.1 и 1.1.1.2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
f Для того, чтобы определить, может ли технология ADE быть использована для автоматизированного протокола обратного трансфекции, мы отслеживали эффективность трансфекции клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, используя красный флуоресцентный tdTomato, выражающий плазмид. Сначала были перепроверены лучшие параметры трансфекции, различные разбавительные объемы и общее количество ДНК. Объем разбавленного объема использовался для того, чтобы капли ДНК, когда-то отпускаемые по всем скваж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Создание и оптимизация точного метода трансфекции высокой пропускной связи для данной клеточной линии требует от ученых следовать некоторым ключевым параметрам, описанным в этом разделе. Мы настоятельно рекомендуем начать с рекомендуемых значений во всем протоколе, так как эти параметры, оптимизированные для клеток HeLa, также оказались эффективными для клеток HEK. Однако, поскольку лучшие параметры могут зависеть от клеточных линий и трансфекционных реагентов, оптимальные условия могут быть определены путем изменения чи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы раскрыли получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и/или публикации этой статьи: Inserm, Лилльский университет, Институт Лилля Пастера, Conseil Regional du Nord, и PRIM-HCV1 и 2 (Пале де Рехерш Междисциплинарное сюр-ле-Медикамент), Национальная эгенство Речерче (ANR-10-E-PX-04-01), Федер (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) и Европейское сообщество (ERC-STG INTRACETB. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра С. Моуре, д-ра Б. Виллеман, д-ра Р. Ферру-Клемента и д-ра Х. Гроульта за их критический обзор и исправление рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 384LDV Microplate | Labcyte | LP-0200 | |
| 384-луночный микропланшет μ Прозрачный черный | Greiner | 781906 | |
| Ampicilin | Sigma | A9393-5G | Выбор антибиотика для бактерий, преобразованных с помощью экспрессии ампицилина векторный |
| Android планшет | Samsung | Galaxy Note 8 | используется для руководства пользователя, в то время как исходная пластина вручную дозирует |
| Aniospray Surf 29 | Anios | 2421073 | дезинфицирующее средство для очистки головки MicroFlo |
| Columbus программное обеспечение | Perkin Elmer | для анализа изображений | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, добавка GlutaMAX, пируват | Thermo Fisher Scientific | 10566032 | среда для клеточных культур |
| Echo Cherry Pick 1.5.3 программное | Labcyte | Software, позволяющее дозировать на основе ADE устройство Echo550 из файла *.csv; программное обеспечение для нанодиспенсера | |
| Echo550 | Labcyte | Дозатор на основе ADE | |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | для добавления в среду для клеточной культуры |
| раствора формалина, нейтрально буферизованного, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | для фиксации клеток |
| HeLa | ATCC | HeLa (ATCC® CCL-2™) | |
| Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат | Thermo Fisher Scientific | H3570 | 10 мг/мл раствор в воде |
| INCell Analyzer 6000 | GE Healthcare | 29043323 | автоматизированная лазерная конфокальная платформа визуализации |
| LB среда | Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, порошок | 12780052 | питательная среда для роста бактерий |
| Буфер для лизиса (A2) | Macherey-Nagel | 740912.1 | Буфер из набора плазмид NucleoSpin, используемый для получения плазмиды из бактериальной культуры |
| MicroFlo 10µ L кассета | Biotek Instruments Inc | 7170013 | для использования с диспенсером MicroFlo |
| MicroFlo 1μ L кассета | Biotek Instruments Inc | 7170012 | для использования с дозатором Microflo Диспенсер |
| MicroFlo Biotek | Instruments Inc | 7171000 | перистальтический насос устройство для обработки жидкости |
| Микрообъемный спектрофотометр | Denovix | DS-11 Спектрофотометр | Измерение концентрации ДНК |
| образцов mVenus плазмиды | кДНК mVenus клонировали путем ферментативной рестрикции, расщепления и лигирования в сайтах Age1/BsrG1 плазмиды tdTomato-N1 | Векторный тип: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus | |
| Macherey-Nagel | 740913.1 | Буфер из набора плазмид NucleoSpin, используемый для получения плазмиды из бактериальной культуры | |
| NucleoSpin Набор плазмид | Macherey-Nagel | 740588.50 | используемый для получения плазмиды из бактериальной культуры |
| Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| опциональный буфер для промывкиБуфер для промывки (A4) | Macherey-Nagel | 740914.1 | Буфер из набора плазмид NucleoSpin, используемый для получения плазмиды из |
| орбитального шейкера бактериальной культуры | инкубированный шейкер большой емкости | 444-7084 | Используется для выращивания бактерий при слабом перемешивании и 37°С; C |
| Пенициллин-стрептомицин | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10 000 Ед/мл |
| фосфатно-солевого буфера | Thermo Fisher Scientific | 10010001 | |
| Плазмидные мини-колонки | Macherey-Nagel | 740499.250 | Кремнеземная мембранная мини-колонка для приготовления плазмиды из бактериальной культуры |
| Ресуспензионный буфер (A1) | Macherey-Nagel | 740911.1 | Буфер из набора плазмид NucleoSpin, используемого для получения плазмиды из бактериальной культуры |
| РНКаза A | Macherey-Nagel | 740505 | Фермент из набора плазмид NucleoSpin, используемый для получения плазмиды из бактериальной культуры |
| tdTomato-N1 плазмида | Addgene | Plasmid #54642 | Тип вектора: Экспрессия млекопитающих, гибридный белок: tdTomato |
| TransIT-X2 Динамическая система доставки | Mirus Bio | MIR 6000 | |
| Буфер для промывки (AW) | Macherey-Nagel | 740916.1 | Буфер из набора NucleoSpin Plasmid, используемый для приготовления плазмиды из бактериальной культуры |
| 3D-принтер | Creality | CR10S, | используемый для печати пластины-адаптер |
| Blender Software | https://www.blender.org/ Свободное программное обеспечение под лицензией GNU General Public License (GPL). | Версия 2.79b | использовалась для проектирования пластинчатого адаптера |
Ссылки
- Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064(2018).
- Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
- Thermo Fisher Scientific.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
