Методическая статья

Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

DOI:

10.3791/59630

⸱

13 мая 2019 г.

 , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот молекулярный подход для определения бактериальной пригодности облегчает точное и точное обнаружение микроорганизмов с помощью уникальных геномных штрих-кодов ДНК, которые количественно с помощью цифровых ПЦР. Протокол описывает расчет конкурентного индекса штаммов сальмонеллы; однако технология легко адаптируется к протоколам, требующим абсолютной количественной оценки любого генетически легкоподобимого организма.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конкурентный индекс является распространенным методом, используемым для оценки бактериальной пригодности и / или вирулентности. Полезность этого подхода иллюстрируется его легкостью выполнения и его способностью стандартизировать пригодность многих штаммов к организму дикого типа. Техника ограничена, однако, имеющимися фенотипическими маркерами и количеством штаммов, которые могут быть оценены одновременно, создавая необходимость в большом количестве повторных экспериментов. Параллельно с большим количеством экспериментов, затраты на проработку и материальные затраты на количественную оценку бактерий на основе фенотипических маркеров не являются незначительными. Чтобы преодолеть эти негативные аспекты, сохраняя при этом положительные аспекты, мы разработали молекулярный подход к непосредственной количественной оценке микроорганизмов после инженерных генетических маркеров на бактериальные хромосомы. Уникальные, 25 базовых пар ДНК штрих-коды были вставлены в безобидный локус на хромосоме дикого типа и мутант штаммов сальмонеллы. В пробирке были проведены эксперименты по проведению соревнований с использованием инокула, состоящего из объединенных штаммов. После проведения конкурса абсолютные цифры каждого штамма были количественно определены с помощью цифровых ПЦР, и из этих значений были рассчитаны конкурентоспособные индексы для каждого штамма. Наши данные показывают, что этот подход к количественной оценке сальмонеллы является чрезвычайно чувствительным, точным и точным для обнаружения как очень обильные (высокая пригодность) и редких (низкий фитнес) микроорганизмов. Кроме того, эта техника легко адаптируется практически к любому организму с хромосомами, способными к модификации, а также к различным экспериментальным конструкциям, которые требуют абсолютной количественной оценки микроорганизмов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка пригодности и вирулентности патогенных организмов является фундаментальным аспектом микробиологических исследований. Это позволяет проводить сравнения между штаммами или между мутировавшими организмами, что позволяет исследователям определить важность определенных генов в определенных условиях. Традиционно, вирулентность оценка использует животных модель инфекции с использованием различных бактериальных штаммов и наблюдения за результатом инфицированного животного (например, инфекционная доза50, Смертельная доза50, время до смерти, тяжесть симптомов, отсутствие симптомы и т.д.). Эта процедура содержит ценные описания вирулентности, но она требует штаммов, чтобы вызвать значительные различия в результатах, с тем чтобы обнаружить отклонения от дикого типа. Кроме того, результаты являются полуколичественными, поскольку в то время как прогрессирование заболевания и тяжесть симптомов могут быть субъективно количественно с течением времени, интерпретация вирулентности по сравнению с диким типом является более качественной (т.е. больше, меньше или в равной степени вирулентным). Общей альтернативой для выполнения анализов инфекционной инфекции животных является создание конкурентоспособных индексов (CIs), значения, которые непосредственно сравнить фитнес или вирулентность штамма с диким типом аналога в смешанной инфекции1. Этот метод имеет многочисленные преимущества перед традиционной животной моделью инфекции путем стандартизации вирулентности к штамму дикого типа и определения количественной оценки, отражающей степень ослабления. Этот метод также может быть адаптирован для анализа взаимодействия генов в бактериях, определив отмененный конкурентный индекс (COI)2. Расчет COI для группы мутировавших организмов позволяет исследователям определить, независимо ли два гена способствуют патогенезу или если они участвуют в том же пути вирулентности и зависят друг от друга. Кроме того, расчет CI требует перечисления бактерий, которые могут обеспечить ценную информацию о патогенезе организмов. CIs и COIs также позволяют исследователям осла avirulent напряжения которые не причиняют клинические заболевания но все еще имеют разницы в пригодности. Этот метод ограничен использованием традиционных маркеров устойчивости к антибиотикам для выявления штаммов, тем самым ограничивая количество входных штаммов только одним или двумя за один раз. Из-за этого ограничения требуется большое количество экспериментальных групп и репликаций, что в дополнение к увеличению затрат на рабочую силу и материальные затраты, а также увеличивает возможности для изменчивости в экспериментальных условиях и неточных результатов. (Для тщательного анализа преимуществ и применений использования смешанных инфекций для изучения вирулентности, фитнеса и взаимодействия генов см. C.R. Beuzon и D.W. Holden 1)

Были предприняты попытки преодолеть это ограничение, такие как использование флуоресцентно помеченных клеток количественно через поток цитометрии3,4,5. Этот метод количественно клеток, использующих либо 1) помеченные антитела к фенотипическим маркерам или 2) эндогенно производства флуоресцентных белков. Использование помеченных антител имеет предел обнаружения 1000 клеток / мл, и поэтому требует большого количества клеток для анализа3. Клетки, выражающие флуоресцентные белки, имеют измененную физиологию ивосприимчивы к изменениям в фитнесе в результате высокой экспрессии белка 6. Оба метода ограничены количеством флуоресцентных маркеров, обнаруживаемых с помощью цитометрии потока. Прогресс в молекулярной количественной была достигнута за счет разработки метода microarray, которые обнаружили затусание в 120 штаммов от первоначальной смешанной инфекции более 1000 штаммов в модели мурин7. Этот метод использовал микроаррейный анализ РНК от мутировавших штаммов, которые приводят к значительной изменчивости в результате.  Тем не менее она установила, что большие пулы смешанных инфекций могут быть полезным инструментом и что, используя чувствительные методы обнаружения, можно выявить различия в бактериальной вирулентности. С развитием последовательности следующего поколения, Tn-seq расширил полезность транспозонных мутаций, что позволило мощный метод для количественной оценки бактерий, которые были случайно мутировали8,9,10, 11. Альтернативный протокол был недавно разработан, что устраняет необходимость транспозонов и вместо этого использует ДНК штрих-коды для более легко гораздо выявления и отслеживания геномных изменений и их влияние на фитнес12. Эта технология является важным прогрессом, но вставка геномных штрих-кодов по-прежнему является случайным процессом. Чтобы преодолеть случайность предыдущих экспериментов, Yoon et al. разработали метод расчета CIs штаммов сальмонеллы с помощью уникальных штрих-кодов ДНК, вставленных в точных местах на хромосомых бактерий13. Уникальные штрих-кодированные штаммы были обнаружены с помощью метода на основе qPCR с зеленым цветом SYBR и грунтовками, специфичными для каждого уникального штрих-кода. Этот метод был ограничен ограничениями, налагаемыми qPCR, включая различия в эффективности праймера и низкую чувствительность, о чем свидетельствует необходимость вложенного ПЦР до qPCR. Тем не менее этот подход продемонстрировал, что целевые геномные изменения могут быть использованы для обнаружения и потенциально количественной оценки пулов многочисленных бактериальных штаммов.

В следующем протоколе мы описываем новую методологию для проведения экспериментов бактериальной конкуренции с большими пулами смешанных инокула, а затем точной количественной оценки с использованием высокочувствительной цифровой техники ПЦР. Протокол включает в себя генетически маркировки бактериальных штаммов с уникальным штрих-кодом ДНК вставляется на безобидной области хромосомы. Эта модификация позволяет быстро и точно количественно производить штаммы с использованием современных молекулярных технологий вместо традиционных серийных разбавлений, реплики покрытия и подсчета колоний, образующих единицы, которые полагаются на фенотипические маркеры (т.е. устойчивость к антибиотикам (т.е. устойчивость к антибиотикам ). Изменения позволяют одновременно оценивать многие штаммы в одном объединенном инокулуме, существенно уменьшая возможность экспериментальной изменчивости, поскольку все штаммы подвергаются точно таким же условиям. Кроме того, в то время как этот метод был разработан в Salmonella enterica serovar Typhimurium, он очень адаптируется к любой генетически податливый организм и почти любой экспериментальный дизайн, где точные бактериальные подсчеты необходимы, обеспечивая новый инструмент для повышения точности и пропускной их пропускной связи в микробиологических лабораториях без ограничений, налагаемых предыдущими методами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Включите уникальные штрих-коды ДНК на плазмид, содержащий необходимые компоненты для аллелики Exchange

ПРИМЕЧАНИЕ: Был создан новый плазмид, названный pSKAP, с высоким числом копий и повышенной эффективностью преобразования по сравнению с существующим иаллеливой биржевой плазмидой pKD13. Это описано в шагах 1.1-1.12(рисунок1). Завершенные плазмиды, содержащие уникальные штрих-коды ДНК и компоненты для аллельного обмена, доступны через плазмидное хранилище(Таблицаматериалов).

  1. Используя коммерческий плазмидный мини-набор, очистите pKD1314 и pPCR Script Cam SK- от ночных бактериальных культур, выращенных в бульоне Лурия-Бертани (LB), дополненном 50 мкг/мл канамицином или 25 мкг/мл хлорамфениколом (для pKD13 и pPCR Script Cam СКЗ, соответственно)(Таблица 1).
  2. Выполняйте ограничения на обе плазмиды с использованием ферментов коммерческого ограничения HindIII и BamHI в соответствии со спецификациями производителя.
  3. Удалить ограничения ферментов и вырезанных ДНК из pPCR Сценарий Cam SK реакции и очистить 3370-базовый пара (bp) плазмид позвоночника с помощью коммерчески доступных ДНК очистки комплект в соответствии со спецификациями производителя.
  4. Отделить фрагменты от pKD13 ограничение пищеварения на 1% агарозный гель с помощью камеры электрофореза.
  5. Визуализируйте полосы с помощью синего светло-просветлятеля и выexcise 1,333 bp фрагмент из геля(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот фрагмент содержит ФРТ-фланговый ген канамицина, необходимый для хромосомной аллелевой замены.
  6. Очистите вырезанную ДНК от шага 1.5 с помощью коммерческого комплекта для извлечения геля.
  7. Для создания pSKAP, сваить очищенный фрагмент из pKD13 (от шага 1.6) в pPCR Script Cam SK (от шага 1.3) с использованием коммерческой лиги T4 ДНК в соответствии со спецификациями производителя.
  8. Преобразуйте химически компетентные клетки DH5 с ligated плазмид pSKAP следуя протоколу производителя (таблица 1).
  9. Распространение трансформаторов на LB агар пластины дополнены 50 мкг /мл канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
  10. Выберите колонию из пластины и полоса его на новый LB агар пластины дополняется 50 мкг /мл канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. Выберите колонию из этой тарелки и использовать для привить LB бульон дополнен 50 мкг /мл канамицин. Инкубировать культуру на ночь при 37 градусах Цельсия при постоянном возбуждении.
  11. Используйте коммерческий плазмидный мини-комплект для очищения pSKAP от ночной бактериальной культуры.
  12. Выполните диагностическое ограничение пищеварения плазмида от шага 1.11 с использованием Hind III и Bam HI в соответствии со спецификациями производителя. Визуализируйте фрагменты на 1% агарозном геле, как в шагах 1.4-1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий размер pSKAP должен сойти 4703 б.п. Фрагменты после шага 1.12 должны сойти 3370 и 1333 б.п.
  13. Дизайн ПЦР праймеры для вставки сайта направлены мутагенез (SDM) (Таблица 2 и S1) таким образом, чтобы вставить уникальный 25-базовый последовательности ДНК в положении 725 pSKAP (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК штрих-кода вставляется в плазмид недалеко от гена сопротивления канамицина, так что штрих-код не теряется при последующем удалении кассеты сопротивления канамицина. При генерации новых последовательностей штрих-кодов используйте онлайн-инструменты для обеспечения того, чтобы флуоресцентно помеченные целевые зонды ПЦР (далее называются просто "зондами") будут эффективно связываться с новой последовательностью. Последовательности вставки, разработанные на сегодняшний день, наряду с необходимыми грунтовками для их создания, предоставляются в таблицах 2 и S1.
  14. Подготовка SDM реакции с использованием коммерческих высокой точности ДНК полимеразы, желаемых праймер пар (таблица 2), и шаблон pSKAP. Установите термоцикл, чтобы выполнить следующие: 1) 98 КС для 30 с, 2) 98 C для 10 с, 56 C для 15 с, 72 C для 2 мин, 3) повторить шаги 2, 24 раза, 4) 72 C для 5 мин, 5) держать при 4 c.
  15. После завершения PcR, истощать шаблон pSKAP, добавив ограничение фермента Dpn I к реакции. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты из ПЦР должны быть визуализированы на геле агарозы, чтобы проверить размер и чистоту продукта. Контроль Dpn I пищеварения, состоящий из неизмененного шаблона pSKAP может быть выполнен и использован в последующих шагах для обеспечения шаблона ДНК полностью усваивается.
  16. Используйте 5 л продукта от шага 1.15 для преобразования 100 л коммерческих химически компетентных клеток DH5 в соответствии с рекомендациями производителя.
  17. Распространение трансформаторов на LB агар пластины дополнены 25 мкг /мЛ хлорамфеникол и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
  18. Выберите колонию (или колонии) из ночных пластин и полоску на отдельные пластины агара LB, дополненные 25 мкг/мл хлорамфениколом и инкубировать при 37 градусах Цельсия за одну ночь. Выберите колонию из ночных пластин и используйте для привить 5 мл бульона LB, дополненного 25 мкг/мл хлорамфениколом. Инкубировать культуры (ы) на ночь при 37 градусов по Цельсию с постоянным волнением.
  19. Используйте коммерческий плазмидный мини-набор для очистки плазмидов от ночной культуры (ы).
  20. Sanger последовательность очищенных плазмидов с помощью M13 Вперед секвенирования грунтовки (Таблица 2). Сравните мутировавший регион с исходной плазмидой и оцените точность вставки SDM.
  21. После подтверждения вставки штрих-кода и точности, назначить каждый штрих-код и плазмид имя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды, генерируемые на сегодняшний день были назначены два буквы обозначение: AA, AB, AC, ..., BA, BB, до н.э., и т.д. Баркодированные плазмиды обозначаются как pSKAP-AA, pSKAP-AB, pSKAP-AC, ..., pSKAP-BA, pSKAP-BB, pSKAP-BC и т.д.
  22. Повторите шаги 1.14-1.21 для генерации нужного количества штрих-кодов ДНК.

2. Введите штрих-код ДНК на хромосому С. Типимуриум

ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка штрих-кодов ДНК на S. Тифимурия хромосома достигается с помощью метода аллелики обмена, описанного Даценко и Ваннером14, который был модифицирован для использования в S. Тифимурий.

  1. Определите локус на С. Тифимурий геном, при котором вставить штрих-код ДНК(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите большую межгенную область хромосомы. Избегайте регионов, которые производят некодирующую РНК. В этом исследовании использовался локус вниз по течению от положенных P между остатками 1 213 840 и 1 213 861 (определяется из сборки генома GCA-000022165.1). Этот регион ранее был генетически манипулировать в транс-дополнения генов15. Кроме того, штрих-код ДНК может быть введен при одновременном нарушении гена интереса. Для этого потребуются минимальные изменения в этом протоколе и рационализация создания мутантов.
  2. Дизайн ПЦР праймеры для усиления уникального штрих-кода и FRT-фланговые kanamycin сопротивление гена от желаемого pSKAP штрих-код-содержащих плазмид от шага 1.21 (Таблица 2). Добавьте 40 нуклеотидные расширения, которые являются гомологичными в регионе, выбранном в шаге 2.1 к концу 5' каждой грунтовой части (Таблица 2).
  3. Выполните усиление с использованием коммерческой полимеразы высокой точности, грунтовки от шага 2.2, и желаемого pSKAP штрих-кода, содержащего плазмид в качестве шаблона. Установите термоцикл для выполнения следующих: 1) 98 КС на 30 с, 2) 98 градусов по Цельсию для 10 с, 3) 56 градусов по Цельсию для 15 с, 4) 72 КС для 60 с, повторяющие шаги 2-4 29 раз, 5) 72 C на 5 мин, 6) удерживайте при 4 градусах по Цельсию.
  4. После завершения ПЦР, истощать шаблон ДНК с помощью DpnI, как описано в шаге 1.15. Очистите и сконцентрируйте ДНК с помощью коммерческого комплекта для очистки ДНК в соответствии со спецификациями производителя.
  5. Ссылайтесь на ранее опубликованный протокол для генерации мутантов в S. Тифимурий штамм 14028s из продуктов ПЦР14,16,17,18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно, чтобы ген сопротивления канамицину вырезали из хромосомы. Тем не менее, иссечение гена является минимально разрушительным для бактериальной хромосомы, как это приводит к 129 bp шрам, который оставит потенциальных вниз по течению генов в кадре. Рекомендуется, чтобы штамм, содержащий ген резистентности канамицина сохраняется, поскольку он может быть использован для перемещения штрих-кодов между штаммами через P22-опосредованную трансдукцию.
  6. Повторите шаги 2.3 - 2.5 для создания желаемых штаммов с соответствующими штрих-кодами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды могут быть введены в дикий тип S. Тифимурий, который затем может быть подвергнут дальнейшим генетическим манипуляциям, или штрих-коды могут быть введены в штаммы, которые ранее были генетически изменены.

3. Условия роста бактерий и в пробирке конкурс ныесли

  1. Из бактерий запасов, полоса желаемого S. Typhimurium штаммов, что каждый гавани уникальный штрих-код ДНК на LB агар пластин. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
  2. Выберите одну колонию из каждого штамма и привить 5 мл бульона LB. Инкубировать в течение 20 ч при 37 градусах Цельсия при постоянном возбуждении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя ночную культуру, приступайте к шагу 3.5 для сбора чистой геномной ДНК (gDNA) с каждого штрих-кода штамма. Это необходимо для последующей проверки и контрольных экспериментов в разделе 6.
  3. Для каждого конкурса анализ, передача равного объема каждой ночной культуры в соответствующих размеров стерильной трубки. Тщательно смешать штаммы вместе, вихревой энергично, по крайней мере 5 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем каждой ночной культуры для передачи должен быть достаточным для каждого состояния и репликации, а также для изоляции гДНК для количественной оценки входных средств. Хотя не совсем необходимо измерять оптическую плотность культур, поскольку абсолютное число входному микроорганизмов будет количественно оцениваться с помощью цифровых ПЦР, количество вхотливых бактерий для каждого штамма должно быть примерно равным, чтобы избежать узких мест или неравной конкуренции в начале эксперимента. Представительная конкуренция в этом протоколе сравнивала темпы роста на 8 штаммов одновременно. Дополнительные или меньше штаммов могут быть необходимы для отдельных экспериментальных конструкций.
  4. Перенесите 100 л смешанного инокулума в стерильный бульон LB 4,9 мл. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в нужное время или до желаемой оптической плотности.
  5. Урожай 500 л инокулума путем центрифугирования на йgt;12,000 х г в течение 1 мин. Удалить и отбросить супернатант. Немедленно приступайке к разделу 4 с ячейками.
  6. В желаемые точки времени, удалить 500 qL aliquots культуры и сбора клеток центрифугирования на йgt; 12000 х г в течение 1 мин. Удалить и отказаться от супернатанта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе aliquots в нескольких тайм-пойнтах, заморозить гранулы на -20 градусов по Цельсию или сразу же приступить к шагу 4.1 после каждой коллекции.

4. Сбор и количественная оценка gDNA от S. Тифимурий (от шагов 3.5 и 3.6)

  1. Урожай gDNA из клеток с помощью коммерческого комплекта очистки gDNA. При наличии, выполните факультативный шаг истощения РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение РНК не является необходимым; однако наличие РНК искусственно увеличит концентрацию ДНК, что приведет к аномальным расчетам в последующих шагах. При использовании коммерческого комплекта очистки gDNA следуйте рекомендациям производителя, чтобы гарантировать, что столбец не перегружен ДНК. Минимальная концентрация ДНК не требуется, если образец поддается количественной оценке в последующих шагах.
  2. Используйте спектрофотометр для количественной оценки ДНК в каждом образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК можно количественно обезопасить с помощью любого надежного метода.
  3. Рассчитайте число копий gDNA на основе размера бактериального генома, используя следующее уравнение, где: X является количество ДНК в нг и N является длина двухцепочечной молекулы ДНК (размер генома).
    figure-protocol-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: 660 г/моль используется в качестве средней массы 1 ДНК bp. Небольшие вариации могут существовать в зависимости от состава нуклеотидов организма. Многочисленные калькуляторы доступны в Интернете для выполнения расчета.

5. Дизайн праймериз и зонды для количественного обнаружения ДНК штрих-кодов через dDigital PCR

  1. Дизайн грунтовки для усиления штрих-кодированной области S. Тифимурия хромосома вниз по течению putP (Рисунок 3C и Таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер и зонд конструкций может быть облегчено многочисленными онлайн-программ (Таблица материалов). Если штрих-коды вставляются в одни и те же локусы, то единый набор грунтовок усиления является универсальным для всех штрих-кодов.
  2. Дизайн 6-carboxyfluorescein (FAM) на основе и / или hexachlorofluorescein (HEX) на основе зондов, специфичных для каждого штрих-кода (Таблица 2 и S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Считыватель капель, используемых в этом эксперименте, способен обнаруживать как зонды на основе FAM, так и HEX одновременно в реакции мультиплекса. Дизайн 1/2 зондов для использования FAM и 1/2 для использования HEX. Это не является необходимым шагом, но сократит использование реагентов и экспериментальные затраты в случае их реализации.
  3. Сделайте 20x грунтово-зонд мастер смеси, содержащие 1) 20 мм каждого вперед и обратное усиление грунтовки, 2) 10 мМ одного зонда FAM, и 3) 10 мм одного зонда HEX (если мультиплексирование).

6. Проверить чувствительность и специфику каждого Pprimer-зонд набор для каждого геномного штрих-кода с использованием цифровых ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует проверку восьми уникальных штрих-кодов с восемью уникальными зондами в качестве примера. Количество используемых штрих-кодов может быть увеличено или уменьшено с учетом различных экспериментальных конструкций.

  1. Создайте пул gDNA, который содержит все штрих-коды, кроме одного. Используйте этот пул в качестве разбавитель для выполнения серии разбавления с gDNA, содержащей один оставшийся штрих-код (схема разбавления образцов предусмотрена на рисунке 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование объединенной гДНК в качестве разбавитель обеспечивает согласованный фон при установлении чувствительности. Используя номера копий, определенные в шаге 4.3, разбавьте gDNA к номеру копии в пределах рекомендуемого цифрового диапазона ПЦР (1-100 000 копий на 20 qL реакции). Имейте в виду, что диапазон установлен для каждой уникальной цели (штрих-код), а не всего gDNA.
  2. Подготовьте реакции для цифрового PCR в дублировать согласно рекомендациям производителя для использования цифрового supermix PCR конструированный для химии зонда-основанной. Используйте смеси со ступени 6.1 в качестве шаблона ДНК. Используйте 20x грунтовка-зонд мастер смесь от шага 5.3, который содержит зонд для разбавленного штрих-кода в шаге 6.1.
  3. Подготовьте реплика контрольные реакции для цифрового ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя по использованию цифрового супермикса ПЦР, предназначенного для химии на основе зонда. Контрольные реакции для каждого набора зонда должны состоять из 1) не шаблон управления (NTCs), 2) отрицательные элементы управления, и 3) положительные элементы управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное количество реакций контроля репликации составляет два. В этом примере протокола используются четыре NTCs, шесть отрицательных элементов управления и шесть положительных элементов управления для каждого штрих-кода. Отрицательные элементы управления должны содержать gDNA с каждым штрих-кодом, за исключением штрих-кода, соответствующего тестируемому зонду. Это позволит проверить специфику каждого зонда.
  4. Повторите шаги 6.1-6.3 для создания цифровых реакций ПЦР для каждого образца gDNA со штрих-кодом. Расположение образцовой пластины представлено на рисунке 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти и последующие шаги описаны на основе конкретной цифровой платформы ПЦР, которая использует капли и технологии на основе потока. Альтернативные цифровые платформы PCR, использующие технологию на основе чипов, могут быть легко заменены небольшими изменениями в этом протоколе. Шаг 6.4 может потребовать более одной пластины 96 колодцев для проверки всех наборов грунтовки. В отличие от qPCR, отдельные пластины, анализируемые цифровыми ПЦР, можно легко сравнить без необходимости в стандартизированных эталонных скважинах между пластинами.
  5. Создавайте капли для каждого состояния реакции с помощью генератора капель в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Перенесите вновь созданные капли в соответствующую 96-ну хорошую пластину. Используйте 200 наконечников пипетки на многоканальной трубе 5-50 л.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда труба капли, пипетка медленно и плавно! Производитель цифрового оборудования ПЦР рекомендует использовать только пипетки и пипетки от конкретного производителя (например, Ranin). Эти пипетки советы имеют гладкое отверстие без микроскопических пластиковых фрагментов, которые могут уничтожить капли или повредить микрофлюики считывателя капель. Многочисленные бренды советы были рассмотрены и наблюдается, чтобы иметь спектр качества производства. Эквивалентные результаты были достигнуты с помощью pipette отзыв альтернативы; однако при отклонении от рекомендаций производителя следует соблюдать осторожность.
  7. После того, как все капли были сгенерированы и переданы, запечатать пластину с фольгой пластины герметик.
  8. Используйте рекомендованный производителем термоциклер для выполнения следующих условий езды на велосипеде: 1) 94 кв. м в течение 10 мин; 2) 94 КК в течение 1 мин, скорость рампы установлена на уровне 1 кв/с; 3) 55 кк с течением 2 мин, скорость рампы, установленная на уровне 1 кв.к/с; 4) повторные шаги 2 и 3 49 раз; 5) 98 кВ за 10 мин; 6) удерживайте при 4 градусах По цельсию до 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой перенос в реакции капли не то же самое, что стандартный ПЦР. Условия реакции могут потребовать изменения.
  9. В то время как термоцикл выполняется, программа анализа данных программного обеспечения с информацией установки пластины, таких как название образца, тип эксперимента (абсолютная количественная), супермикс используется, целевой 1 имя (FAM штрих-код имя), целевой 1 тип (NTC, положительный контроль, отрицательный контроль, или неизвестно), целевой 2 имя (HEX штрих-код имя), целевой тип 2 (пустой, положительный контроль, отрицательный контроль, или неизвестно). Окончательная информация о настройке пластины отображается на рисунке 5.
  10. После того, как термоцикл завершен, передача завершенных реакций на считыватель капель и начать процесс чтения в соответствии с инструкциями производителя.

7. Количественная оценка количества бактерий в конкурентном эксперименте индекса

  1. Разбавленная гДНК изолирована и количественно от раздела 4 до соответствующей концентрации, как описано выше.
  2. Подготовьте реакции на цифровой ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя по использованию соответствующего супермикса. Используйте ДНК со ступени 7.1 в качестве шаблона. Используйте один 20x грунтового зонда мастер-микс, который содержит зонд (или зонды при обнаружении как FAM и HEX) для возможных штрих-кодов, присутствующих в эксперименте.
  3. Подготовьте дополнительные цифровые реакции ПЦР, как в шаге 7.2 с использованием различных 20x грунтового зонда мастер смеси, пока все штрих-коды, используемые в экспериментальной конструкции могут быть обнаружены.
  4. Включите элементы управления для каждого состояния, описанного в 6.3. Это включает в себя 1) не шаблон управления (NTCs), 2) отрицательные элементы управления, и 3) положительные элементы управления.
  5. Продолжить с протоколом, как описано в шагах 6.5-6.10.

8. Анализ цифровых данных ПЦР и вычислить абсолютные номера копий

  1. Когда все скважины будут прочитаны и запуск завершен, откройте файл данных .qlp с помощью программного обеспечения для анализа данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь типы файлов и процедуры анализа данных специфичны для одного цифрового производителя ПЦР. При использовании альтернативных цифровых платформ ПЦР типы файлов и процедуры анализа данных будут специфичны для используемой платформы и должны выполняться в соответствии с рекомендуемыми спецификациями производителя.
  2. Выберите все скважины, которые используют тот же грунтовка-зонд мастер смеси.
  3. На вкладке капли, изучить количество капель, проанализированных в каждом колодце (как положительные, так и отрицательные капли). Исключить из анализа любой скважины, которая имеет менее 10000 всего капель.
  4. Перейдите на вкладку 1D Amplitude и изучите амплитуда положительных и отрицательных капель. Убедитесь, что они состоят из двух различных популяций.
  5. В рамках программного обеспечения, использовать функцию порога, чтобы сделать отсечение между положительными и отрицательными каплями для каждого зонда, который был использован (Рисунок 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все скважины, которые используют тот же грунтовка-зонд мастер смесь от шага 5.3 должны иметь те же пороги.
  6. После того, как соответствующие пороги были применены ко всем скважинам, программное обеспечение будет вычислять количество копий ДНК в каждой реакции. Экспорт данных в электронную таблицу для облегчения дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа данных использует количество положительных и отрицательных капель, которые подходят для распределения Пуассона, чтобы определить номер копии.
  7. Используя значения со ступени 8.6, вычислите исходное число копий каждого уникального геномного штрих-кода в образце. Определите средний ложноположительный показатель от отрицательных реакций контроля и вычесть это значение из значений, полученных в экспериментальных реакциях. Умножьте значения по мере необходимости на основе разбавлений, которые были выполнены при настройке каждого эксперимента(таблица 3).

9. Определить относительную пригодность организма путем вычисления CI или COI от цифровой ПЦР основе количественной оценки штрихкодированных штаммов

  1. Рассчитайте CI штрих-кодированного штамма, используя следующие формулы, где:Выход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма в данный момент времени, WTВыход является абсолютной количественной оценки штрихкодированных диких бактерий в то же время тайм-пойнт,Вход является абсолютным количественное значение входных inoculum штрих-кодированного штамма, WTвход является абсолютной количественной ввода ввода ввода ввода штрих-кодированных бактерий дикого типа, XВыход является суммирование всех штаммов на в то же время, XВвод является суммирование общего ввода inoculum всех штрихкодированных штаммов.

figure-protocol-2
figure-protocol-3
ПРИМЕЧАНИЕ: Ознакомьтесь с тем, что в ней рассматриваются преимущества, недостатки и наиболее подходящее использование каждой формулы.

  1. Повторите шаг 9.1 для каждого штрих-кода штамма во всех временных точках.
  2. Если это применимо, вычислить COI, используя следующие формулы, где:Выход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма с мутировавшим геном А в данный момент времени, ABВыход является абсолютной количественной оценки штрихкодированного штамма с мутировавшими генами A и B в то же время,Вход является абсолютной количественной входной инокум штрих-кода штамма с мутировавшим геном A, ABВход является абсолютной количественной входной ввода inoculum штрих-кодированного штамма с мутировавшими генами A и B,BВыход является абсолютной количественной оценки штрих-кодированного штамма с мутировавшим геном B в заданную точку времени, и Ввход является абсолютной количественной оценки ввода инокулум штрих-кода штамма с мутировавшим геном B.

figure-protocol-4
И/ИЛИ
figure-protocol-5

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование этой методологии требует, чтобы соответствующие контрольные реакции выполнялись для проверки чувствительности и специфичности каждого зонда, используемого для определения целевой ДНК. В этом репрезентативном эксперименте мы проверили восемь уникальных штрих-кодов ДНК с восемью соответствующими зондами для идентификации. Все восемь зондов имели низкую скорость ложных срабатываний как в NTC, так и в отрицательных контрольных реакциях(таблица3), подчеркивая их ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность точно количественно оценить микроорганизмы имеет первостепенное значение для исследований микробиологии, а способность перечислять уникальные штаммы из первоначальной смешанной популяции оказалась бесценным инструментом для оценки фитнеса и вирулентности в Бактерий. Тем не менее, методы для достижения этой цели не продвинулись в ногу с современными разработками в молекулярной биологии. Технология легко модифицировать хромосомы многих бактерий, в том числе S. Typhimurium, был доступен в течение почти ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, о которых сообщалось в этой публикации, были поддержаны Фондом исследований факультета Джорджа Ф. Хаддикса и Национальным институтом общей медицинской науки Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии GM103427. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиEppendorf22600028Procure от любого производителя
16 мл пробиркидля культур MidSci8599Procure от любого производителя
5-200 μ L наконечники для пипетокRAININ30389241Закупайте альтернативные бренды наконечников с осторожностью исходя из качества изготовления
5-50 мкм; L многоканальный дозаторRAININ17013804Используйте альтернативные многоканальные пипетки с осторожностью
AgaroseThermoFisher ScientificBP160-500Закупайте у любого производителя
BLAST AnalysisNCBIN/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Термоциклер с модулем реакции на 96 глубоких лунокBio Rad1851197Необходимо приобрести материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Химически компетентный DH5&альфа;Invitrogen18258012Закупите у любого производителя или приготовьте самостоятельно
ХлорамфениколThermoFisher ScientificBP904-100Закупите у любого производителя
Cytation5 Считыватель микропланшетовBioTekCYT5MFЗакупите у любого производителя, используйте любую систему, способную точно количественно оценить
ДНК Программное обеспечение для анализа данных (QuantaSoft и QuantaSoft Data Analysis Pro)Bio RadН/ДНеобходимо закупать материалы для ddPCR в компании Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
ddPCR 96-луночные планшетыBio Rad12001925Необходимо приобрести материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Масло для чтения капель ddPCRRad1863004Необходимо приобрести расходные материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)Bio Rad1863024Необходимо приобрести расходные материалы ddPCR в компании Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Картриджи DG8 для генератора капель QX200/QX100Bio Rad1864008Необходимо приобрести расходные материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Прокладки DG8 для генератора капель QX200/QX100Bio Rad1863009Необходимо закупать материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Масло для генерации капель для зондовBio Rad1863005Необходимо закупать материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
КанамицинThermoFisher ScientificBP906-5Закупка от любого производителя
Агар Лурия-БертаниThermoFisher ScientificBP1425-2Закупка от любого производителя или изготовление самостоятельно из агара, триптона, дрожжевого переварива, а
NaCl Бульон Лурия-БертаниThermoFisher ScientificBP1426-2Закупка от любого производителя или изготовление самостоятельно из триптона, дрожжевого расщепления и NaCl
Термосвариватель для ПЦР-планшета, фольга, прокалываемыйBio Rad1814040Необходимо приобрести материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
ПЦР-пробиркиEppendorf951010022Закупка от любого производителя
Чашки ПетриThermoFisher ScientificFB0875712Закупка от любого производителя
pPCR Script Cam SK+Stratagene/Agilent211192Больше не выпускается в продаже
Primer/Probe DesignIDTN/Ahttps://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP и pSKAP_BarcodesAddgenePlasmid номера 122702-122726www.addgene.org
PX1 PCR Plate SealerBio Rad1814000Необходимо закупить материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Генератор капель QX200Bio Rad1864002Необходимо закупить расходные материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
QX200 Droplet ReaderBio Rad1864003Необходимо закупить расходные материалы ddPCR от Bio Rad. Альтернативы пока недоступны.
Salmonella typhimurium штамм ATCC 14028sATCC 14028swww.atcc.org
микрообъемная пластинаTake3 BioTekTAKE3Закупка от любого производителя, использование любой системы, способной точно количественно определить ДНК
Thermo Scientific FastDigest BamHIThermoFisher ScientificFERFD0054Закупка у любого производителя
Thermo Scientific FastDigest DpnIThermoFisher ScientificFERFD1704Закупать у любого производителя
Thermo Scientific FastDigest HindIIIThermoFisher ScientificFERFD0504Закупать у любого производителя
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro KitThermoFisher ScientificFERK0832Закупать у любого производителя
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ScientificFERK0503Закупка от любого производителя
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF534LЗакупка от любого производителя
Thermo Scientific T4 DNA LigaseThermoFisher ScientificFEREL0011Закупка от любого производителя
ТермоциклерBio Rad1861096Закупка от любого производителя
UVP Visi-Blue TransilluminatorThermoFisher ScientificUV95043301Или другой трансилюминатор, позволяющий визуализировать ДНК
воды,ThermoFisher ScientificBP28191Grade от любого производителя
Bio также

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303(2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767(2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308(2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Salmonella

Похожие статьи