Method Article

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

DOI:

10.3791/59576

⸱

April 27th, 2019

 ,  ,  , 
1Integrated Science Center, Biology Department, College of William & Mary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сумо является важным и очень консервативны, Малый убиквитин-как модификатор белка. В этом протоколе мы описываем использование устойчивых к стрессу рекомбинантного белка-улавливания сумо (kmUTAG) для визуализации родных, незамаркированных спрятаных концентов сумо и их локализации в различных типах клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем новый метод изучения фосфорилировании белков и их суб-клеточной локализации в клетках млекопитающих и не, ооцитов. Этот метод использует рекомбинантные изменения сумо захвата белка фрагмент, kmUTAG, производные от Ulp1 сумо протеазы стресс-терпимой многообещающий дрожжей Клюйверомика marxianus. Мы адаптировали свойства kmUTAG с целью изучения сумоилирования в различных модельных системах без применения антител. Для изучения сумо, KmUTAG имеет несколько преимуществ по сравнению с антителами на основе подходов. Этот стресс-терпимый сумо-захвата реагента производится рекомбинантли, он признает родной сумо изоформы от многих видов, и в отличие от коммерчески доступных антител он показывает снижение сродство для свободного, неприпрянепрямой сумо. Репрезентативные результаты, показанные здесь, включают локализацию контургейтов сумо в клетках культуры млекопитающих и немелях ооцитов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого метода состоит в том, чтобы облегчить изучение и анализ белков сумо-спряга с использованием рекомбинантной белки, удерживающей захват сумо UTAG (ULP доменного тега). Как описано ниже, UTAG может использоваться вместо других реагентов и подходов для очищения, обнаружения и визуализации сумо-модифицированных белков. В зависимости от условий роста, клетки могут содержать сотни или тысячи белков, которые модифицированы с сумо или сумо цепей (для обзора см. Kerscher et al. 20061 и кершер 20162). Это представляет значительные трудности для функционального анализа конкретных сумо-модифицированных белков, тем более, что только часть конкретной цели фосфорилировании фактически изменены3. В дополнение к их роли в основных клеточных процессов, таких как транскрипционного регулирования, белка гомеостаза, ответ на клеточный стресс, и хроматина ремоделирования во время митоза и мейоз; Теперь стало достаточно ясно, что сумо, сумо-модифицированных белков и компонентов сумо пути также имеют потенциал в качестве биомаркеров для патологий, таких как рак и нейродегенеративных расстройств4,5,6 ,7. Это подчеркивает необходимость надежных, надежных и легко доступных инструментов и инновационных подходов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков в различных клетках и образцах.

Во многих системах антитела, специфическая для сумо, являются реагентами выбора для обнаружения, изоляции и функционального анализа сумо-модифицированных белков8,9. Однако, некоторые коммерчески доступные сумо-специфические антитела дорогие, ограниченные по количеству или доступности, склонные выставлять дико переменные сходства и перекрестную реактивность, и в некоторых случаях отсутствие воспроизводимости10. Одним из альтернативных подходов является выражение эпитопа-тегами сумо в трансформированных клетках и организмах, но связывая Теги эпитопа к сумо может искусственно понизить его сопряжение с целями протеина11. Кроме того, эпитопы не полезны при оценке нетрансформиенных клеток или тканей.

Ulp1 является консервативным протеазы сумо из с. цервиии, что оба процесса прекурсоров сумо и desumoylates сумо-спрягается белки12. Мы разработали реагента UTAG на основе счастливого наблюдения, что мутация каталитического цистеина (C580S) в Ulp1's сумо ULP domain (UD) не только предотвращает расщепление сумо, но и ловушки сумо-спрягается белков с высоким Жадность12. Для простоты, мы ссылались на этот карквадратные терминала сумо Ulp1 (C580S) фрагмент как UTAG (короткий для UD TAG). UTAG является рекомбинантной Пан-сумо улавливания белка, который представляет собой полезную альтернативу анти-сумо антител, используемых для изоляции и обнаружение сумо-модифицированных белков. Важно отметить, что он специально признает, изначально сложенный, спрягается сумо, а не только один или несколько эпитопов на сумо. Для улучшения как белка стабильности и силы сумо связывания UTAG, мы породили вариант UTAG из стрессоустойчивых дрожжей Клюйверомика marxianus (km). KmUTAG плотно связывает сумо-спрятаврат с наносолнечной сродство13. Кроме того, kmUTAG устойчив к повышенным температурам (42 ° с), уменьшающих агенты (5 мм ТВИС-РИЦ (2-карбокезил) фосфин гидрохлорид), денатуранты (до 2 м мочевины), окисляющие вещества (0,6% перекиси водорода) и неионные моющие средства. Этот стресс терпимости выгодно во время суровых условиях очистки и длительное время инкубации, обеспечивая его стабильность и сумо-захвата деятельности. Не удивительно, однако, KmUTAG в сумо-захвата деятельность несовместима с цистеин-модификации реагентов, ионные моющие средства и полностью денатурированного белка экстрактов. Замечательное сходство и свойства KmUTAG показывают, что этот реагент может стать частью стандартного репертуара для исследования sumoylated белков в нескольких видов.

Здесь мы предоставляем простой метод для обнаружения сумо-модифицированных белков в клетках млекопитающих и нематод с использованием рекомбинантного флуоресцентный белок-KmUTAG Fusion белка (kmUTAG-FL).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Обнаружение сумо в клетках культуры фиксированной ткани с использованием рекомбинантного белка сумо KmUTAG-FL

  1. Выращивать ткань культуры клетки выбора на 22 мм круглый крышка скользит в 6-хорошо TC пластин до 70%-80% свободно. Выполните шаги 1.2-1.8 в 6-хорошо пластины.
  2. Мойте клетки кратко с 1 мл DPBS (фосфатно-буферный физиологический раствор Дульбекко)
  3. Для фиксации Подготовьте свежее решение 4% раствора параформальдегида (ППН) (разбавленный в DPBS). Чтобы исправить клетки, добавить 2 мл 4% в ДФА в DPBS, чтобы каждый хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. Примечание: все шаги, с помощью фа должны выполняться в лаборатории безопасности капот и фа должны быть утилизированы надлежащим образом.
  4. Вымойте фиксированные клетки 3x в 1 мл DPBS, в то время как намазка пластины, 5 мин каждый мыть.
  5. Для проникновения в клетки, инкубировать в течение 15 минут с 0,1% тритон X-100 в DPBS
  6. Вымойте клетки 3x в 1 мл DPBS в то время как нукатирования пластины, 5 мин каждый мыть
  7. Инкубировать клетки с 500 мкл 0,1 M глицин-СОВМЕСТИМОГО (рН 2,0) для 10 s, затем нейтрализовать рН немедленно с 500 мкл 10x сумо протеазы буфер (СПб).
  8. Вымойте клетки 3x в 1 мл DPBS в то время как нюнатирование пластины, 5 мин каждый мыть
  9. Удалите покрылисты из колодца и поместите их в камеру влажности. Затем приступить к инкубаций на комбинезон следующим образом:
    1. Для окрашивания UTAG-FL только: Смешайте 1 мкг UTAG-FL с 100 мкл 1x СПб, содержащей 5 мм ТВИС в трубке, пипетите смесь на клетки на покрываете, и Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч в камере влажности.
    2. Необязательно, для UTAG-FL и anti-SUMO1 антитела Co-пятнать, продолжайте с следующими:
      1. Смешайте в трубке 1 мкг UTAG-FL и 0,5 мкл SUMO2/3 8A2 (полученные для развития Гибридообразование банка9) с 100 мкл блокирующего буфера, пипетки смеси на покрывало и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч.
      2. Мыть клетки на комбинезон 3 раза с 200 мкл DPBS, 5 мин каждый мыть.
      3. Смешайте в трубке 0,5 мкл анти-мышь Alexa Fluor 488 спрягается антитела с 100 мкл блокировка буфера, пипетки смеси на покрывало, и инкубировать в комнатной температуре в течение 1 ч.
  10. Для мытья комбинезон, пипетки 200 мкл DPBS на каждом покрывало и оставить на месте в течение 10 мин. Повторите стирку 2 раза.
  11. Удалите покрывало с последнего мытья и переверните его на предварительно очищенного микроскопа слайд с каплей монтажа среды (см. таблицу материалов).
  12. Храните ночью в морозильной камере-20 °C перед просмотром под микроскопом. Визуализируйте используя соотвествующие наборы фильтра для DAPI (дна), Texas красный (kmUTAG-FL), и Alexa Fluor 488 (если опционально Co-пятнать SUMO2/3 выполнено).

2. Обнаружение сумо в фиксированных немеле гонады с использованием UTAG-FL

  1. Перенесите Взрослый гермафродитами на 8 мкл капли яичного буфера14 на плюс заряженный слайд, который был покрыт поли-L-лизин. Отпустите гонады из червей с помощью 27,5 G иглы. Продолжайте либо этикетировочных антител или UTAG-FL маркировки.
  2. Для маркировки антител образцов, действовать следующим образом:
    1. Пробы стоп-трещины в жидком азоте, а затем зафиксировать на ночь в-20 °C метанол в банке Коплин.
    2. Кроме того, в Коплин банки, мыть слайды в 3 раза в 1x PBS, затем блок для 20 мин в PBS, содержащие 0,5% БСА и 0,1% между 20.
    3. Добавить 30 мкл антитела анти-сумо 6F2 (1:10) на каждый слайд, охватывающий образцы. Инкубировать на ночь в камере влажности при температуре 4 ° c.
      Примечание: сумо 6F2 был получен от развития гибридомы банк исследований15.
    4. В Коплин банки, мыть слайды для 2 мин в 1x PBS, затем накрыть и инкубации образцов с 30 мкл из DyLight 488 коза-анти мышь вторичного антитела (1:200) в течение 1,5 часов в камере влажности при комнатной температуре.
    5. В Коплин банки, мыть слайды для 2 мин в 1x PBS, выполните быстрое погружение в dH20, а затем смонтировать слайды с монтажной среды (см. таблицу материалов).
  3. Для маркировки KmUTAG-FL, продолжайте следующее:
    1. Чтобы исправить клетки, добавьте 1 том 8% PF для образцов для окончательной концентрации 4% PF. исправление в течение 10 минут в камере влажности, а затем погасить реакцию путем переноса слайдов в банку coplin содержащие 1x PBS с 0,1 M глицина, по крайней мере 5 мин.
    2. В Коплин банки, мыть клетки в течение 5 минут в 1x PBS, затем проникая образцов в 1x PBS, содержащие 0,1% тритон-X для 10 мин.
    3. Промыть в Коплин банку, по крайней мере 5 минут в 1x PBS, затем добавить 200 мкл 0,1 м глицин-совместимого (pH = 2,0) к образцам на слайде в течение 10 секунд. Немедленно добавьте 200 мкл 10x СПб для нейтрализации рН.
    4. Вымойте слайд в 1x PBS в банке Коплин в течение 5 минут.
    5. Удалите слайд из стирки и пипетки 100 мкл 1x СПб + 5mM ТВИС, содержащий 2 мкг UTAG-FL для нематод на слайдах, и инкубировать в камере влажности для 1 ч без качания.
    6. Верните слайд в банку Коплина и промойте в течение 15 минут в 1x PBS
    7. Снимите слайд с мытья, используйте лабораторную протирайку вокруг образца, а затем установите слайды с 5 мкл монтажных средств (см. таблицу материалов). Храните слайды при температуре 4 °C. Визуализируйте используя соотвествующие наборы фильтра для DAPI (дна), Texas красного (kmUTAG-FL), и DyLight 488 (SUMO2/3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KmUTAG-FL является рекомбинантной, mCherry-меткой сумо-улавливания белка. Для производства kmUTAG-FL, мы клонировали Codon-оптимизированный mCherry-kmUTAG в pSPOT1 бактериального Сверхэкспрессия плазмид (рис. 1). После индукции, протеин kmUTAG-FL был очищен на Spot-ЛОВУШКЕ, увял, и замерз до более дальнеишего пользы. Для обеспечения захвата сумо деятельности KmUTAG-FL, мы подтвердили связывание с SUMO1-спрятаных бус и осадков в сумо-CAT слияния белка (данные ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы вводим использование kmUTAG-FL, рекомбинантного белка, для функциональных исследований сумо в стационарных клетках млекопитающих и расчлененных гомелях. KmUTAG-FL является стресс-терпимым Пан-сумо конкретных реагентов, что признает и ловушки родной сумо-спрятаных белков и сумо цепей. Так как Третичная структура сумо очень консервативен, весьма вероятно, что варианты сумо из дополнительных моделей и немодельных систем могут быть проанализированы с помощью реагента kmUTAG-FL. Как таковой, KmUTAG-FL может представи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантные kmUTAG реагенты предоставляются научно-исследовательское сообщество через Kerafast.com.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Кершера за их поддержку, Натали Нгуен для критического чтения рукописи, и Лидия ЭПР для секвенирования. Эта работа была поддержана Фондом коммерциализации исследований Содружества MF16-034-LS в OK. Исследовательская поддержка для студентов W & M была предоставлена Фондом научных исследований Бейли-Хьюстон, а Карлов центр чтит стипендии RY и CH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Параформальдегид (формальдегид) водный растворЭлектронная микроскопия Sciences30525-89-4
6-луночные планшеты для культивирования клетокGenesee Scientific/Olympus Plastics25-105
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-545-003Используется в качестве вторичного антитела для мышиного моноклонального антитела
DPBS, без кальция, без кальция магний Fisher ScientificGibco 14190144
Dylight 488 конъюгированный AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch115-485-146Используется в качестве вторичного антитела для мышиного моноклонального антитела
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover GlassesFisherbrand12545101
FLUORO-GEL II с DAPIElectronic Microscopy Sciences50-246-93)Монтажный материал на шаге 1.11
ФТОР-ГЕЛЬ с DABCOЭлектронная микроскопия Sciences17985-02С добавлением DAPI в 1 & микро; г/мл; монтажный материал на шаге 2.2.5
Глицин-HClFisher BioReagentsBP3815
Glycine-HClACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flKerafastKmUTAG реагенты доступны на Kerafast.com
Oneblock Western-CL блокирующий буферPrometheus20-313
PBS, фосфатный буфер с солевым раствором, 10X растворFisher БиореагентыBP3994
PNT2 клеточной линииSigma-Aldrich95012613Нормальный эпителий предстательной железы увековечены с помощью SV40.
pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2SUMO 6F2 депонировали в DSHB Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]500 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2% NP-40, 1,5 M NaCl
SUMO-2 Антитело 8A2DSHBSUMO-2 8A2SUMO-2 8A2 был депонирован в DSHB Матунисом, М. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)
TCEP-HCLGoldBio51805-45-9Использовался в качестве восстановителя в концентрации 5mM
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1Использовался для проникновения в концентрации 0,1% в DPBS/PBS (для червей)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
  2. Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
  4. Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
  5. Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
  6. Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
  7. Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).
  8. Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
  9. Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
  10. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
  11. Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
  12. Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
  13. Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).
  14. Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  15. Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769(2014).
  16. Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
  17. Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
  18. Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).
  19. Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).
  20. Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
  21. Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SUMO trapping ProteinFluorescent UTAGSUMO DetectionMammalian CellsNematode OocytesAntibody free MethodSUMO ConjugatesNuclear LocalizationParaformaldehyde FixationMicroscopy Visualization

Related Articles