Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59593

⸱

5 сентября 2019 г.

 , 
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод использования многопараметрического потока цитометрии для обнаружения митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS) в мурин здоровых гематопоиетических стволовых и прародителей клеток (HSPCs) и лейкозных клеток из мышиной модели острого миелоидного лейкоза (AML) обусловлен MLL-AF9.

Аннотация

Мы представляем циклометрический подход потока для анализа митохондриального ROS в различных живых костных мозгах (БМ) полученных стволовых и прародителей клеток населения от здоровых мышей, а также мышей с AML обусловлен MLL-AF9. В частности, мы описываем двухступенчатый процесс окрашивания клеток, в котором здоровые или лейкозные клетки БМ сначала окрашиваются флюорогенным красителем, который обнаруживает митохондриальные супероксиды, а затем окрашивает с флюрохром-связанных моноклональных антител, которые используются различать различные здоровые и злокачественные популяции гематопоиетических прародителей. Мы также предоставляем стратегию для приобретения и анализа образцов с помощью цитометрии потока. Весь протокол может быть выполнен в срок, как короткие, как 3-4 ч. Мы также подчеркиваем ключевые переменные, которые следует учитывать, а также преимущества и ограничения мониторинга производства ROS в митохондриальном отсеке живой гематопоитической и лейкозной стеблей и субпопуляций гененора с использованием флюорогенных красителей при цитометрии потока . Кроме того, мы представляем данные о том, что митохондриальные ROS изобилие варьируется между различными здоровыми HSPC субпопуляций и лейкемии прародителей и обсудить возможные применения этой техники в гематологических исследований.

Введение

Реактивные виды кислорода (ROS) являются высокореактивными молекулами, полученными из молекулярного кислорода. Наиболее четко определенным клеточным расположением производства ROS являются митохондрии, где электроны, проходящие через цепочку транспортировки электронов (ETC) во время окислительного фосфорилирования (OXPHOS), поглощаются молекулярным кислородом, ведущим к образованию специфического тип ROS называетсясупероксиды 1. Благодаря действиям ряда ферментов, называемых супероксидными дисмутазами или СОД, супероксиды преобразуются в перекиси водорода, которые впоследствии нейтрализуются в воду такими ферментами, как каталаза или глутатион пероксидаза (GPX). Возмущения в механизмах РОСрегулирования могут привести к избыточному производству ROS, часто называемого окислительным стрессом, которые имеют вредные и потенциально смертельные клеточные последствия, такие как повреждение макромолекулы (т.е. ДНК, белок, липиды). Кроме того, окислительный стресс связан с несколькими патологиями, такими как диабет, воспалительные заболевания, старение и опухоли2,3,4. Для поддержания редокс гомеостаза и предотвращения окислительного стресса, клетки обладают различными механизмами, регулирующими СЕБЯ5.

Физиологические уровни некоторых ROS необходимы для правильного эмбрионального и взрослого гематопоезии6. Однако избыток ROS связан с повреждением ДНК, клеточной дифференциацией и истощением гематопоиетического стебля и бассейна-прародителя. Существует также доказательство того, что изменения в биологии Redox могут отличаться между лейкемией и здоровыми клетками. Например, уровни ROS, как правило, выше в острой миелоидной лейкемии (AML) клетки по сравнению с их здоровыми коллегами и другие исследования показали, что лейкемия стволовые клетки поддерживать низкий устойчивый уровень ROS для выживания7,8. Важно отметить, что стратегии терапевтической капитализации на этих различиях Redox показали обещание в нескольких условиях рака человека9,10. Таким образом, анализы, которые позволяют оценить уровни ROS в моделях мышей, могут улучшить наше понимание того, как эти виды способствуют клеточной физиологии и патогенеза заболеваний, а также потенциально обеспечивают платформу для оценки эффективности новые редокс-таргетинга противораковой терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры для животных, описанные в этом протоколе, были одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в онкологическом центре Фокс Чейз.

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс протокола делится на 4 части, представленные на рисунке 1, и необходимые реагенты перечислены в таблице материалов.

1. Изоляция костного мозга (БМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: MLL-AF9 лейкемии мышей были созданы, как описано ранее11.

  1. Восстановление моноядерных клеток костного мозга, как описано ранее12,13,14,15, от диких мышей типа C57.Bl6 (которые выражают CD45.2 конгенический маркер), а также от C57. Bl6-SJL мышей (которые выражают CD45.1 конгенический маркер), которые были пересажены с MLL-AF9-выражения лейкозных клеток (CD45.2)).
    ПРИМЕЧАНИЕ: БМ может быть извлечена из мышей либо путем дробления12,13 или промывки костей14,15. Для экспериментов, представленных здесь, БМ был извлечен из здоровых и лейкозных мышей с помощью промывки.

2. Митохондриальный ROS фторгенный краситель окрашивания

  1. После того, как моноядерные клетки костного мозга были извлечены из здоровых и / или лейкемии мышей, пятно аликот клеток с Trypan Blue и рассчитывать с помощью гемоцитометра, чтобы определить начальное число общих клеток БМ.
  2. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в F-PBS (PBS дополнены 2% плода бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина коктейль) в концентрации 2 х 106 клеток / мл.
  3. Aliquot 200 л клеточной подвески на трубку в 9 одноцветных контрольных трубах с пометкой следующим образом:
    Нет пятна, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (только для здоровых HSPCs), CD45.2-APC (только для клеток лейкемии), CD34-FITC, Митохондриальный ROS dye и Live / мертвые пятна клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Положительный контроль для индукции митохондриального ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 105 клеток в 200 ЗЛ с 20 МКм Менадион натрия Бисульфит (MSB) для 1 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 инкубатора. Второй контроль, чтобы обратить вспять MSB-опосредованного индукции митохондриальной ROS может быть подготовлен путем лечения 2 х 105 клеток в 200 QL с 20 МКм МСБ плюс 100 ММ N-ацетил-L-цистеин (NAC) для 1 ч при 37 кв С в 5% CO2 инкубатора.
  4. Aliquot оставшиеся клетки в трубке (экспериментальная трубка) и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин.
  5. Resuspend клетки в F-PBS с живым / мертвым пятном клетки в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать на льду в течение 30 мин. Не забудьте добавить живое/ мертвое пятно в одноцветную трубку управления.
  6. Добавьте 1,0 мл комнатной температуры (RT) F-PBS как к одноцветным, так и к экспериментальным трубам, окрашенным живым/мертвым красителями. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
  7. Отрежь 50 мкг митохондриального красителя ROS в 13 л диметилсулькоксида (DMSO) для получения раствора запаса 5 мм.
  8. Разбавить митохондриальный краситель ROS до конечной концентрации 5 мкм в РТ F-PBS с верапамилом или без него (50 мкм).
  9. Аспирируй от мытья живого/ мертвого пятна клетки. Добавьте 200 зЛ митохондриального красителя ROS, содержащего верапамил, к каждой экспериментальной трубке, а также митохондриальную трубку управления красителем ROS.
  10. Вихрь смешать и инкубировать в течение 10 минут при 37 градусов по Цельсию в темноте.
  11. Добавьте 1,0 мл RT F-PBS в митохондриальные росцветные одноцветные элементы управления и экспериментальные трубки. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.
  12. Отпрыгивайте супернатант и промойте клетки дополнительными 1,0 мл RT F-PBS. Центрифуга 5 мин при 300 х г на RT.

3. Линия Антитела Запятнание

  1. Подготовка антител коктейли, перечисленные в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела коктейли были оптимизированы ранее14,15,16.
  2. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих здоровые БМ и добавить 200 л антитела коктейль #1 к каждой трубке. Вихрь смешать. Также подготовьте одноцветные контрольные трубки. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
  3. Аспирировать супернатант из окончательного митохондриального ROS красителя мыть экспериментальных труб, содержащих лейкемия БМ и добавить 200 л антитела коктейль #2 к каждой трубке. Вихрь смешать. Инкубировать в течение 60 минут на льду в темноте.
  4. Вымойте 1,0 мл холодного F-PBS и центрифугу 5 мин при 300 х г на RT.
  5. Resuspend клетки в 500 л холодных F-PBS и фильтровать клетки в потоке цитометр трубки с помощью фильтра 40 мкм, чтобы исключить агрегаты.

4. Поток Цитометрии Приобретение и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько гематопоитических стволовых и прародителей подмножества редки, такие как долгосрочные гематопоиэтитические стволовые клетки. Таким образом, в идеале 3-5 миллионов событий должны быть собраны для каждой экспериментальной трубки во время приобретения цитометрии потока для достаточного анализа митохондриального ROS в различных подмножествах HSPC.

  1. Используйте трубку управления без пятен, чтобы установить вперед (FSC-A) и боковые (SSC-A) рассеивания участков в зависимости от размера и сложности проанализированных популяций клеток.
  2. Используйте без пятна и одноцветные трубки управления, чтобы компенсировать поток цитометра.
  3. Выстрывайте посторонний мусор с переднего и бокового рассеяния(рисунок 2A,B, первая панель слева).
  4. Ворота из дублетов с помощью двойного дискриминационного, таких как передний дискриминационный(Рисунок 2A, B, вторая панель слева).
  5. Следуйте стратегии gating, предложенной на рисунке 2A,B, чтобы выбрать живые клетки, линии низких клеток и различных подмножества HSPC и лейкемии.
  6. Для каждой группы, интересуемая, проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (МФИ) канала TRPE (x-оси) в гистограммном графике для оценки различий в сигнале митохондриального ROS(рисунок 3A-C, левые панели). Уровни митохондриального ROS можно оценить на одноклеточном уровне, сравнив митохондриальные окрашивания ROS с конкретными маркерами линии в участке рассеяния.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представлен метод анализа ROS в митохондриях нескольких здоровых и MLL-AF9-выражения популяций декариата. Рисунок 1 отображает схематическое представление рабочего процесса протокола, которое состоит из 4 основных шагов: 1) изоляция БМ от мышей; 2) Окрашивание бМ клеток с флуорогенным красителем, который распознает митохондриальный ROS, особенно супероксиды; 3) Поверхностный маркер антитела окрашивания, чтобы разграничить различные здоровые и лейкемии гематопоитических популяций; и 4) Приобр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Флюорогенные красители, которые были разработаны для обнаружения ROS часто оцениваются в фиксированных клетках с помощью микроскопии или в живых клетках цитометрии потока22. Поток цитометрической оценки митохондриального ROS в клетках БМ с использованием митохондриальных рвов ROS фторгенных имеет два основных преимущества: 1) Это быстрый и простой метод, который подходит для анализа живых клеток и 2) он позволяет различать и анализировать редкие населения на одноклеточном уровне в БМ с использован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фокс Чейз онкологический центр совета директоров (DDM), Американское общество гематологии Стипендиат премии (SMS), Американское онкологическое общество RSG (SMS) и Министерство обороны (Награда: W81XWH-18-1-0472).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Термоинактивированный FBSVWR Seradigm LIFE SCIENCE97068-085Медиа
Пенициллин стрептомицинCorning30-002-CIМедиа
PBSFisher ScientificBP399-20Буфер
15 мл коническая трубкаBD falcon352096Tissue Culture Supplies
50 мл коническая трубкаBDfalcon 352098ткани Принадлежности для культуры
40 μ m клеточные фильтрыFisher Scientific22-363-547Материалы для культуры тканей
RBC Лизис буферFisher Scientific50-112-9751Материалы для культуры тканей
Менадион натрия бисульфитSigma aldrichM5750Прооксидант
NACSigma aldrichA7250Антиоксидант
CD3 PE-Cy5 клон 145-2c11Biolegend100310антитело
Клон CD4 PE-Cy5 RM4-5eBioscience15-0041-81Антитело
CD8 Клон PE-Cy5 53-6.7eBioscience15-0081-81Антитело
CD19 PE-Cy5 клон 6D5Biolegend115510Антитело
B220 PE-Cy5 клон RA3-6B2Biolegend103210Антитело
Gr1 PE-Cy5 клон RB6-8C5Biolegend108410Антитело
Клон Ter119 PE-Cy5 Ter-119Biolegend116210Антитело
CD48 PE-Cy5 клон HM48-1Biolegend103420Антитело
CD117  Клон APC-Cy7 2B8Biolegend105825Антитело
Sca1 peacific Blue клон D7Biolegend108120Антитело
CD150 Клон APC TC15-12F12.2Biolegend115909Антитело
CD34 Клон FITC RAM34BD Bioscience553733Антитело
CD45.2 Клон APC 104Biolegend1098313Антитело
MitoSOX КрасныйThermoFisher ScientificM36008Краситель
Mitotracker ЗеленыйThermoFisher ScientificM7514Краситель
живой/мертвый желтыйКраситель ThermoFisher ScientificL34967Краситель

Ссылки

  1. Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
  2. Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
  3. Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
  4. Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
  5. Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899(2018).
  6. Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
  7. Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
  8. Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
  9. Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
  10. Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
  11. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  12. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  13. Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
  14. Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
  15. Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
  16. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776(2008).
  17. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  18. Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
  19. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  20. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  21. Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
  22. Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
  23. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  24. Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
  25. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  26. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  27. Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
  28. Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.