Мы предоставляем простой и эффективный метод для трансплантации 2'-деоксигуанозин лечение E18.5 тимуса в почечной капсуле обнаженной мыши. Этот метод должен помощник в изучении как тимоэпилитических клеток функции и Т-клеток созревания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Почечная субкапсулярная трансплантация 2'-Деоксигуанозин-обработанный Мурин Эмбриональный Тимус в обнаженных мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тимус является важным центральным иммунным органом, который играет важную роль в развитии и дифференциации Т-клеток. Трансплантация тимуса является важным методом для исследования функции тимических эпителиальных клеток и созревания Т-клеток in vivo. Здесь мы опишите экспериментальные методы, используемые в нашей лаборатории для трансплантации 2'-деоксигуанозин (для истощения лимфоцитов донора) лечение эмбрионального тимуса в почечную капсулу атимичной обнаженной мыши. Этот метод является простым и эффективным и не требует специальных навыков или устройств. Результаты, полученные с помощью этого простого метода показали, что пересаженный тимус может эффективно поддерживать производство Т-клеток реципиента. Кроме того, будут дополнительно прояснены некоторые ключевые моменты, касающиеся протокола.
Введение
Тимус является центральным иммунным органом, в тимоцитах тимуса проходят положительныйи отрицательный отбор, и становятся зрелыми Т-клетками 1,2. Аномальный положительный или отрицательный отбор приводит киммунодефициту или аутоиммунным патологиям соответственно 3,4. Поэтому трансплантация органов тимуса является важным подходом к изучению процесса отбора Т-клеток в тимусе донора. Этот метод особенно важен при анализе тимической эпителиальной функции, опосредоченной геннымимутациями, которые вызывают эмбриональный смертельный фенотип при мутации 5.
Для изучения созревания Т-клеток реципиента в пересаженном тимусе необходимо истощение лимфоцитов донора в тимфоцитах. Для этой цели, эмбриональный 14-, 15- или 16-дневный (E14, E15,E16) тимуса обычно выбирается 6,7. Тимус из более зрелых стадий также может быть успешно истощены лимфоцитов донора путем лечения 2'-деоксигуанозина. Однако подробный протокол для истощения лимфоцитов и использования более старойкультуры тимуса ранее не был описан 8,9. В то время как протоколы трансплантации были введены несколькими исследованиями10,11, дальнейшее изменение и совершенствование этих протоколов необходимо.
Наш протокол разделен на две части: i) истощение Т-лимфоцитов от поздней стадии развития E18.5 thymus культурой в 2'-деоксигуанозин-содержащих средств массовой информации. ii) трансплантация культивированных тимуса получателям. В этой процедуре мы разработали простой способ доставки большой ткани (E18.5 thymus) в почечную капсулу с пониженной вероятностью травмы почек. Сосредоточившись на поздней стадии тимуса, наш протокол также может быть использован непосредственно или с модификациями для трансплантации тимуса на различных стадиях развития или других аналогичных размеров тканей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Представленный протокол соответствует руководящим принципам комитета по этике Университета Цзинань в отношении ухода за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые материалы перечислены в таблице материалов.
1. Изоляция эмбрионального тимуса
- Автоклав ировать все хирургические инструменты перед экспериментом и стерилизовать скамейку/капюшон с 70% этанола.
- Использование углекислого газа, анестезия и эвтаназии беременной женской мыши (18,5 дней после успешного спаривания). Затем протрите область брюшной полости с 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы спаривались Insm1q/lac' женщин и Insm1q/lac' мужчин. Интраплазальное введение пентобарбитала проводилось до изоляции эмбрионов из матки и обезглавливания для каждого эмбриона. - Используя ножницы, сделать "V" формы сократить на животе, начиная с мочевого пузыря и работает до каждого рога матки.
- Используя ножницы, вырезать мезометр и шейку матки / влагалище, и собирать матку. Поместите матку в чашку Петри, содержащую холодный фосфат-буферный солен (PBS) на льду. Далее, разоблачить эмбрионы, которые находятся в окутанной decidua, путем разрезания передней стенки матки от одного рога матки к другому. Используя тонкие пинцеты, очистить назад окутанные ткани decidua и сократить пуповину, чтобы освободить эмбрионы. Поместите все эмбрионы в новое блюдо Петри на льду до изоляции тимуса.
- Протрите эмбрион с 70% алкоголя и поместите его в новое блюдо Петри. С этого шага убедитесь, что стерильные условия сохраняются.
- Разрезая ножницами нижнюю челюсть ножницами, снимите голову эмбриона и слейте кровь бумажным полотенцем. Затем зафиксировать эмбрион на той же чашке Петри в положении на спине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы вырезали кусок хвоста каждого эмбриона для Insm1 и лака генотипирования. - С помощью ножниц, вырезать боковую стенку груди горизонтально вдоль подмышечной передней, а затем вырезать диафрагму, чтобы открыть грудь. Теперь тимус должен быть виден как две белые доли, расположенные перед трахеей и прилегающие к сердцу.
- Поместите согнутые наконечникщицы за тимуса, а затем снять тимуса осторожно. Обязательно проверьте целостность тимуса, чтобы подтвердить, что он содержит две объединенные доли.
- Вымойте тимус с 1x PBS и обрезать соединительные ткани и кровеносные сосуды под стереомикроскоп.
2. Культура изолированного эмбрионального тимуса
- Добавьте 500 зЛ культуры среды (RPMI1640 и 15% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 100 U/mL пенициллин и 100 мкг /мл стрептомицина) к каждой скважине из 24-хорошо пластины. Перенесите чистый тими в колодцы с одним тимусом на скважину. На рисунке 1 отображается изолированный тимус в культурных носителях.
- К каждому тимус-содержащему хорошо добавить 2'-деоксигранозин к окончательной концентрации 1,25 мМ.
- Культура изолированных тимуса в течение восьми дней, освежая как культуры средств массовой информации и 2'-деоксигранозин каждые два дня.
3. Установить подкапсулянное пространство в почечной капсуле
- Для подготовки иглы и обрезанной инфузионной трубки(рисунок2), вырезать иглу вены кожи головы на трубе часть под углом 45 "с помощью ножниц.
- Взвесить обнаженную мышь, а затем анестезируют ее пентобарбиталом (1,5%) инъекция (75 мкг/г массы тела).
- Когда не наблюдается рефлекс ажиотажа, поместите мышь на операционный стол в правом боковом положении.
- С 0,5% повидон йод мазок, дезинфицировать кожу в два раза в хирургической области изнутри на внешнюю сторону тела.
- Используя ножницы, сделайте разрез кожи на 5-9 мм параллельно позвоночнику в левой области почек (между последним ребром и подвздошным гребнем). Затем откройте брюшную полость, прорезая подкожную ткань и мышцы и разоблачить почки.
- С почками подвергаются, используйте пару пинцета в одной руке, чтобы поднять мышцы и жировой ткани от позвоночника стороне края разреза. С другой стороны, аккуратно выжать почки из (альтернативно, почки могут быть выдавлина с помощью пальцев обеих рук).
- Для обеспечения влажной почечной капсулы во время операции, мокрые поверхности почки с сольником (0,9% NaCl).
- Создайте ник в капсуле почки, и аккуратно поцарапать почечной капсулы на нижней правой стороне с помощью кончика иглы подготовлены в шаге 3.1. Размер ник должен быть 1'2-2/3 ширины почки; не царапайте почку.
- Сдвиньте инфузионную трубку, приготовленную в шаге 3.1 в ник на почечной капсуле. Аккуратно разъедините почечную капсулу с почечной почкой вдоль длинной стороны почки до достижения 3-4 мм внутри почечной капсулы. Нарисуйте инфузионную трубку; устанавливается подкапсулянное пространство почек.
4. Трансплантация эмбрионального тимина thymus
- Вымойте тимуса культивируется в шаге 2,3 в два раза в солин истощать культуры средств массовой информации.
- Подключите обрезанную инфузионную трубку, подготовленную в шаге 3.1, к шприцу в его интерфейсе для подключения шприца. Медленно аспирируйте подготовленный тимус в инфузионную трубку.
- Аккуратно вставьте обрезанную инфузионную трубку в почечную капсулу и достигните верхнего полюса. Доставьте тимус в почечную капсулу; медленно втягивайте трубку, одновременно нажимая поршень шприца.
- Используя алкогольную лампу, слегка нагрейте иглу, приготовленную в шаге 3.1. После обеспечения того, чтобы весь тимус находится внутри подкапсулянного пространства, используйте нагретую иглу, чтобы прижречь ник.
- После прижь, восстановить почки в брюшной полости. Шов перитонеума и мышцы.
- Используя модифицированный прерванный вертикальный шв матраса, закройте разрез кожи (свяжите не менее трех узлов и отрежьте излишки нити).
- Используя мазок йода, дезинфицировать разрез. Для облегчения боли во время операции была проведена подкожная инъекция флинкина (2 мкг/г массы тела), а затем в течение 3 дней после операции.
- До полного оправившись от анестезии, держите мышь теплой под инфракрасной лампой.
- Держите тимус в капсуле почки реципиента в течение 8 недель, прежде чем вскрыть пересаженный тимус и проведение фенотипического анализа, как ранее описано5,8,9.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы покажем изолированные E18.5 тимуса, содержащие две полные доли(Рисунок 1). Кроме того, мы показываем иглы вены кожи головы, которая была обрезана, чтобы сформировать скобы на инфузионной трубке(рисунок 2). Далее мы также показываем репрезентативное изображение положения тимуса, который был пересажен в почечную капсулу(рисунок 3A) и тимуса после 8 недель роста в мышах-реципиентах (рисунок3B). Чт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Почечная субкапсулулярная трансплантация эмбрионального тимуса является важным методом изучения функции тимических эпителиальных клеток и процесса созревания Т-клеток в vivo. Хотя Есть несколько экспериментальных исследований по эмбриональной культуры органов тимуса и трансплантации6,7, наш протокол обеспечивает простую альтернативную процедуру на мурин эмбриональной тимуса культуры и почечной подкапсулы трансплантации для старых тканей тимуса.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликта интересов не было заявлено.
Благодарности
Эта работа была поддержана стартовым пакетом Университета Цзинаня в S.J. и Научно-технической программой Гуанчжоу Китая (Грант No 2017040209 в S.J.). Мы благодарим Эми Ботту (Департамент биологии, йоркский университет, Торонто, ON M3J 1P3, Канада) за коррективы и редактирование рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5% повидон-йод | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0,9% хлорида натрия для инъекций | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 мл стерильный шприц | Solarbio | YA1090 | |
| 2'-дезоксигуанозин | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 с использованием (окончательный 1,25mM) |
| 24 Луночный планшет | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Иглы для хирургических швов с нитью | Нинбо Ченг-Хе Фабрика микрохирургических инструментов Китай | YY0166-2002 | |
| 60 мм Чашка для клеточных культур | Corning Incorporated | 430166 | |
| APC антимышиные антитела CD8a | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Тонкие щипцы с изогнутым концом, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JD1060 | Для стерилизации перед использованием |
| цефметазола натрия для инъекций | Sichuan Hexin Pharmaceutical Co,Ltd | 17062111 079 | 6 мг в 0,5 мл 0,9% раствор NaCl, 7,5 мкл/г массы тела |
| Ножницы для препарирования, JZ 10 см | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JC2303 | Стерилизовать перед применением |
| фетальную бычью сыворотку (FBS? | GIBCO | 10270-106 | |
| Тонкие щипцы, JZ 10 см | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | JD1050 | Для стерилизации перед использованием |
| Проточная цитометрия | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1 мг в 1 мл 0,9% раствор NaCl, 2 мкл/г массы тела |
| Щипцы, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | Для стерилизации перед использованием |
| Инфракрасная лампа | OTLAN | MT-810 | |
| Иглодержатель, JZ 14 см | Шанхайская группа медицинских устройств Co., Ltd. | J32010 | Для стерилизации перед применением |
| ПЭ антимышиный CD4 Biolegend | 100511 | 1:100 | |
| Пенициллин-стрептомициновая смесь | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Пентобарбитала натриевая соль | Sigma | P3761 | 1,5% раствор в PBS, 75 мкг/г массы тела |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Игла | для кожи головыShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Пружинные ножницы | VANNAS | S11014-12 | Для стерилизации перед использованием |
| стереомикроскоп | OLYMPUS | SZ61 | |
| Стерильный ватный тампон 15 см | Гуанчжоу Хаочжэн | 20150014 | |
| Стерильная марля 5 см x 7 см-8P | Гуанчжоу Хаочжэн | 20172640868 | |
| Стерильный PBS (1x) | GENOM | ||
| , JZ 12,5 см | Shanghai Medical Devices Group Co., Ltd. | J41010 | Стерилизовать перед применением |
Ссылки
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
