Здесь мы представляем легко применимый протокол для оценки стабильности хранения внеклеточных пузырьков, группы естественных наночастиц, производимых клетками. Пузырьки загружаются с глюкуронидазы в качестве модели фермента и хранятся в различных условиях. После хранения оцениваются их Физикохимические параметры и активность инкапсулированных ферментов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка стабильности хранения внеклеточного везикулы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Внеклеточные пузырьки (EV) являются перспективными целями в текущих исследованиях, которые будут использоваться в качестве препаратов, носителей наркотиков и биомаркеров. Для их клинического развития важно не только их фармацевтическая деятельность, но и их производство должно быть оценено. В этом контексте исследования сфокусированы на изолированности электромобилей, их характеризации и хранении. Цель данной рукописи заключается в обеспечении поверхностной процедуры оценки влияния различных условий хранения на ЕДС без генетической манипуляции или специфических функциональных анализов. Это дает возможность быстро получить первое впечатление о стабильности электромобилей в условиях данного хранилища, а у электромобилей, полученных из разных источников, можно легко сравнить. Измерение устойчивости основано на физикохимических параметрах (размер, концентрация частиц и морфология) и сохранении активности их груза. Последний оценивается сапонин-опосредованной инкапсуляции фермента бета-глюкуронидазы в EV. Глюкуронидазы выступает в качестве суррогатной и позволяет легко квантификации через расщепление флуоресцентной молекулы репортера. Настоящий Протокол может быть инструментом для исследователей в поисках условий хранения, которые оптимально сохраняют свойства EV для продвижения исследований EV к клиническому применению.
Введение
EV-мембранные наночастицы, производимые почти всеми типами клеток. Для клеток млекопитающих, EV может подразделяться на две основные группы с отдельными производственными путями1,2. Мембранные пузырьки, с размером диапазоне от примерно 100-1000 Нм, производятся прямым отпочковываясь от клеточной мембраны. Exosomes, размером 30-200 Нм, являются производными от мультивезикулярных органов формируется внутрь почек в эндосомы, которые впоследствии сливаются с клеточной мембраны выпустить несколько Exosomes одновременно. Основной функцией этих пузырьков является транспортировка информации между клетками
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культура клетки и продукция клетки-подготовленное средство
- Как правило, культивировать клетки в соответствии с индивидуальными условиями, необходимыми для соответствующей клеточной линии.
- Культивируйте клетки для 24-72 h в сыворотке-свободно условиях или в средстве содержа EV-обедненного фетальной сыворотке говядины (ФПС).
Примечание: Если используется EV-обедненный ФПС, использовать метод доказано эффективно истощают сыворотки, чтобы предотвратить заражение с бычьей сыворотки, полученных электромобилей26. - Соберите носитель из фляги. Центрифуга на 300 x g в течение 10 минут, чтобы гранулы клеток. Тща....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 отображаются характеристики хранилища электромобилей, изолированные от huvecs. Электромобилей были изолированы от UC, глюкуронидаза был инкапсулирован, и после SEC, очищенных электромобилей были оценены по их физикохимических свойств ЗТК. Затем образец пузырьков был подвергнут очистке AF4 и была измерена активность глюкуронидазы.
Пузырьки затем хранились в течение 7 г при температуре 4 ° c или-80 ° с и при 4 ° с в лиофилизированную форму, в последнем случае с доба.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой рукописи мы представляем всеобъемлющий протокол для изучения стабильности электромобилей при различных условиях хранения. При сочетании инкапсулированной глюкуронидазы в качестве функционального считывания и оценки физикохимических параметров электромобилей, протокол позволяет для простой оценки стабильности хранения электромобилей и сравнение электромобилей из различных клеточных Линии. Рэм и ТЕА в качестве дополняющих методов позволяют заглянуть в изменения электромобилей на уровне одной частицы. Представленные .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
В рамках этой работы была поддержана программа исследований в области Нанпофутур, проводимая федеральным министерством образования и научных исследований Германии (номер гранта 13XP5029A). Максимилиан Рихтер был поддержан Студенистифтунг де Дойшен Волькес (немецкий академический Стипендиальный фонд) через стипендию кандидата наук.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,2 димиристоил-sn глицеро-3-фосфо-холин (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфо-холин (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 см² колбы для клеточных культур | Corning | 431082 | Используется с 25 мл среды |
| 30 кДа регенерированной целлюлозной мембраны | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 &микро; m спейсер | Wyatt Technology Europe | ||
| Автоматизированный сборщик фракций | Thermo Fisher Scientific | ||
| Бета-глюкуронидаза | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Хлороформ | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Колонная печь | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Трегалоза дигидрат | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Многоугольный детектор рассеяния света | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Мембранный фильтр, PVDF, 0,1 &микро; м, 47 мм | Merck | VVLP04700 | Используется для приготовления буферов для AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Базальная среда для роста эндотелиальных клеток, используемая для бессывороточной культуры клеток HUVEC |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Среда для роста эндотелиальных клеток, используемая для нормальной культивирования клеток HUVEC |
| ELISA Plate Sealers | R& D Systems | DY992 | используется для герметизации 96-луночных планшетов для анализа на глюкуронидазу |
| Этанол | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Набор экструдеров с держателем/нагревательным блоком | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Поддержка фильтра | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | используется для препарата липосом |
| Флуоресцеин ди-&бета;-D-глюкоронид | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-таблетки+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Используется для гранулирования ячеек по 300 г | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Используется для гранулирования более крупного мусора по 3000 г | |
| Элементы HUVEC | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Лиофилизатор ALPHA 2-4 LSC | Христос | ||
| Микроцентрифужные трубки, полипропилен | VWR international | 525-0255 | трубки, используемые для всех EV-обращений, признаны более благоприятными, чем аналогичные продукты других поставщиков в отношении восстановления частиц |
| Nanosight LM14 оснащен зеленым лазером | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-программное обеспечение версии 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 нм трассовые поликарбонатные мембраны | Whatman/GE Healthcare | 110406 | используется для подготовки липосом |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Fogphotungstic acid | hydrate Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Поликарбонатные флаконы для ультрацентрифугирования | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Сканирующая электронная микроскопия Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM медь сетки с углеродной пленкой | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Просвечивающая электронная микроскопия JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ультрацентрифугирующий ротор | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Автосамплер Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Изократический насос Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Вакуумный дегазатор онлайн Dionex | Thermo Fisher Scientific | ||
| OptimaTM L-90 K Beckman | Coulter | ||
| УФ-детектор | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ватман 0.2 & микро; m размер пор фильтр из смешанной целлюлозы | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Используется для фильтрации всех буферов, используемых с EV и в SEC |
Ссылки
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, Part B 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug t....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
