Методическая статья

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

DOI:

10.3791/59624

⸱

25 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем подход к очищению рибосомы связанных мРНК от сосудистых эндотелиальных клеток (ECs) непосредственно в мозге мыши, легких и тканей сердца через EC-специфический генетический тег расширенного зеленого белка флуоресценции (EGFP) в рибосомы в сочетании с РНК очистки .

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие исследования были ограничены использованием in vitro клеточных анализов и целых тканей или изоляции конкретных типов клеток от животных для анализа в пробирке транскриптома и экспрессии генов qPCR и секвенирования РНК. Всеобъемлющий анализ транскриптома и экспрессии генов конкретных типов клеток в сложных тканях и органах будет иметь решающее значение для понимания клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых регулируются гены, и их связь с гомеостазом тканей и органов Функции. В этой статье мы демонстрируем методологию изоляции рибосомной РНК непосредственно в виво в сосудистой эндофилии легких животных в качестве примера. Будут описаны конкретные материалы и процедуры для обработки тканей и очистки РНК, включая оценку качества и урожайности РНК, а также в режиме реального времени qPCR для атериогенных анализов генов. Этот подход, известный как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техники, могут быть использованы для характеристики экспрессии генов и транскриптома анализа некоторых типов клеток непосредственно in vivo в любом конкретном типе в сложных тканях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В сложных тканях, таких как мозг млекопитающих, сердце и легкие, высокий уровень клеточной неоднородности усложняет анализ данных экспрессии генов, полученных из образцов целых тканей. Для наблюдения за профилями экспрессии генов в определенном типе клеток in vivo недавно была разработана новая методология, которая позволяет дополнить весь переведенный мРНК любого генетически определенного типа клеток. Эта методология известна как перевод рибосомы сродства очистки (TRAP) техника1,2. Это полезный инструмент для изучения эндотелиальной клеточной биологии и ангиогенеза в сочетании с генетически манипулирования другими ангиогенез-связанных генов у животных.

Мы показали, что ангиогенные PKD-1 сигнализации и транскрипции ангиогенного гена CD36 имеют решающее значение для эндотелиальной клеточной (EC) дифференциации и функционального ангиогенеза3,4,5,6. Для определения молекулярных механизмов ангиогенной и метаболической сигнализации в транскрипции генов и трансдифференцации ЕС мы создали генетически модифицированных тэктмы с специально удаленными ангиогенными генами на основе метода TRAP1 , 2. Кроме того, у наших животных TRAP, не только они имеют pkd-1 или cd36 дефицит генов в сосудистой эндактелии или глобального удаления гена CD36, но расширенный зеленый белок флуоресценции (EGFP) также генетически помечены на ЕК переводит рибосомы. TRAP позволяет очистки сродства рибосомы связаны мРНК непосредственно из сосудистой эндофелии целевых тканей, что позволяет анализ экспрессии генов и идентификации новых транскриптомов, которые связаны с дифференциацией ЕС и ангиогенез непосредственно под in vivo условиях. Мы успешно выделили рибосомную РНК из эндотелии у этих генетически модифицированных животных. Очищенная РНК может быть использована для дальнейшей характеристики ангиогенных или артериогенных генов в регуляции дифференциации и функций ЕС. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по внедрению подхода TRAP для изоляции мРНК в ECs непосредственно in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для экспериментов на животных, все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным Комитетом по уходу за животными и использованию Медицинского колледжа Висконсина.

1. Подготовка реагентов

  1. Приготовьте буфер лизиса к концентрациям 10 мМ HEPES, pH 7.4, 150 mM KCl, 5 мМ MgCl2, 0,5 мм DTT, 100 мг/мл циклогексидида, ингибиторы протеазы и рекомбинантные ингибиторы RNase к концентрациям, описанным ниже.
    1. Добавить следующие реагенты до 500 мл безr деионизированной воды: 1,19 г HEPES, 5,59 г KCl, 0,24 г MgCl2, 35 мг DTT, 0,5 мл циклогексидида и NaOH по мере необходимости до pH 7.4, ингибиторы протеазы без EDTA (одна мини-таблетка на 10 мл) и ингибитор RNase (1 0 л/мл).
    2. Хранить в холодильнике 4 градусов по Цельсию до 1 месяца.
  2. Подготовьте буфер высокосолевого полисома для концентрации 10 мМ HEPES, pH 7.4,350 mM KCl, 5 мМ MgCl 2, 1% vol/vol CA-630, 0.5 m DTT и 100 мг/мл циклогексидида.
    1. Добавьте следующие реагенты до 500 мл безрячной деионизированной воды: 1,19 г HEPES, 13,05 г КЛ, 0,24 г MgCl2, 5 мл необезвительного моющего средства, 5 из 7,7 мг труб ОкТ и 0,5 мл цикофсихи, и 7.
    2. Хранить в холодильнике в 4 градуса на срок до 1 месяца.
  3. Привязать антитела против GFP к магнитным бусинкам Protein G до начала эксперимента.
    1. Добавьте 10 мг анти-GFP антитела, разбавленного в 200 мл PBS в бусы протеина G.
    2. Инкубировать с концом над концом вращения в течение 10 минут при комнатной температуре.
    3. Поместите бисер на магнитную стойку и снимите супернатант.
    4. Приостановить бисер в 200 мл PBS и хранить в холодильнике 4 кС на срок до 1 недели.
  4. Подготовка ледяной PBS с 100 мг /мл циклогексидида.
    1. Добавьте 1 том раствора циклогексида (100 мг/мл) к 99 объемам ледяного PBS.

2. Изолировать и лизировать желаемые ткани

  1. Эвтаназия мышей путем инъекций IP кетамина (500 мг/кг/вес тела) и ксилазина (10 мг/кг/масса тела) и изолировать желаемые ткани (т.е. сердце, легкие). Немедленно переходите к следующему шагу.
  2. Поместите желаемые ткани в 500 мл ледяного PBS с 100 мг/мл циклогексидида.
  3. Ткань фарша в клеточную подвеску с мотором-управляемым гомогенизатором или гомогенизатором стекла с небольшой очисткой. При использовании мотор-управляемого гомогенизатора, ограничьте гомогенизацию менее чем 1 минутой при низкой частоте (15 000 Гц), чтобы избежать денатурации РНК.
  4. Приостановить клеточные гранулы в 200 мл буфера из лисиса путем pipetting и перерисовки буфера несколько раз. Дальнейшее гомогенизировать клеточную подвеску 10 штрихами в гомогенизаторе с небольшим разрешением или в течение 15 секунд при низкой частоте (15 000 Гц) в моторном гомогенизаторе.
  5. Центрифуга гомогенаты в течение 10 мин при 2000 х г при 4 градусах Цельсия для ядер гранул и большого мусора клетки, и держать супернатант.
  6. Добавьте неионическое, неденатурное моющее средство до 1% вольт/вольт и DHPC до 30 мМ к супернатанту. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
  7. Центрифуге лизат в течение 10 мин при 16000 х г, чтобы гранулировать нерастворимый материал. Передача и сохранение 15% четкого lysate в качестве ввода для будущих шагов.

3. Комплексы изолировать рибосому/мРНК

  1. Добавьте 50 мл бусин, связанных с антителами, в клеточный лисат и инкубацию смеси при 4 градусах Цельсия с конечным вращением в течение 30 минут. Это где антитела против GFP свяжет GFP-тегами рибосомы, что позволяет нам еще больше изолировать РНК от этих рибосом.
  2. Соберите бусины на магнитной стойке и промыть 5 раз с высоким содержанием соли полисома мыть буфер.
    1. Нарисуйте и отбрасывая жидкость, как только шарики собрали на стороне трубки. Затем пипетка и перерисовывать 200 мл высокосолевого полисомного буфера для мытья несколько раз. Повторите этот шаг 5 раз и отбросьте весь буфер после окончательного повторения. Немедленно переходите к следующему шагу.

4. Изолят мРНК

  1. Поместите бусы в буфер RLT. Следующие шаги сделаны непосредственно из протокола мини-комплекта RNeasy и не были расширены в любом случае.
    ВНИМАНИЕ: RLT буфер содержит соли гуанидина; НЕ смешивайте с отбеливателем.
  2. Центрифуга лизат в течение 3 мин на полной скорости 13000 об/мин или 16000 г при 4 градусах Цельсия. Тщательно удалите супернатант 350 мл путем пайпетирования и перенесите его в новую микрофугую трубку. Используйте только этот супернатант (lysate) впоследующих шагах.
  3. Добавьте равный объем в 70% этанола в микрофугую трубку.
  4. Передача до 700 мл образца, включая любой осадок, который мог образоваться, в спин-колонку, помещенную в трубку сбора 2 мл. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Откажитесь от потока через.
  5. Добавьте 350 мл буфера RW1 в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Отбросьте поток через и повторно использовать трубку сбора в следующем шаге.
    ВНИМАНИЕ: Буфер RW1 содержит соли гуанидина; НЕ смешивайте с отбеливателем.
  6. Добавьте 350 мл буфера RW1 в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуги на 15 с на 8000 х г. Откажитесь от потока через.
  7. Добавьте 500 мл буфера RPE в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга на 15 с на 8000 х г, чтобы мыть мембрану спин-колонки. Откажитесь от потока через.
  8. Добавьте 500 мл буфера RPE в колонку спина. Закройте крышку осторожно и центрифуга в течение 2 мин на 8000 х г, чтобы вымыть мембрану спин-колонки. Затем осторожно удалите колонку спина из трубки сбора, гарантируя, что столбец не контактирует с потокомчерез.
  9. Поместите колонку спина в новую трубку коллекции 2 мл и отбросить старую трубку с потоком через. Закройте крышку осторожно и центрифуги на полной скорости в течение 1 мин, чтобы удалить остаточный буфер.
  10. Поместите колонку спина в новую трубку коллекции 1,5 мл. Добавьте 30-50 мл безрычания воды прямо в мембрану вращающейся колонки. Закройте крышку осторожно и центрифуга в течение 1 мин при 8000 х г, чтобы уэлитировать РНК.
  11. Если ожидаемый выход РНК составляет 30 мг, повторите шаг 4.10 с другой 30-50 мл воды без RNase, или с помощью elute от шага 4.10 (если требуется высокая РНК). Повторное использование трубки для сбора от Step 4.10.
  12. Используйте очищенную РНК для анализа вниз по течению, включая РНК-секвенирование или в реальном времени количественные ПЦР или хранить РНК, растворенную в RNase-свободной H2O при -80 градусов по Цельсию на срок до 1 года.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наши предыдущиеисследования 4,7 предполагают, что CD36 может функционировать как переключатель для артериолярной дифференциации и капиллярной артериализации через LPA/PKD-1 сигнальный путь. Чтобы изучить, является ли LPA/PKD-1-CD36 сигнальной осью имеет важное значение для атериогенеза in vivo, мы установили новые линии TRAP, которые не только имеют глобальный дефицит CD36 или эндотелиального специфического-cd36- или pkd-1-дефицит, но и позволяют селективную изол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, в котором EC-специфической ангиогенной транскрипции генов и экспрессии играют важную роль в дифференциации ЕС и ангиогенного перепрограммирования3,4. Чтобы преодолеть барьеры от клеточного разнообразия и архитектурной сложности для лучшего понимания функции сосудистой системы млекопитающих на молекулярном уровне in vivo, мы создали EC-специфических тэсных мышей, в сопровождении EC-специфических c...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа д-ра Рена поддерживается Американской ассоциацией сердца (13SDG148800019; BR), Фонд Надежды Анны (FP00011709; BR), Американское онкологическое общество (86-004-26; MCW онкологический центр в БР), и Национальный институт здравоохранения (HL136423; BR); Джордан Палмер поддерживается 2018 MCW CTSI 500 Звезды стажировки программы; . Моран поддерживается институциональным исследовательским грантом от NHLBI (5T35 HL072483-34).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2100 Электрофорез Биоанализатор с наночипами и пикочипамиAgilentG2939AA, 5067-1511 & 5067-1513
Скребки для клетокSarstedt83.1832
ГомогенизаторыFisher ScientificK8855100020
Magnet (Dynamag-2)Invitrogen123-21DБудет зависеть от масштаба очистки; образцы в пробирках объемом 1,5 мл могут быть сконцентрированы на миницентрифуга DynaMag-2
Fisher Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C спектрофотометрThermo Scientific ND-2000C
Охлаждаемая центрифугаEppendorf5430Rс ротором для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл
БезРНКазные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 млApplied Biosystems 
Конические пробирки объемом 50 мл без РНАЗыApplied Biosystems 
РНКаза, не содержащий 1000-μ l фильтрующие наконечникиRaininRT-1000F
РНКаза без РНКазы 200-μ l фильтрующиенаконечники Rainin RT-200F
РНКаза 20-μ l фильтрующиенаконечники Rainin РТ-20Ф
Ротор для гомогенизаторовYamato LT-400D
Вращатель трубок, Labquake марки ThermoFisher13-687-12Q
AM12450AM12501

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivoTRAPGFPGFPqPCR

Похожие статьи