Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения

5.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59578

⸱

14 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Carver College of Medicine, University of Iowa, 2Fraternal Order of Eagles Diabetes Research Center, University of Iowa, 3Roy J. Carver Department of Biomedical Engineering, University of Iowa

В этой статье

Краткое содержание

Представлен протокол для создания геномодифицированных человеческих псевдоизоляторов из рассеянных клеток островков человека, которые переводятся лецивирусом, несущим короткую ШПильку РНК (shRNA). Этот протокол использует легко доступные ферменты и культурные сосуды, может быть выполнена легко, и производит генетически модифицированные человеческие псевдоизоляторы, пригодные для функциональных и морфологических исследований.

Аннотация

Различные генетические инструменты доступны для модулирования генов в островках поджелудочной железы грызунов для вскрытия функции островковых генов для исследования диабета. Однако данные, полученные с островков грызунов, часто не полностью воспроизводятся или применимы к островкам человека из-за хорошо известных различий в структуре и функции островка между видами. В настоящее время методы, доступные для манипулирования экспрессией генов человеческих островков, очень ограничены. Введение трансгена в нетронутые островки аденовирусом, плазмидом и олигонуклеотидами часто страдает от низкой эффективности и высокой токсичности. Низкая эффективность особенно проблематична в исследованиях по снижению генов в нетронутых островках, которые требуют высокой эффективности. Было известно, что ферментативно-рассеянные островковые клетки реагрегируются в культуре формирования сфероидов, называемых псевдоислетами. Контролируемые размером реагрегации клеток островка человека создают псевдоизоляторы, которые поддерживают динамическую секрецию инсулина первой фазы после длительной культуры и обеспечивают окно для эффективного введения лентивирусной короткой ШПильки РНК (SHRNA) с низкой токсичностью. Здесь описан подробный протокол для создания человеческих псевдоислетов после трансдукции ллентивиров с использованием двух коммерчески доступных мультивеллных пластин. Протокол может быть легко выполнен и позволяет эффективно едить внизрегулрецию генов и оценку динамизма секреции инсулина с использованием человеческих клеток-разлеток. Таким образом, человеческие псевдоизоляторы с опосредованной генной модуляцией обеспечивают мощную и универсальную модель для оценки функции генов в клетках островков человека.

Введение

Потеря функциональной бета-клеточной массы является центральной патологией какдля диабета типа 1, так и для 2-го типа 1. В то время как бета-клетки являются производителями инсулина в островках поджелудочной железы, связь между бета-клетками и небета-клетками играет важную роль в регуляции секреции инсулина2. Кроме того, дисрегуляция секреции глюкагона способствует гипергликемии при диабете3. Таким образом, существует большой интерес к модулировать экспрессию генов клеток в островках поджелудочной железы для решения механизма развития дисфункции островка при диабете. Различные подходы, включая трансгенных мышей доступны для модулировать экспрессию генов островков мыши. Тем не менее, человек и мышь островки показывают различные иннервации, распределение клеток, соотношение бета-клеток к альфа-клетки, и ответ на secretagogues4. Поэтому прямая оценка функции генов в островках человека чрезвычайно важна для понимания патофизиологии островков поджелудочной железы человека.

Аденовирусный вектор является наиболее широко используемым вирусным вектором для претворения островков поджелудочной железы в пробирке из-за высокой эффективности трансдукции в неразделяющихся клетках. Однако аденовирус не проникает в ядро островков эффективно, особенно в островки человека5,и является цитотоксическим в высоких дозах6. Сравнительно, лентивирусный вектор менее цитотоксичен и поставляет экзогенные гены постоянно в хромосому пост-митотических клеток, что делает его широко проверенным средством для генной терапии7. Тем не менее, способность лентивирус проникнуть в ядро нетронутых островков человека также ограничена, тем самым требуя частичной дисперсии путем ферментативного пищеварения для повышения эффективности трансдукции8. Предостережение с дисперсией нетронутых островков человека прерывание клеток и клеточной матрицы связи, которая ставит под угрозу динамическую регуляцию секреции инсулина решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы у людей9. Таким образом, было сложно оценить влияние модуляции генов на динамическую регуляцию островковой функции в модели островков человека.

Известно, что рассеянные островков ы токсы с островков человека и грызунов автономно реагрегатируются на островоподобные структуры, называемые «псевдоизлетами». Псевдоислеты показывают бета-и небета-клеточная дистрибуция, аналогичная родному островкам10,11. Кроме того, после долговременной культуры, родные островкипостепенно теряют надежную первую фазу секреции инсулина 5,10,11,12. Тем не менее, псевдоизлеты продемонстрировали лучшее сохранение секреции инсулина первой фазы в ответ на глюкозу по сравнению с местными островками после того же периода культуры5. В дополнение к лучшей секреции инсулина, контролируемые размером реагрегации клеток человека в низких пластинах крепления11 предоставляет окно возможностей для введения лентивирусных векторов до их реагрегации в псевдовизлеты. Несколько исследований продемонстрировали полезность псевдоизлетов в сочетании с опосредования трансдукции лентивиральной. Caton et al.13 сообщили, что введение зеленого флуоресцентного белка (GFP), выражающего лентивирус, мало повлияло на секрецию инсулина при достижении однородного выражения ГФП в крысиных псевдоислетах по сравнению с неинфицированным контролем. Они также продемонстрировали специфическое влияние различных connexins на секрецию инсулина путем overexpressing connexins 32, 36, и 43 через lentivirus13. Человеческие псевдовизлеты, подготовленные с коммерчески доступной 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления показали, что lentiviral-опосредованное переэкспрессия транскрипционного фактора SIX3 улучшает секрецию инсулина оценивается статической инкубации14. Недавно, человеческие псевдовизлеты, подготовленные с 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления были использованы для downregulate глюкокиназы через lentiviral короткой шпильки РНК (SHRNA) в качестве доказательства принципа, чтобы показать, что глюкоза стимулировали секреции инсулина уменьшается, в то время как KCl-стимулировали секрецию инсулина была сохранена5. Исследование также показало, что человеческие псевдоизоляторы похожи на родние островки в экспрессии генов и секреторных профилях, что еще больше поддерживает полезность человеческих псевдоизлетов для вскрытия регуляции островной функции5. Хотя перифузия не была выполнена, биоинженерных микроколодцы культуры пластины, которые недавно стали коммерчески доступны, также сообщается, что совместимы для лентивирусной трансдукции и производства человеческих псевдоизоляторов, которые выставлены отличные инсулина секреция in vitro и in vivo после трансплантации11. В совокупности, формирование человеческого псевдоистлета в сочетании с лентивирусной трансдукцией является простым и эффективным подходом к исследованию патологиологии островков человека, обеспечивая ценный инструмент для проведения механистических исследований на человеческих островках.

В настоящем докладе представлен протокол для формирования человеческих псевдоизоляторов, трансцизированных с помощью лентивирусной платформы, 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. Оба достигают эффективной модуляции экспрессии генов и создают человеческие псевдоизоляторы, совместимые для оценки вниз по течению, включая статическое инкубацию и перифузию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

До начала исследований, человеческие предметы исследования определение было сделано ВУниверситете штата Айова Институциональный обзор совета, который определил, что исследование не соответствует критериям для исследования человеческих субъектов. Проконсультируйтесь с местным наблюдательным советом перед началом исследования, чтобы определить, требует ли источник островков и запланированного исследования предварительного утверждения.

ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для образования 192 псевдоизоляторов размером с 3000 клеток/псевдоизлетов в 96-хорошей ультранизкой пластине крепления или 1200 псевдоизоляторах размером с 500 клеток/псевдоизлетов в 96 скважинах или 1200 псевдоислетов размером с 500 клеток/псевдоизлетов в микроколодцы культуры пластины. МТЗ островков требуется варьируется между различными препаратами человека островков в качестве донорских факторов (возраст, здоровье, вес), эффективность изоляции, и культурные условия влияют на выход одной подвески клеток. В этом протоколе используется лентивирус, содержащий shRNA, ориентированный на ген интереса. Цитомегаловирус (ЦМВ) и человека фосхоглицерат киназы (hPGK) промоутер основе лентивирных векторов, как сообщается, вниз-регулировать ген эффективно в человеческих псевдоизоляторов5,15. Использование лентивирус требует предосторожности, как биоопасность16. Свяжитесь с местным комитетом по биобезопасности до начала использования ллентивируса.

1. Ночная культура островков человека для восстановления после отгрузки

  1. Подготовка Connaught Медицинские исследовательские лаборатории 1066 (CMRL-1066) средний дополнен 1% человеческого сыворотки альбумина (HSA) путем объединения 50 мл CMRL-1066, 0,5 г HSA, 0,5 мл пенициллина-стрептомицина, и 0,5 мл 100 мг/мл клеет HS безопасности шкаф (BSC) и прохождения через фильтр 0,2 мкм для стерилизации.
  2. Аккуратно закружить доставку бутылку держать островки в подвеске. Перенос судоходной среды, содержащей островки, в коническую центрифугу 50 мл. Пусть трубка сидеть в BSC в течение 15 минут, так что островки оседают на дно трубки.
  3. Удалите транспортировку среды осторожно, не нарушая платка капельницы с помощью 10 мл пипетки. Повторно приостановить гранулы на газе в 1% HSA CMRL до концентрации 400 МВЗ/мл.
  4. Передача островков в нетканеную культуру обработанного блюда. Если островки делятся на несколько блюд, держите островки равномерно приостановлено в среде, мягко закрученного перед расщеплением. Культурные островки при 37 градусах По Цельсию в инкубаторе CO2 на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование нетканеной культуры обработанные блюда требуется для предотвращения привязанности островков к пластине.

2. Подготовка одноклеточной подвески с островков человека

  1. Подготовка следующих: CMRL-1066 среда с 10% тепло-инактивированной сыворотки крупного рогатого скота плода (HiFBS), пенициллин-стрептомицин, и глутамин (10% HiFBS CRML) при комнатной температуре (RT), 40 мкм ситечко, 35 мм Петри блюдо, 1 мл туберкулина sy.
  2. Перенос островков человека после ночной культуры в коническую центрифугу мощностью 15 мл. Центрифуга при 190 х г в течение 5 мин в размахивая ведро ротора. Аспирная среда с пипеткой 5 мл, не нарушая гранулы на клет.
  3. Вымойте гранулы, добавив 10 мл фосфат-буферного солира (PBS) в трубку, аккуратно перемешайте и центрифуги при 190 х г в течение 5 мин. Aspirate PBS, не нарушая газолет.
  4. Повторно приостановить островк гранулы в 0,5 мл предварительно разогретой протеолитической и коллагенолитной ферментной смеси и пипетки 5x с помощью пипетки P1000 для смешивания островков. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 5 мин. Смешайте трубачом вверх и вниз осторожно 1-5 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агрессивное пипеттинг увеличит потерю клеток.
  5. Проверьте облачность (одиночные клетки) и количество хлопьев (непереваренных островков). Добавляйте инкубацию от 2 до 37 градусов по Цельсию в зависимости от степени пищеварения, о ценящейся по облачности и количеству хлопьев. Остановить пищеварение, когда хлопья сводятся к 10% от предварения и раствор облачно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время, необходимое для пищеварения, отличается в зависимости от размера газона каждого человека, подготовки к газетам.
  6. Поместите 40 мкм ситечко в 35 мм Петри блюдо и мокрый ситечко, добавив 1 мл 10% HiFBS CMRL и нажав с 1 мл шприца поршень. Перенесите всю клеточную подвеску поверх ситечко и соберите проходвую в свежей трубке 15 мл.
  7. Вымойте трубку, используемую для пищеварения газолетов с 0,5 мл свежей среды CMRL для сбора оставшихся клеток и пройти мыть через ситечко. Объедините проходвую в трубке 15 мл. Повторите один раз.
  8. Далее, диссоциатив непереваренные островки, оставшиеся на ситечке, нажав ситечко, помещенное в 35-мм тарелку с 1 мл шприца поршенем. Соберите проходной снова и мыть ситечко со свежимCM CMRL-1066, чтобы удалить все оставшиеся переваренные островки из ситечко и блюдо. В общей сложности 3 мл одноклеточной подвески теперь будет находиться в трубке 15 мл.
  9. Запишите общий объем суспензии клеток и возьмите 10 аликотов клеток, чтобы подсчитать номер клетки на гемоцитометре.
  10. Центрифуги ядолок подвески в течение 5 мин на 200 х г. Удалите среду, не нарушая гранулы. Приступить к шагу 3.1.1 при использовании 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления или шаг 3.2.1 при использовании 24 хорошо microwell культуры пластины для реагрегирования клеток.

3. Псевдослет Формирование и Трансдукция лентивирусом

  1. Протокол с использованием 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления
    1. Определите желаемое количество клеток на псевдоизолятор и количество псевдоизоляторов для создания. Как правило, 1000-3000 ячеек используются для каждого псевдоислета для 96-колодец ультра-низкой пластины крепления. Для 3000 ячеек на псевдоизолятор, отрегулируйте суспензию клетки до 1 х 105 ячеек/мл, приостановив работу капельного пеллета со ступени 2,10 в 10% HiFBS CMRL, так что 30 зл клеточной суспензии имеет 3000 клеток. Рассчитайте общий объем 1 х 105 ячеек/мл одноклеточной подвески (мЛ), необходимой с помощью следующего уравнения:
      Общий объем 1 х 105 ячеек/мл одноклеточной подвески (мл) (количество ячеек на псевдоизолятор) x (количество псевдоизлетов) / 1 x 105.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию клеточной суспензии на основе желаемого количества клеток на псевдоизолятор так, чтобы 30 злклеточной суспензии сделали один псевдоистлет.
    2. Перенесите необходимый объем (30 л л х количество псевдоизоляторов) одноклеточной подвески на свежую трубку 15 мл. Добавьте 250 трансдукционных единиц (ТУ)/ячейку лентивирусной, содержащей шРНК, нацеленную на ген интереса или контроля.
      ПРЕДЕКТО: Лентивирус классифицируется как уровень биобезопасности 2 и может быть интегрирован в ДНК инфицированных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте концентрированный лецивирус, чтобы объем добавленного ллентивируса был минимальным. Титер, необходимый на одну клетку для эффективного замалчивания генов, может отличаться в зависимости от лентивирусной конструкции.
    3. Смешайте суспензию клеток с вирусом, аккуратно протянив 5x с пипеткой P1000. Перенесите смешанные клетки в стерильный резервуар реагента 50 мл при использовании 8-канального пипетки.
    4. Распределить 30 зл на скважину одноклеточной подвески, смешанной с лентивирусом в каждую скважину с помощью 8-канального пипетки или пипетки P200 в зависимости от количества скважин.
    5. Centrifuge 96-ну в размахивая ведро пластины центрифуги на 270 х г на RT в течение 7 мин. Проверьте, являются ли клетки собраны в центре каждого колодца. Если нет, то центрифуга снова как сбор всех клеток в центре колодца имеет решающее значение для формирования псевдоислета. Культура при 37 градусах По Цельсия в увлажненных 5% CO2 инкубатора ночь.
    6. Добавить 100 л предварительно разогретых 10% HiFBS CMRL на следующее утро, чтобы избежать высыхания клеток во время последующей культуры. Центрифуга при 270 х г,RT в течение 7 мин. Культура при 37 градусах по Цельсию в 5% CO2 инкубатора. Псевдоизлеты завершат формирование через 5–7 дней.
    7. При сборе псевдоизоляторов предварительно разогрейте желаемый объем в размере 10% HiFBS CMRL (100 л на островк), приготовьте один стерильный резервуар 50 мл, одну стерильную тарелку 10 см Петри и одну 8-канциоцидрую пипетку в BSC.
    8. Снимите 96-хорошую пластину из инкубатора и поместите в BSC. Пипетка 100 л на подолет 10% HiFBS CMRL в резервуар.
    9. Пипетка 100 л на колодец 10% HiFBS CMRL от резервуара до псевдоизлетов и пипетки вверх и вниз в 2-3 раза мягко в колодце, чтобы поднять островки вверх. Затем, аспирсредо среды в колодце, содержащем псевдоислет и выбрасывать в 10 см Чашку Петри. Использование 8-канального пипетки позволяет передавать 8 псевдоислетов одновременно.
    10. Проверьте пластину под световым микроскопом, чтобы обеспечить полное удаление всех псевдоизлетов. Псевдоизлеты образуют фирменные агрегаты и остаются агрегированными после подъема. Псевдовизлеты теперь готовы к экспериментам ниже по течению.
  2. Протокол с использованием 24-колодца микроколодцы культуры пластины
    1. Разогрейте анти-придерживающийся ополчивания раствор(Таблица материалов) к RT для эффективного образования сфероидов. Кроме того, предварительно теплый равнине CMRL-1066 и 10% HiFBS CMRL.
    2. Добавьте 500 qL в колодец анти-приверженности промывки раствор для каждого колодца 24-хорошо микроколодцы культуры пластины, которые будут использоваться для pseudoislets. Центрифуга при 1300 х г в течение 5 мин в размахивая ведро пластины центрифуги.
    3. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы обеспечить удаление пузырьков воздуха из микроколодцев. Если пузырьки воздуха оказались в ловушке в микроуэллах, центрифуга на 1300 х г в течение 5 минут снова.
    4. Примачить анти-придерживающихся очистных решений из скважин в BSC. Промыть каждую скважину с 2 мл теплой равнины CMRL-1066 один раз. Аспират CMRL-1066. Добавьте 0,5 мл/хорошо теплого 10% HiFBS CMRL к каждому хорошо спланированного для использования. Скважины теперь готовы к загрузке рассеянных человеческих клеток-абонек, подготовленных в шаге 2.10.
    5. Определите общее количество клеток, необходимых для каждой скважины. Один из 24-колодца микроколодцы культуры пластины содержит 1200 микровелл и образует 1200 псевдоизлетов. 500 клеток на псевдоислет x 1200 микровелл ы 6 х 105 клеток. Перепристените одиночные клетки от шага 2.10 до 6 x 105 клеток в 0.8 ml 10% HiFBS CMRL в стерильной трубке 1.5 mL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный объем на скважину составляет 2 мл. Объем клеточной суспензии не должен превышать 1,5 мл. Протокол описывает шаги для создания одного колодца псевдоизлета, трансиндуцированного лентивирусом. Масштабирование в зависимости от количества скважин, которые должны быть сделаны для каждого лентивирусного.
    6. Для вирусной трансдукции добавьте 125 ТУ/клеток в одноклеточную подвеску. Держите объем вируса ниже 0,2 мл. Инкубировать клеточной и вирусной смеси при 37 градусов по Цельсию с редким нежным смешиванием в течение 1 ч, чтобы контакт клеток с вирусом до конденсации клеток в шаге 3.2.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте концентрированный лецивирус, чтобы объем добавленного ллентивируса был минимальным. Меньшее количество ТУ на ячейку используется для Протокола 2 по сравнению с Протоколом 1, так как общий объем среднего числа клеток меньше. Тем не менее, титер, необходимый на одну клетку для эффективного замалчивания генов, может отличаться в зависимости от лентивирусной конструкции и нуждается в оптимизации.
      ПРЕДЕКТО: Лентивирус классифицируется как уровень биобезопасности 2 и может быть интегрирован в ДНК инфицированных клеток.
    7. После 1 ч отрегулируйте общий объем мотоклетки и вирусной смеси до 1 мл, добавив 10% HiFBS CMRL. Если клетки образуют сгусток после 1 ч инкубации, рассеять сядутную подвеску на одну клетку нежным и быстрым трубачом 2-3 раза. Пипетка очень важна для равномерного распределения клеток по микроскважинам. Передача подвески клеток в один из 24-колодца microwell культуры пластины.
    8. Сразу же после pipetting, центрифуга на 100 х г в течение 3 мин на RT, чтобы захватить клетки во всех микроуэллов. Обратите внимание под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены во всех микроуэллах.
    9. Культура микроколодца культуры пластины на 37 градусов по Цельсию в 5% CO2 инкубатора. Псевдоизлеты будут формироваться в 24-48 ч. Псевдоизлеты могут быть культивированы без средних изменений на срок до 7 дней.
    10. При изменении среды для культуры за 7 дней, заменить 50% до 75% среды для каждого среднего изменения следующим образом. Медленно удалите 0,5-1 мл среды с помощью пипетки P1000 из каждой скважины. Добавить 0,5-1 мл свежего 10% HiFBS CMRL медленно, поставив наконечник к стене колодца, чтобы избежать вытеснения псевдоизлетов из микроколодца культуры пластины.
    11. Чтобы подготовиться к сбору псевдоизлетов, разогрейте 10% среды HiFBS CMRL. Псевдоислеты, как правило, плавают в сыворотке свободной CMRL-1066 делает его трудно выбрать их.
    12. Аспир 0,5 мл среды от хорошо с помощью 1 мл пипетки и обойтись сми силой обратно на поверхность пластины, чтобы поднять псевдоизоляторы из микроколодца культуры пластины.
    13. Аккуратно аспирированные выбитые псевдоизлеты с помощью 1 мл пипетки и передачи островков в не-ткани культуры обработаны 6-хорошо пластины. Пройдите через небольшой 37 мкм обратимый ситечко, помещенный на коническую трубку 15 мл. Псевдоислеты останутся на фильтре; любые неинкорпорированные одиночные ячейки будут протекать через.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери меньшего размера псевдоизлетов через ситечко, ситечко может быть опущен.
    14. Распределите 1 мл 10% HiFBS CMRL по всей поверхности скважины, чтобы выбить все оставшиеся псевдоизоляторы, аспирировать выбитых псевдоизлетов, и пройти через ситечко. Повторите 3x, чтобы обеспечить полную коллекцию всех псевдослетов из скважин.
    15. Обратите внимание на микроколодцы культуры пластины под инвертмикроскопом, чтобы убедиться, что все псевдоизлеты собраны. Повторите мыть, как в шаге 3.2.14, если псевдоизлеты остаются.

4. Извлечение РНК для оценки эффективности джинного замалчивания

  1. Выберите псевдоизоляторы в RNase бесплатно PBS в 1,5 мл микроцентрифуги трубки и центрифуги на 300 х г в течение 3 мин при 4 кс. Удалите PBS, не нарушая гранулы на клетчатке и мыть один раз с PBS следуют центрифугации на 300 х г в течение 3 мин при 4 c.
  2. Аспирируй большую часть PBS с помощью пипетки P1000. Затем, изменить на P10 пипетка, чтобы удалить остальную часть PBS, не нарушая капельного пеллета.
  3. Добавьте 0,5 мл биоцианатного реагента для извлечения РНК(Таблицаматериалов) на трубку. Гомогенизировать псевдовизмы с помощью моторного пестика в течение 2–3 раз. Гомогенат в биоцианате гиоцинат экстракционизма РНК теперь может храниться при -80 градусах Цельсия или обрабатываться для очистки РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 24 из 3000 клеток-псевдоизлетов, образованных в 96 хорошо пластины или 48 из 500 клеток-псевдоизлетов, образованных в микроколодцы культуры пластины достаточно, чтобы получить 0,5-1 мкг РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует ключевые шаги в производстве псевдоизлетов с использованием 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления и микроколодцы культуры пластины. На рисунке 2а показаны последовательные изменения в морфологии при формировании псевдоизоляторов из 3 х 103 клеток островков человека в 96-хорошей ультра-низкой пластине крепления. Монослойные или свободные скопления клеток, наблюдаемых в первый день, превращают...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь представлен подробный протокол для генерации человеческих псевдоизлетов, которые трансцируются с помощью 96-хорошо ультра-низкой пластины крепления или микроколодца культуры пластины. Псевдоизоляторы, как сообщается, демонстрируют морфологию и секреторные функции, похожиена островки родного человека, и могут быть культивированы в течение длительного времени в пробирке 5,11,18. В отличие от местных островков человека, котор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержана Национальными институтами здравоохранения в Y.I. (R01-DK090490) и Американской диабетической ассоциацией в Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. и Y.I. поддерживаются Братским Орденом Орловского Научно-исследовательского центра диабета. A.B. поддерживается грантом на обучение национальных институтов здравоохранения (T32NS45549). Авторы использовали островки поджелудочной железы человека, предоставленные финансируемой NIDDK Комплексной программой распределения островок (IIDP) в городе Надежда (2UC4DK098085).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антиадгезивный раствор для промывкиStemcell technologies7919
Шкаф биологической безопасностиThermo ScientificСерия 1300 Тип A2
Сетчатый фильтр, 40 микрометровCorning431750
CMRL-1066ThermoFisher11530037
CO2 инкубаторThermo ScientificHeracell VIOS 160i
Коническая центрифужная пробирка, 15 млVWR89039-666
Коническая центрифужная пробирка, 50 млVWR89039-658
Фетальная бычья сывороткаThermoFisher26140079
реагент для экстракции тиоцианата гуанидиния РНКThermoFisher15596026тризол
глутаминThermoFisher25030164
ГемоцитометрMarien FeldNeubauer-Improved Bright line
Альбумин сыворотки крови человекаSigmaA1653
Инвертированный микроскопмарки Fisher11-350-119
МикроцентрифугаBeckman CoulterMicrofuge 20
Микроцентрифуга пробирка, 1,5 млСША Scientific1615-5500
Планшет для культивирования микролунокТехнологии стволовых клеток34411Aggrewell 400, 24 лунки
Пестик с моторным приводомGAMUT
Чашка, обработанная без культуры тканей, 10 смFisher ScientificFB0875713
PBSThermoFisher14190250
пенициллин-стрептомицинThermoFisher10378016
Чашка Петри, пипетка Celltreat 229638
, пипетка DOT Scientific 5 мл667205B
, пипетка 8-канальныйVWR#613-5253
VWR667210B10 мл
P10DenvilleUEZ-P-10
P200DenvilleUEZ-P-200
, P1000DenvilleUEZ-P-1000
Смесь протеолитических и коллагенолитических ферментовSigmaA6965Резервуар для реагентов Accutase
, 50 млVWR89094-680
Реверсивный фильтр, 37 микронТехнологии стволовых клеток27251
Качающаяся ковшовая пластина центрифугаBeckman CoulterAllegra X-14R
Ротор с поворотным ковшомBeckman CoulterSX4750A
туберкулиновым шприцем, 1 млBD309659
микропланшетом со сверхнизким креплением, 96лунок Corning4515
#399X644 35 мм, пипетка , пипетка , пипетка , пипетка

Ссылки

  1. Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
  2. Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711(2013).
  3. Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
  4. Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
  5. Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907(2018).
  6. Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
  7. Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
  8. Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
  9. Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
  10. Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
  11. Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
  12. Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
  13. Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
  14. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  15. Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855(2018).
  16. Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  17. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  18. Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
  19. Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
  20. Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
  21. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
  22. Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Лентивирусное сайленсинг-подавление геновчеловеческие псевдоостровкиизоляция островковых клетоктрансдукция шорна (shRNA)анализ секреции инсулинавестерн-блот анализпротокол центрифугированияуровень биобезопасности 2даунрегуляция гена
Лентивирные посредничества Джин Silencing в человека Pseudoislet Подготовлено в низких пластин присоединения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.