Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59584

⸱

22 мая 2019 г.

 ,  , 
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS), Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Biogenic Nanotherapeutics group (BION), 2Department of Pharmacy, Saarland University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем легко применимый протокол для оценки стабильности хранения внеклеточных пузырьков, группы естественных наночастиц, производимых клетками. Пузырьки загружаются с глюкуронидазы в качестве модели фермента и хранятся в различных условиях. После хранения оцениваются их Физикохимические параметры и активность инкапсулированных ферментов.

Аннотация

Внеклеточные пузырьки (EV) являются перспективными целями в текущих исследованиях, которые будут использоваться в качестве препаратов, носителей наркотиков и биомаркеров. Для их клинического развития важно не только их фармацевтическая деятельность, но и их производство должно быть оценено. В этом контексте исследования сфокусированы на изолированности электромобилей, их характеризации и хранении. Цель данной рукописи заключается в обеспечении поверхностной процедуры оценки влияния различных условий хранения на ЕДС без генетической манипуляции или специфических функциональных анализов. Это дает возможность быстро получить первое впечатление о стабильности электромобилей в условиях данного хранилища, а у электромобилей, полученных из разных источников, можно легко сравнить. Измерение устойчивости основано на физикохимических параметрах (размер, концентрация частиц и морфология) и сохранении активности их груза. Последний оценивается сапонин-опосредованной инкапсуляции фермента бета-глюкуронидазы в EV. Глюкуронидазы выступает в качестве суррогатной и позволяет легко квантификации через расщепление флуоресцентной молекулы репортера. Настоящий Протокол может быть инструментом для исследователей в поисках условий хранения, которые оптимально сохраняют свойства EV для продвижения исследований EV к клиническому применению.

Введение

EV-мембранные наночастицы, производимые почти всеми типами клеток. Для клеток млекопитающих, EV может подразделяться на две основные группы с отдельными производственными путями1,2. Мембранные пузырьки, с размером диапазоне от примерно 100-1000 Нм, производятся прямым отпочковываясь от клеточной мембраны. Exosomes, размером 30-200 Нм, являются производными от мультивезикулярных органов формируется внутрь почек в эндосомы, которые впоследствии сливаются с клеточной мембраны выпустить несколько Exosomes одновременно. Основной функцией этих пузырьков является транспортировка информации между клетками3. С этой целью грузы, такие как РНК, ДНК и белки, активно сортируются по ним. EV может передавать различные эффекты на их цели, что имеет последствия как для здоровья, так и для состояния болезни. С одной стороны, они опосредуют положительные эффекты, такие как регенерация тканей, Презентация антигена, или антибиотик эффекты, что делает их благоприятные цели для их развития, как терапевтика4,5. С другой стороны, электромобилей может способствовать васкуляризация опухоли6, индуцировать свидетеля эффекты в стрессовой реакции7, и может играть роль в аутоиммунных заболеваний8 и воспалительных заболеваний9. Таким образом, они могут быть ключевым компонентом для лучшего понимания многих патологических эффектов. Тем не менее, наличие измененных электромобилей в многочисленных заболеваний, таких как рак10,11,12 и сердечно-сосудистые расстройства13, и их легкая доступность в крови и моче делает их идеальными Биомаркеров. Наконец, их хорошая биосовместимость14 и их неотъемлемое целевое умение делают электромобилей также интересными для доставки лекарственных препаратов15. В этой рукописи мы описываем протокол для оценки стабильности хранения электромобилей, полученных из клеток млекопитающих, что является важным свойством, которое до сих пор мало исследовано.

Для клинического развития электромобилей, есть еще много препятствий, чтобы преодолеть16, в том числе оценки их терапевтического эффекта, производство, очистка, и хранение17. В то время как-80 ° c широко рассматривается как золотой стандарт для хранения EV18, необходимые морозильные камеры стоят дорого, и поддержание требуемой холодной цепочки от производства до пациента может быть сложной задачей. Более того, в некоторых отчетах указывается, что хранение при температуре-80 °c по-прежнему не оптимально сохраняет EV и вызывает потерю функциональности EV19,20. Другие методы, такие, как замораживание сушки21,22 или сушки спрей-23, были предложены в качестве потенциальной альтернативы замороженного хранения электромобилей.

Оптимальным способом оценки стабильности хранилища является тестирование электромобилей в функциональном тесте или оценка конкретного маркера, например, их антибактериальная активность19. Это возможно при том, что желаемый эффект пузырьков известен и когда необходимо изучить одну отдельную группу электромобилей. Если сравнивать EV из различных клеточных источников (например, для инкапсуляции лекарственных средств) или если нет какого-либо известного функционального считывания, то уже невозможно оценить изменения, которые были связаны с хранением данных в прямом порядке.

С другой стороны, просто оценка изменений в их физикохимических параметров, таких как размер, восстановление частиц, и концентрация белка, не всегда предсказывают изменения в активности EV, как это было показано в недавнем патенте20.

Здесь мы предоставляем легко применимый протокол для измерения стабильности хранения электромобилей путем оценки их физикохимических параметров в сочетании с активностью инкапсулированного фермента бета глюкуронидазы в качестве суррогата для груза электромобилей. Загрузка фермента осуществляется инкубацией сапонина, мягким методом, установленным с ЕДС из разных источников21,24,25. Сапонин образует переходные поры в мембране EV, что позволяет поглощение фермента в везикул. Поскольку ферменты подвержены потере активности при неблагоприятных условиях хранения, они являются идеальным суррогатом для оценки сохранности функциональных грузов электромобилей.

Мы показали, что применение этого протокола к электромобилей, полученных из человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК), человеческих пупочных клеток эндотелия Вены (HUVECs), и человеческий аденокарцинома альвеолярных эпителиоцитов (A549) действительно приводят к большим различиям в стабильность хранения между различными линиями клеток, которые должны быть приняты во внимание при выборе источника EV21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура клетки и продукция клетки-подготовленное средство

  1. Как правило, культивировать клетки в соответствии с индивидуальными условиями, необходимыми для соответствующей клеточной линии.
  2. Культивируйте клетки для 24-72 h в сыворотке-свободно условиях или в средстве содержа EV-обедненного фетальной сыворотке говядины (ФПС).
    Примечание: Если используется EV-обедненный ФПС, использовать метод доказано эффективно истощают сыворотки, чтобы предотвратить заражение с бычьей сыворотки, полученных электромобилей26.
  3. Соберите носитель из фляги. Центрифуга на 300 x g в течение 10 минут, чтобы гранулы клеток. Тщательно собирайте среду с ячейкой (СКК), не нарушая при этом клетки, находящиеся в грануете. Предпочтительно использовать СКК напрямую или хранить его на ночь при температуре 4 °C.
    Примечание: всегда предпочтительнее использовать свежепроизведенный СКК. Если хранение в течение более длительных периодов времени не может быть отменено, все соответствующие параметры должны регистрироваться в соответствии с MISEV2018 руководящими принципами26, а потенциальные предубеждения полученных результатов должны приниматься во внимание.
  4. Пример протокола для HUVECs
    1. Культивировать HUVEC клетки для 120 h в EGM-2 среды, содержащей ФПС и другие добавки.
    2. Культивировать HUVEC клетки для 48 h в EBM-2 базальной среде без каких-либо дополнительных добавок.
    3. Соберите средство из колб и выполните центрифугирования шаг, как указано выше (шаг 1,3). Как правило, использовать 100 мл среднего для одного EV-изоляция.

2. ультраконсервативная СКК

  1. Непосредственно перед ультраклеифугацией (UC), центрифуга СКК для 15 мин при 3 000 x g и 4 °c для удаления клеточного мусора и крупных агломератов.
  2. Аккуратно перенесите супернатант в трубы UC. При использовании фиксированного угла ротора, отметьте ориентацию труб в центрифуге для облегчения извлечения гранул EV после UC. Центрифуга для 2 ч на 120 000 х г, с k-фактором 259,4.
  3. После UC, осторожно Выбросьте супернатант с помощью серологического Pipet, чтобы избежать нарушения опепелений электромобилей.
    Примечание: гранулы могут быть невидимыми.
  4. Добавить 200 мкл 0,2 мкм-отфильтрованный фосфат-буферизованные физиологический раствор (PBS) в первую трубку и использовать PBS и остаточный супернатант для ресуспензируем гранул по пипетки вверх и вниз. Перенесите полученную подвеску EV в следующую трубку соответствующего образца и используйте ее для ресуспендирования. Продолжайте этот путь, чтобы ресуспензируем все EV образца в окончательном томе приблизительно 300-350 мкл.
  5. После ресуспендирования подтвердите наличие частиц путем отслеживания анализа наночастицы (ЗТК). Используйте параметры, оптимизированные для данного типа EV, такие как параметры ниже (Step 2.5.1).
    Примечание: документы Гардинер и др.27 и вестад et al.28 содержат ценную информацию о том, как оптимизировать параметры для измерения электромобилей.
    1. Для воспроизведения описанных ниже результатов используйте инструменты (например, Наноприцел LM14), оснащенные зеленым лазером. Запишите три видео 30-х с экрана усиления 1,0 и камеры уровня 13. Для анализа используйте увеличение экрана 1,0 и порог обнаружения 5.
  6. Используйте гранулы немедленно, если это возможно; в противном случае храните его при температуре 4 °C в одночасье.

3. в EV Инкапсуляция глюкуронидаза

  1. К ресуспендирован гранулы, добавить бета-глюкуронидазы (10 мг/мл в PBS) до конечной концентрации 1,5 мг/мл и сапонин (10 мг/мл в H2O) до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Хорошо перемешать по потряхивая для 3 с.
  2. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с внутрилегонько смешивания, осторожно стряхивая трубку. После инкубации, непосредственно очищают по размеру-исключение хроматографии (SEC) (см. раздел 5).
    Примечание: не следует замораживать образцы глюкуронидазы после оттаивания, чтобы предотвратить деградацию фермента из-за замораживания.

4. липосоме производства

  1. Для подготовки липосомы для сравнения с ЕДС, растворить 1, 2-димиристойил-СН-Г3-фосфолихолин (ДМПК) и 1, 2-дипальмитойл-СН-ггпо-3-ФОСФОЛИХОЛИН (dppc) в 2:3 молярной рацион в хлороформе до конечной концентрации 5 мм. Подготовьте 1 мл aliquототы в высокоисполнении жидких хроматографии (HPLC) флаконов и дайте им высохнуть на ночь, чтобы сформировать липидный фильм.
    Осторожно: хлороформ токсичен и подозревается в канцерогенными. Примите правильные меры предосторожности при обработке его.
  2. Увлажняет липидный фильм с 1 мл PBS, содержащей 1,5 мг/мл глюкуронидазы. Нагрейте его до 42 ° c и вихря в течение 1 мин. Нагрейте экструдер-сборку до 42 ° с и выдав липидный суспензию 11X через поликарбонатные мембраны 200 Нм. Непосредственно очистить SEC (см. раздел 5).

5. Очистка от SEC

  1. Подготовьте столбец SEC, используя следующий протокол.
    1. Используйте только свежую очищенную воду и свежеприготовленные буферы. Фильтровать все буферы через мембранный фильтр 0,2 мкм и дегазиовывать их, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в столбце.
    2. Для подготовки столбца SEC используйте матрицу на основе фильтрации геля агарозы (например, sepharose CL-2b) или другую среду SEC, подходящую для разделения электромобилей и липосомов от белковых примесей и избыточного фермента. Во-первых, удалите 20% решение этох среда хранится в, чтобы предотвратить формирование воздушного пузыря в колонке. С этой целью центрифуга SEC средних на 3 000 x g в течение 10 мин, удалите этох, и заменить его дегазированные воды.
    3. Заполните стеклянную колонну (с внутренним диаметром 10 мм) со средним SEC до отметки 15 мл.
      Примечание: объемы будут отличаться для столбцов с различными размерами. Убедитесь в том, чтобы гель урегулировать полностью.
    4. Перед тем как запустить, устанавливаются колонке, по крайней мере два столбца объемы PBS. Чтобы сохранить столбец, сначала промойте его одним столбца объемом воды, а затем по крайней мере два столбца томов 20% Этон. После хранения, мыть колонки сначала с одним объемом колонки воды до equilibrating с PBS.
    5. Используйте до 400 мкл EV или Липосома подвески в одном отделении. Соберите фракции 1 мл. После SEC, либо хранить очищенный EV (см. раздел 7) или при условии их глюкуронидазы анализа (см. раздел 6).
  2. Подтверждают разделение электромобилей и липосомы от загрязняющих белков и свободных глюкуронидазы. С этой целью коррелируют концентрации частиц собранных фракций с концентрацией белка и глюкуронидазы активности.
    1. Оценка концентрации частиц в ЗТК (см. 2,5)
    2. Оценить содержание белка по биинсулиновой кислоты (ДСС) анализ или другой подходящий белок анализа количественной оценки. Выполните анализ в соответствии с протоколом производителя.
    3. Оценить активность глюкуронидазы с помощью анализа глюкуронидазы (см. раздел 6).
  3. По желанию, оцените морфологию EV путем просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и сканирующей электронной микроскопии (РЭМ).
    1. Для подготовки образцов ТЕА добавьте 10 мкл суспензии EV в сетку ТЕА, Инкубируйте в течение 10 минут, а затем промокните лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Выполните фиксацию в течение 10 минут с 10 мкл 4% параформальдегида и пятно от любого избытка. Промыть 3x водой. Окрашивает пузырьки на 20-е годы инкубацией с 30 мкл 1% гидрата фосфорили-вольфстических кислот. После промокательной от избыточного, сухие везикулы на ночь. Визуализация по ТЕА.
      Осторожно: фосфорно-тунностическая кислота очень едкая; Таким образом, защищают кожу и глаза.
    2. Для Рэм, исправить ранее подготовленные образцы ТЕА на углеродных дисках и распыленную их с 50 Нм толстым слоем золота. Визуализация с помощью Сэм.

6. глюкуронидазы анализ

  1. Чтобы позволить сравнение между различными образцами и условиями хранения путем корреляции числа частиц и активности фермента, сначала измерить концентрацию частиц образца по ЗТК (см. шаг 2,5).
  2. Подготовить рабочее решение флуорессеин ди-b-D-глюкуронида путем добавления 1 мкл соединения (10 мг/мл в H2O) до 199 мкл PBS. Добавьте 25 мкл этого решения 125 мкл очищенных электромобилей, чтобы получить окончательную концентрацию 8,3 мкг/мл. Pipet образца в черном 96-хорошо пластины. Измерение точки времени 0 ч с читателем пластины, используя 480 Нм, как возбуждение и 516 Нм, как излучение длины волны.
  3. Плотно накройте пластину (например, прозрачной пластиковой фольгой, используемой для использования пластин), чтобы минимизировать испарение и инкубировать в темноте 18 ч при температуре 37 °C. Измерьте производство флюорессеин с помощью параметров считывателя плит, перечисленных в шаге 6,2.

7. хранение электромобилей и липосомы

Примечание: для всех целей хранения целесообразно использовать низкосвязные трубы для уменьшения потерь EV из-за адсорбции.

  1. Выполните следующие параметры этого раздела, чтобы воспроизвести приведенные ниже результаты репрезентативного. Используйте образцы, состоящие из 400 мкл подвески EV.
    1. Храните при температуре 4 °C или-80 ° c или переходите к шагам, перечисленным ниже.
    2. Лиофилизировать электромобилей.
      1. Добавьте trehalose (40 mg/mL в H2O) до окончательной концентрации 4 мг/мл до очищенных электромобилей. Замораживание образцов при-80 ° c, по крайней мере 1 ч.
      2. Лиофилизировать образцы, используя следующие параметры. Для основной сушки установите температуру шельфа до 15 °C и давление до 0,180 mbar и оставьте образцы для просушки на 46 ч. Для окончательного сушки установите температуру полки до 25 °C и давление до 0,0035 mbar и оставьте образцы для просушки на 2 ч. Храните лиофилизированные пробы при температуре 4 °C.
      3. Для увлажнения образцов добавьте H2O, равный количеству СУСПЕНЗИИ EV, присутствующих в начале (обычно, 400 мкл). Не используйте буфер для регидратации.

8. анализ после хранения

  1. Чтобы оценить активность фермента, сначала удалите свободную глюкуронидазу, которая, возможно, просочилась из электромобилей во время хранения. Достижение этого путем дополнительного этапа очистки, который осуществляется либо SEC (см. шаг 5) или асимметричный поток полевая фракционирование потока (AF4) (см. шаг 8.1.2).
    Примечание: пожалуйста, имейте в виду, что оба метода приводят к разбавления образца EV; Таким образом, используйте достаточные концентрации EV перед хранением, чтобы избежать перехода ниже предела кванта. Ожидайте 1:10 разбавления частиц из-за SEC или AF4.
    1. Для очистки SEC следуйте описанным выше протоколу (см. раздел 5).
    2. Выполните очистку AF4.
      1. Настройка прибора с помощью небольшого канала с 350 мкм прокладки и 30 КД молекулярной весовой мембраны целлюлозы. Поместите фильтр размера поры 0,1 мкм между насосом HPLC и каналом AF4. Использование свежеприготовленных 0,1 мкм-фильтруется PBS в качестве мобильной фазы для уменьшения нагрузки частиц и шума в Светорассеивающая детекторов.
      2. Обнаружение белков с помощью УФ-детектора, установленного на 280 Нм. Для обнаружения частиц используйте Многоугольный рассеяние света с лазерным набором до 658 Нм.
      3. Используйте следующий метод запуска. Предварительное Фокусируйтесь на 1 мин с фокусом потока 1 мл/мин; затем впрыснуть 300 мкл образца в размере 0,2 мл/мин и сохранить фокус потока в течение 10 мин. После инъекции, при применении поперечных потоков, которые уменьшаются с 2 мл/мин до 0,1 мл/мин в течение 8 мин. элюировать в течение еще 10 мин без поперечных потоков. Соберите доли 1 мл, начиная после 12,5 мин и продолжается до 27 мин.
    3. Выполните анализ глюкуронидазы, описанный выше (см. раздел 6).
  2. Чтобы оценить размер и концентрацию, используйте ЗТК, как описано выше (см. шаг 2,5).
  3. По желанию выполняйте ТЕА и Рэм для оценки морфологии электромобилей после хранения (см. 5,3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 отображаются характеристики хранилища электромобилей, изолированные от huvecs. Электромобилей были изолированы от UC, глюкуронидаза был инкапсулирован, и после SEC, очищенных электромобилей были оценены по их физикохимических свойств ЗТК. Затем образец пузырьков был подвергнут очистке AF4 и была измерена активность глюкуронидазы.

Пузырьки затем хранились в течение 7 г при температуре 4 ° c или-80 ° с и при 4 ° с в лиофилизированную форму, в последнем случае с доба...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой рукописи мы представляем всеобъемлющий протокол для изучения стабильности электромобилей при различных условиях хранения. При сочетании инкапсулированной глюкуронидазы в качестве функционального считывания и оценки физикохимических параметров электромобилей, протокол позволяет для простой оценки стабильности хранения электромобилей и сравнение электромобилей из различных клеточных Линии. Рэм и ТЕА в качестве дополняющих методов позволяют заглянуть в изменения электромобилей на уровне одной частицы. Представленные ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

В рамках этой работы была поддержана программа исследований в области Нанпофутур, проводимая федеральным министерством образования и научных исследований Германии (номер гранта 13XP5029A). Максимилиан Рихтер был поддержан Студенистифтунг де Дойшен Волькес (немецкий академический Стипендиальный фонд) через стипендию кандидата наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,2 димиристоил-sn глицеро-3-фосфо-холин (DMPC)Sigma-AldrichP2663-25MG
1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-холин (DPPC)Sigma-AldrichP4329-25MG
225 см² колбы для клеточных культурCorning431082Используется с 25 мл среды
30 кДа регенерированной целлюлозной мембраныWyatt Technology Europe1854
350 &микро; m спейсерWyatt Technology Europe
Автоматизированный сборщик фракцийThermo Fisher Scientific
Бета-глюкуронидазаSigma-AldrichG7646-100KU
ХлороформFisher scientificC/4966/17
Колонная печьHitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Трегалоза дигидратSigma-AldrichT9531-10G
DAWN HELEOS II, Многоугольный детектор рассеяния света  Wyatt Technology Europe
Durapore Мембранный фильтр, PVDF,  0,1  &микро; м, 47  ммMerckVVLP04700Используется для приготовления буферов для AF4
EBM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3156Базальная среда для роста эндотелиальных клеток, используемая для бессывороточной культуры клеток HUVEC
Eclipse dualtecWyatt Technology Europe
EGM-2Lonza Verviers, S.p.r.CC-3162Среда для роста эндотелиальных клеток, используемая для нормальной культивирования клеток HUVEC
ELISA Plate SealersR& D SystemsDY992используется для герметизации 96-луночных планшетов для анализа на глюкуронидазу
ЭтанолFisher scientificE/0665DF/17
Набор экструдеров с держателем/нагревательным блокомAvanti Polar Lipids610000-1EA
Поддержка фильтраAvanti Polar Lipids610014-1EAиспользуется для препарата липосом
Флуоресцеин ди-&бета;-D-глюкоронидThermo Fisher ScientificF2915
Gibco PBS-таблетки+CA10:F36Thermo Fisher Scientific18912014
Hettich Universal 320 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGИспользуется для гранулирования ячеек по 300 г
Hettich Rotina 420 RAndreas Hettich GmbH & Co.KGИспользуется для гранулирования более крупного мусора по 3000 г
Элементы HUVECLonza Verviers, S.p.r.C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CMKimble420401-1030
Лиофилизатор ALPHA 2-4 LSCХристос
Микроцентрифужные трубки, полипропиленVWR international525-0255трубки, используемые для всех EV-обращений, признаны более благоприятными, чем аналогичные продукты других поставщиков в отношении восстановления частиц
Nanosight LM14 оснащен зеленым лазеромMalvern Pananalytical
Nanosight-программное обеспечение версии 3.1Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 нм трассовые поликарбонатные мембраныWhatman/GE Healthcare110406используется для подготовки липосом
PEEK Inline filter holderWyatt Technology Europe
Fogphotungstic acidhydrate Sigma-Aldrich79690-25G
Поликарбонатные флаконы для ультрацентрифугированияBeckman Coulter355622
QuantiPro BCA Assay KitSigma-AldrichQPBCA-1KT
SaponinSigma-Aldrich47036
Сканирующая электронная микроскопия Zeiss EVO HD 15Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2bGE Healthcare17014001
SEM медь сетки с углеродной пленкойPlanoS160-4
Small AF4 channelWyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ESQuorum Technologies
Просвечивающая электронная микроскопия JEOL JEM 2011Oxford Instruments
Type 45 Ti ультрацентрифугирующий роторBeckman Coulter339160
Ultimate 3000 Автосамплер DionexThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Изократический насос DionexThermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Вакуумный дегазатор онлайн DionexThermo Fisher Scientific
OptimaTM L-90 K BeckmanCoulter
УФ-детекторThermo Fisher Scientific
Ватман 0.2 & микро; m размер пор фильтр из смешанной целлюлозыWhatman/GE Healthcare10401712Используется для фильтрации всех буферов, используемых с EV и в SEC
Ультрацентрифуга

Ссылки

  1. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
  2. Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
  3. Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
  4. György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
  5. Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
  6. Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450(2017).
  7. Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746(2017).
  8. Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
  9. Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356(2014).
  10. Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
  11. Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
  12. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
  13. Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259(2017).
  14. Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).
  15. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, Part A 148-156 (2016).
  16. Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
  17. Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190(2017).
  18. Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).
  19. Lőrincz, ÁM., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465(2014).
  20. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , Beverly Hills, CA. WO/2016/090183 (2016).
  21. Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377(2018).
  22. Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
  23. Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
  24. Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
  25. Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
  26. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  27. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671(2013).
  28. Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).
  29. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162(2016).
  30. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
  31. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).
  32. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  33. Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
  34. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  35. Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
  36. Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).
  37. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Асимметричное потоковое фракционированиеэксклюзионная хроматографияинкапсуляция бета-глюкуронидазыанализ траекторий наночастицпросвечивающая электронная микроскопияпротокол лиофилизациианализ ферментативной активностиизмерение степени извлечения частиц
Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.