Здесь мы описываем непрямой иммунозахват сэндвича ELISA для определения иммуногенного содержания гликопротеинов в вакцинах против бешенства. Этот тест использует нейтрализующее моноклональные антитела (mAb-D1), распознавающее тримеры гликопротеина. Это альтернатива тесту in vivo NIH, чтобы следить за согласованностью потенции вакцин во время производства.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Растущая глобальная забота о благополучии животных поощряет производителей и Национальные контрольные лаборатории (OMCLs) следовать стратегии 3Rs по замене, сокращению и уточнению лабораторных испытаний на животных. Разработка подходов в пробирке рекомендуется на уровне ВОЗ и Европы в качестве альтернативы тесту NIH для оценки потенции вакцины против бешенства. На поверхности частиц вируса бешенства (RABV) тримы гликопротеина являются основным иммуногеном, вызывающим вирусные нейтрализующие антитела (VNAbs). Тест ELISA, где нейтрализующие моноклональные антитела (mAb-D1) распознают тримеральную форму гликопротеина, был разработан для определения содержания родного сложенного тримерного гликопротеина наряду с производством партий вакцины. Этот тест на пробирку продемонстрировал хорошее соответствие с тестом NIH и был признан подходящим в совместных испытаниях производителями вакцин RABV и OMCLs. Предотвращение использования животных является достижимой целью в ближайшем будущем.
Представленный метод основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с использованием mAb-D1, который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV, т.е. иммуногенного rabV. mAb-D1 используется как для покрытия, так и для обнаружения тримеров гликопротеинов, присутствующих в партии вакцины. Так как эпитоп распознается из-за его конформационных свойств, потенциально денатурированный гликопротеин (менее иммуногенный) не может быть захвачен и обнаружен mAb-D1. Вакцина, которая будет протестирована инкубируется в пластине сенсибилизированы с mAb-D1. Связанные тримерные гликопротеины RABV идентифицируются путем добавления mAb-D1 снова, помечены пероксидаза, а затем выявлены в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина.
Введение
С более чем 50 лет, тест NIH1 используется в качестве золотого стандарта метод для оценки потенции вакцины против бешенства до выпуска партии. Этот тест состоит из интраперитонеальной иммунизации групп мышей с вакциной, которая должна быть протестирована с последующим внутримозговой (IC) вызов 14 дней спустя с Challenge Virus Standard (CVS) штамм вируса бешенства (RABV). Потенция оценивается по доле мышей, переживших вызов IC. Хотя ВОЗ2 и Европейская Фармакопея3 по-прежнему требуют теста NIH для оценки потенции вакцины, этот тест страдает от нескольких препятствий: результаты весьма изменчивы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Меры предосторожности
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим как к живой RABV, так и к инактивированной вакцине.
- Используйте хорошие лабораторные процедуры и процедуры безопасности.
- Носите адекватное оборудование для личной защиты (PPE), включая одноразовое пальто, перчатки, маску, очки и т.д.
- Когда живой вирус титрит, используйте класс II биологической безопасности кабинета.
- Рассматривайте любой материал, контактный с образцами (реагенты, стиральные растворы и т.д.) как инфекционный материал.
- Лечить загрязненный материал путем погружения в раствор отбеливателя (2,5% гипохлорит натрия) в течение ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В следующем примере используется эталонная вакцина Lot 09, состоящая из очищенных инактивированных частиц вируса бешенства (pV-вакцина. Содержание гликопротеинов (10 мкг/мл) в этом виде было установлено после определения общего количества вирусных белков (тест BCA) и оценки процента гликопротеина СДС-полиакриламид гель электрофорез. Кроме того, можно использовать откалиброванную эталонную справочную вакцину, например,6-й Международный стандарт ВОЗ (ИС) по вакцине против бешенст.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эпитоп, признанный mAb-D1, находится в антигенном участке III гликопротеина RABV, который является не только иммунодоминирующим для индукции VNAbs, но и участвует в нейровирулении, патогенности40,41 и распознавании рецепторов42. Существует еще один важный антигенный сайт вдоль гликопротеина, сайт II43, против которого несколько MAbs были изолированы, такие как mAb-WI-111235. Они также могут б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Д-р Сильви Моржо и д-р Jean-Michel Chapsal должны быть признаны за их ключевое участие в создании анализа ELISA по вакцинам партий и организовать международные семинары и совместные исследования. Мы благодарим Сабрину Кали за критическое прочтение рукописи. Д-р Пьер Перрен отвечал за изоляцию и характеристику mAb-D1. Эта работа в основном поддерживается за счет средств Института Пастера.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Класс II Шкаф биологической безопасности | ThermoFisher Scientific | 10445753 | при титровании живого вируса |
| Прозрачный плоскодонный иммуно нестерильный 96-луночные планшеты, 400 &; L, MAXISORP | ThermoFisher Scientific | 439454 | подходит для связывания с загруженным антителом |
| Equip Labo Полипропиленовый лабораторный вытяжной шкаф | ThermoFisher Scientific | 12576606 | для приготовления серной кислоты |
| Иммунологическая пластина Strong Адсорбция MAXISORP Flat Bottom Well F96 | Dutscher | 55303 | подходит для связывания с загруженным антителом |
| Microplate Sealing Лента (100 листов) | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Microplate однорежимный считыватель Sunrise | TECAN | ||
| Шейкер-инкубатор с микропластинами | Dutscher | 441504 | |
| Мойка микропланшетов Wellwash | ThermoFisher Scientific | 5165000 | |
| Многоканальная пипетка (30-300 &; L) 12-канальные одноканальные | ThermoFisher Scientific | 4661180N | |
| (Комплект 2: Finnpipettes F2 0.2-2; L микро, 2-20 и мкм; L, 20-200 μ L & 100-1000 L) | 4700880 | ThermoFisher |
Ссылки
- Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
- Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
- Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
