Хроническое введение изопротеренола через имплантированный осмотический насос широко используется для имитации прогрессирующей сердечной недостаточности у мышей. Здесь мы описываем подробные методы хирургической мини-насосной имплантации для непрерывного введения изопротеренола в течение 3 недель, а также эхокардиографическую оценку для успешного создания модели.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Имплантация изопротеренола Мини-насоса, чтобы вызвать сердечную недостаточность у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изопротеренол (ISO), является неселективным бета-адренергическим агонистом, который широко используется для индуцирования сердечной травмы у мышей. В то время как острая модель имитирует стресс-индуцированной кардиомиопатии, хроническая модель, вводимая через осмотический насос, имитирует прогрессирующую сердечную недостаточность у людей. Целью описанного протокола является создание хронической модели сердечной недостаточности, вызванной ИСО, у мышей с помощью имплантированного мини-насоса. Этот протокол был использован, чтобы вызвать сердечную недостаточность в 100 штаммов инбредных мышей. Методы хирургической имплантации насоса описаны в деталях и могут иметь отношение к любому, кто заинтересован в создании модели сердечной недостаточности у мышей. Кроме того, представлены еженедельные изменения в кардиорекардиографии на основе эхокардиографических параметров для каждого штамма и ожидаемого времени для моделирования разработки. Таким образом, метод прост и воспроизводим. Непрерывного ISO, вводимого через имплантированный мини-насос в течение 3-4 недель, достаточно для того, чтобы вызвать ремоделирование сердца. Наконец, успех создания модели ISO можно оценить в vivo по серийной эхокардиографии, демонстрирующей гипертрофию, расширение желудочков и дисфункцию.
Введение
Сердечная недостаточность с уменьшенной фракцией выброса (HFrEF) сопровождается хорошо признанной компенсационной реакцией симпатической нервной системы для поддержания сердечно-сосудистого гомеостаза1. Гемодинамический стресс и пагубное воздействие на сердце и кровообращение наблюдались при хронической активации. Они стали краеугольным камнем современной фармакотерапии при сердечной недостаточности и являются важными механизмами в прогрессировании сердечной недостаточности и терапевтического антагонизма нейрогормональных систем1.
Несколько моделей мыши доступны для основных исследований сердечной недостаточности. Генетические модели привлекательны для изучения молекулярной терапии и изучения сигнальных путей. Однако эти модели могут не иметь отношения к распространенным формам сердечной недостаточности. Другие распространенные модели включают в себя левую переднюю нисбытку (LAD) перевязку артерий, трансаортное сужение (TAC) и изопротеренол (ISO), каждая изцельновая на различные патологические этиологии2,3,4,5 ,6. Лад артерии лигация индуцирует передней стенки инфаркта миокарда, создавая таким образом модель, специфичные для ишемической кардиомиопатии. TAC вызывает острую перегрузку давления для создания гипертонической модели сердечной недостаточности. Хотя градиент давления может быть измерен, что позволяет стратификации гипертрофии, острое начало гипертонии не имеет прямой клинической значимости4. Как LAD, так и TAC модели требуют высокого уровня хирургического опыта для выполнения. Острая модель ISO сердечной недостаточности имитирует стресс-индуцированной кардиомиопатии, также известный как болезнь Такоцубо, которая характеризуется заметным увеличением катехоламинов и активности в левом желудочке, который имитирует острый инфаркт миокарда7, 8. В отличие от этого, хронические модели ISO сердечной недостаточности представляют симптомы симптомов прогрессирующей сердечной недостаточности, с хронически повышенным уровнем катехоламинов1. Преимущества хронической модели ISO заключаются в том, что она обеспечивает хроническую андренергическую стимуляцию, имитирующую прогрессирующую сердечную недостаточность, и которую она относительно легко создать. Следователь должен выбрать модель, которая наилучшим образом резюмирует их патологии интерес.
Общая цель этого метода заключается в том, чтобы вызвать сердечную недостаточность у мышей с помощью имплантированного мини-насоса, который высвобождает ISO непрерывно имитировать хроническую симпатическую активацию, обнаруженную у пациентов с сердечной недостаточностью1. Метод прост и воспроизводим. Хотя есть явные различия между штаммами мыши, ISO вводят в течение 3 до 4 недель на 30 мг/кг /день достаточно, чтобы вызвать сердечной ремоделирования у большинства мышей. В частности, ISO приводит к про-гипертрофической компенсационной фазы в течение недели 1 следуют истончение стен, желудочковой расширение и снижение систолической функции на 2 и 32. Успех создания модели ISO можно оценить в vivo по серийной эхокардиографии, демонстрирующей гипертрофию, расширение и дисфункцию желудочков, а также ex vivo с помощью гистологической и молекулярной оценки собранной сердечной ткани для интрамиокардии накопление липидов, фиброз, СТРЕСС ER, апоптоз, и экспрессиягенов 9,10,11,12.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол соответствует руководящим принципам по уходу за животными Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (протокол ARC #2010-075). Читателям рекомендуется придерживаться своего собственного протокола, одобренного IACUC, так как пери-процедура ухода за мышью и управление обезболиванием могут быть специфическими для учреждений.
1. Приготовление изопротеренола осмотического насоса
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была успешно применена на 9 "недельных самок мышей весом 18" г из более чем 100 инбредных штаммов мыши, а также, у мышей мужского пола в подмножестве штаммов. Существует нет максимального предела веса тела для этой процедуры. Всегда включают в себя возрастные элементы управления, так как неизвестно, влияет ли возраст лечения на изопротеренол, индуцированный восприимчивостью к развитию сердечной недостаточности.
- Взвешивание и запись веса тела для каждой мыши.
- Рассчитайте соответствующее количество и концентрацию изопротеренола для каждой мыши (см. таблицу 1; Дополнительный файл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотические насосы, используемые в этом эксперименте(Таблица материалов) имеют объем резервуара 100 Л и предназначены для доставки лекарств с непрерывной скоростью потока на срок до 28 дней. Подготовьте дополнительный 20 л изопротеренола на насос, чтобы учесть потерю объема в заправочной трубе во время погрузки насоса. - Взвесьте соответствующее количество изопротеренола(таблица 1)с помощью аналитического баланса и растворите его в 120 л стерильного раствора NaCl 0,9%. Пипетка энергично или вихрь в течение 1 мин, чтобы полностью растворить изопротеренол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка осмотических насосов в кабинете биобезопасности лаборатории. Насосы должны быть обработаны хирургическими перчатками. Стерильная техника рекомендуется при подготовке осмотических насосов и во время хирургической имплантации. - Взвешивание и запись пустой осмотический насос вместе с его модератором потока, а затем удалить поток модератора.
- Аспир 120 л изопротеренола раствора в шприц 1,0 мл и прикрепить 27-калийную тупонаклонную трубку с осмотической трубкой с осмотическими насосами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что шприц и заполнение трубки свободны от пузырьков воздуха. - Удерживая насос в вертикальном положении, вставьте заполненную трубку через отверстие насоса в верхней части до тех пор, пока кончик заправочной трубки не будет сидеть на дне резервуара насоса.
- Загрузите осмотический насос, нажав шприц поршень медленно, пока изопротеренол раствор заполняет до открытия насоса.
- Аккуратно снимите трубку для заполнения и снимите лишний раствор.
- Вставьте обратно модератор потока, чтобы закрыть насос и стереть любое избыточное решение.
- Подтвердите, что более 90% объема резервуара было заполнено путем перевешивает осмотический насос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные насосы готовятся таким же образом, заполняя резервуар насоса стерильным раствором NaCl 0,9%.
2. Подготовка хирургических инструментов
- Очистите все хирургические инструменты, в том числе волоконно-оптический окольный световой микроскоп иллюминатор, 2 щипцы, держатель иглы, горячие стерилизаторы шарика, стеклянные бусы и ножницы (Таблица материалов).
- Автоклавные хирургические инструменты при 121 "C" в течение 30 минут для стерилизации инструментов до операции.
3. Изопротеренол осмотический насос хирургической имплантации
- Индуцировать анестезию, поместив мышь в индукционную камеру с 3% изолюран в 95% O2 и 5% CO2. Поддержание анестезии с 2% изофларан через носекон.
- Администрирование 5 мг/кг карпрофена s.c. к потертости шеи между лопатками для обезболивания.
- Поместите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить обезвоживание роговицы.
- Проверьте глубину анестезии, контролируя скорость дыхания, рефлекс щипца и цвет слизистой оболочки.
- Поместите мышь в положение на спине на подогревом колодки. Удалить волосы из нижней части живота и дезинфицировать кожу бетадин омичидин или хлоргексидин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму послеоперационную инфекцию, убедитесь, что хирургическое поле не имеет волос. - Используйте пару хирургических ножниц, чтобы сократить 1 см длиной разрез кожи средней линии. Используйте пару тупых ножниц, чтобы тщательно вскрыть кожу от лежащих в основе перитонеальных стенок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интраперитонеальная доставка предпочтительнее для размещения размера насоса. - Вытяните перитонеальные стенки от основной кишечника с помощью щипков и вырезать 0,8 см отверстие в стенках, используя тонкие хирургические ножницы.
- Вставьте осмотический насос в полость перитонеальной полосы с потоком модератор конца в первую очередь.
- Закройте трюм в перитонеальных стенках, используя 5.0 поглощаемые швы в прерванном виде. Используйте 6.0 непоглощаемых швов, чтобы закрыть разрез кожи в прерванном моды.
- Поместите мышь в специальный инкубатор, чтобы сохранить его теплым и сухим во время восстановления. Оцените восстановление после анестезии, наблюдая за мышью каждые 30 минут в первые два часа для возвращения нормального дыхания и движения.
- После того, как мышь полностью оправилась от анестезии, верните ее в обычное жилье. Продолжайте следить за животным на осложнения ежедневно до 3 дней, а затем каждые 2 до 3 дней после окончания эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: животные должны быть проверены на наличие послеоперационной боли или инфекции, признаки потери веса, отсутствие мобильности, ненормальная осанка, неспособность жениха, и чрезмерное лизать или кусаться области разреза. - Администрирование карпрофена 5 мг/кг s.c. каждые 24 ч до 48 ч и после этого по мере необходимости.
- Администрирование 0,25 мг/мл амоксициллина в питьевой воде в течение 5 дней для предотвращения хирургических инфекций сайта.
- Удалите непоглощаемые швы через 7-10 дней.
4. Эхокардиографическая экспертиза под наркозом
ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиографическая оценка может быть выполнена неоднократно для мониторинга серийной реконструкции сердца в течение нескольких недель. Мы проводили эхокардиографические измерения с еженедельными интервалами в течение 3 недель.
- Индуцировать анестезию в индукционной камере на 1,25% до 1,5% изофруран. После того, как надлежащим успокоительное, закрепите мышь на платформе эхокардиографии с лентой позволяет мыши продолжать получать анестезию через нос конуса.
- Снижение изолюрани до дозировки обслуживания 1%, чтобы свести к минимуму негативные хронотропические и инотропные эффекты чрезмерного сеадации. Принять к сведению дыхательных и сердечных приступов на протяжении всего исследования и корректировать изолюран дозировку по мере необходимости.
- Удалите волосы на груди с помощью депиляторного лосьона и протрите грудь без волос.
- Поместите ультразвуковой гель на грудь и положение ультразвукового зонда для изображения сердца.
- В B-режиме изображение левого желудочка (LV) в виде парастеральной длинной оси. Отрегулируйте платформу эхокардиографии, чтобы выровнять аортальный клапан и вершину LV в плоскости ультразвукового луча.
- Наклоните платформу эхокардиографии, чтобы поместить длинную ось LV при 90 градусах к ультразвуковому лучу и максимальному диаметру LV в центре изображения.
- Изображение LV короткая ось, повернув ультразвуковой зонд 90 градусов.
- В M-режиме измеряют толщину стены LV и внутренние размеры.
- Поместите мышь обратно в клетку. Монитор для возвращения нормального дыхания и спонтанных движений тела.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В нашем ранее опубликованном исследовании, мы ввели дозировку ISO 30 мг/кг/д в течение 21 дней через осмотический насос через 105 Гибридная мышь Разнообразие Панели (HMDP) штаммов2,13. Мы оценивали исходы с помощью эхокардиограммы, выполняемой на базовом уровне, неделе 1, 2 и 3 лечения ИСО(рисунок 1). Подобно предыдущему исследованию, в котором авторы изучали влияние изопротеренола среди 23 штаммов мыши14,мы н...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы применили этот метод к более чем 100 штаммов инбредных мышей для оценки сердечных исходов из-за хронической бета-адренергической стимуляции2,13. Значительные различия в восприимчивости к изопротеренолу, как известно, существуют среди штаммов мыши и могут быть настроены на штамм интереса по мере необходимости16. Это может быть связано с изменением в бета-адренергических рецепторов функции между штаммами мыши17, де...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы признают NIH K08 HL133491 для поддержки финансирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микроосмотическая насосная система с замедлителем потока на месте | Alzet | Model 1004 | Включает в себя заправочную трубку, замедлитель потока и корпус насоса |
| (-)-Изопротеренола гидрохлорид | Sigma-Aldrich | 16504-1G | (-)-Изопротеренола гидрохлорид представляет собой порошок, который необходимо хранить при температуре -20°C. |
| 1 мл стерильный шприц | VWR | BD309602 | |
| 30 Вт Светодиод Волоконное уплотнительное кольцо свет микроскоп Осветитель | AmScope | Артикул: LED-30WR | |
| 5-0 Покрытый ВИКРИЛ (полиглактин 910) Шов | Ethicon | J303H | 5-0, рассасывающиеся |
| Тонкие ножницы - Острые | FST | 14060-09 | |
| Стеклянные бусины | FST | 18000-46 | |
| Горячие бусины стерилизаторы | FST | 18000-50 | |
| Щипцы для радужной оболочки | глаза WPI | 15915 | |
| Look Sharpoint 6-0, 18" Черный нейлоновый монофиламент Шовный материал | LOOK | AA-2176 | 6-0, нерассасывающийся |
| Иглодержатель | WPI | 15926 | |
| Нормальный физиологический раствор, 0,9% NaCl | Fisher | 89167-772 |
Ссылки
- Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Review Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
- Wang, J. J., et al. Genetic Dissection of Cardiac Remodeling in an Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model. PLoS Genetics. 12 (7), 1006038(2016).
- Balakumar, P., Singh, A. P., Singh, M. Rodent models of heart failure. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 56 (1), 1-10 (2007).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circulation: Heart Failure. 2 (2), 138-144 (2009).
- Huang, W. Y., Aramburu, J., Douglas, P. S., Izumo, S. Transgenic expression of green fluorescence protein can cause dilated cardiomyopathy. Nature Medicine. 6 (5), 482-483 (2000).
- Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Disease Model and Mechanism. 3 (3-4), 138-143 (2010).
- Wittstein, I. S., et al. Neurohumoral features of myocardial stunning due to sudden emotional stress. New England Journal of Medicine. 352 (6), 539-548 (2005).
- Templin, C., et al. Clinical Features and Outcomes of Takotsubo (Stress) Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 373 (10), 929-938 (2015).
- Shao, Y., et al. A mouse model reveals an important role for catecholamine-induced lipotoxicity in the pathogenesis of stress-induced cardiomyopathy. European Journal of Heart Failure. 15 (1), 9-22 (2013).
- Kudej, R. K., et al. Effects of chronic beta-adrenergic receptor stimulation in mice. Journal of Molecular Cell Cardiology. 29 (10), 2735-2746 (1997).
- Zhuo, X. Z., et al. Isoproterenol instigates cardiomyocyte apoptosis and heart failure via AMPK inactivation-mediated endoplasmic reticulum stress. Apoptosis. 18 (7), 800-810 (2013).
- El-Demerdash, E., Awad, A. S., Taha, R. M., El-Hady, A. M., Sayed-Ahmed, M. M. Probucol attenuates oxidative stress and energy decline in isoproterenol-induced heart failure in rat. Pharmacology Research. 51 (4), 311-318 (2005).
- Rau, C. D., et al. Mapping genetic contributions to cardiac pathology induced by Beta-adrenergic stimulation in mice. Circulation Cardiovascular Genetics. 8 (1), 40-49 (2015).
- Berthonneche, C., et al. Cardiovascular response to beta-adrenergic blockade or activation in 23 inbred mouse strains. PLoS One. 4 (8), 6610(2009).
- Chang, S. C., Ren, S., Rau, C. D., Wang, J. J. Isoproterenol-Induced Heart Failure Mouse Model Using Osmotic Pump Implantation. Methods Molecular Biology. 1816, 207-220 (2018).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 282 (6), 2076-2083 (2002).
- Faulx, M. D., et al. Strain-dependent beta-adrenergic receptor function influences myocardial responses to isoproterenol stimulation in mice. American Journal of Physiology-Heart Circulation Physiology. 289 (1), 30-36 (2005).
- Zhang, G. X., et al. Cardiac oxidative stress in acute and chronic isoproterenol-infused rats. Cardiovascular Research. 65 (1), 230-238 (2005).
- Boluyt, M. O., et al. Isoproterenol infusion induces alterations in expression of hypertrophy-associated genes in rat heart. American Journal of Physiology. 269 (2), Pt 2 638-647 (1995).
- Hohimer, A. R., Davis, L. E., Hatton, D. C. Repeated daily injections and osmotic pump infusion of isoproterenol cause similar increases in cardiac mass but have different effects on blood pressure. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83 (2), 191-197 (2005).
- Cross, H. R., Murphy, E., Koch, W. J., Steenbergen, C. Male and female mice overexpressing the beta(2)-adrenergic receptor exhibit differences in ischemia/reperfusion injury: role of nitric oxide. Cardiovascular Research. 53 (2), 662-671 (2002).
- Klingman, G. I., McKay, G., Ward, A., Morse, L. Chronic isoproterenol treatment of mice: effects on catecholamines and rectal temperature. Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 798-801 (1973).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
