В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.
Введение
Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC4. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейроно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные здесь методы были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Национального руководства по охране здоровья по уходу и использованию лабораторных животных, предоставленными Институтом лабораторных ресурсов животных, и были одобрены Институциональный комитет по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.
Все инструменты и оборудование для методов показаны на рисунке 1 и перечислены в таблицематериалов.
1 . Мышь глаз энуклеации, рассечение чашки глаз, и встраивание
- Эвтаназия мышей суглекислым газом (CO 2), а зат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы проиллюстрировать, как эти протоколы, обеспечить оптимальное сохранение сетчатки для IHC, мы исследовали участки сетчатки от p28 WT мышей (C57BL/6N) с антителами к родопсину (маркер фоторецептора)8, глутаминовой кислотой decarboxylase 65 (Gad65, амакринная клетка маркер)9, глутамин синтезаза (GS, маркер клетки Мюллера)10, и calbindin (горизонтальный маркер клетки)11 (.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и советов является необходимостью получения секций сетчатого и IHC. В дополнение к протоколам, описанным здесь, есть несколько советов, которые позволяют последовательно высокого качества сетточной секции, которые подходят для воспроизводимых IHC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Никаких разоблачений.
Благодарности
Эта работа была поддержана средствами NIH (RO1-GMO97327) и Университетского исследовательского фонда (UPenn). Мы особенно благодарим Светлану Савину за помощь в разработке протокола иммуногистохимии, Гордона Рутеля (Университет Пенсильвании) и Ядро визуализации ветеринаров Пенна за помощь в микроскопии и Лесли Кинг, доктор философии, за критическое чтение этой рукописи .
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-литровый стакан из нержавеющей стали (185 x 218 мм) | Gilson | #MA-48 | Для жидкого азота (Рисунок 1E) |
| Алюминиевая фольга | |||
| Прижигатель | Бови | #AA01 | Для обозначения ориентации глаз (Рисунок 1A) |
| Изогнутые щипцы, пинцет Dumont #5/45, согнутый под углом 45 градусов; | Электронная микроскопия | Sciences#72703-D | Для энуклеации и поддержания глаз мышей (Рисунок 1A) |
| Изогнутые ножницы, пружинные ножницы Vannas - режущая кромка 2,5 мм | Инструменты для изобразительной науки | #15002-08 | Для надреза роговицы по окружности (Рисунок 1B) |
| Стоматологическая препаративная чашка | для вскрытия наглазника (Рисунок 1C) | ||
| Препарирующий микроскоп | Leica, Хьюстон, США | MZ12.5 Высокопроизводительный микромикроскоп Микроножи | |
| - Пластиковая ручка | Инструменты для изобразительной науки | #10315-12 | Сделать небольшой разрез на месте ожога (Рисунок 1А) |
| Розовый зубной воск | Электронная микроскопия Наук | #72660 | Тарелка для препарирования покрытий |
| Тед Пелла | #36107 | Для сетчатки ИГХ (Рисунок 1G) | |
| Стакан из нержавеющей стали (89 x 114мм) | Gilson | #MA-40 | Для изопентановой ванны (Рисунок 1E) |
| Пенополистирольная коробка | Для изолированного холодильника | ||
| Тонкие щипцы Dumont #5 | Инструменты для изобразительной науки | #11254-20 | Для удаления роговицы и извлечения хрусталика (Рисунок 1B) |
| Cryomold (10 мм x 10 мм x 5 мм) | Наука об электронной микроскопии | #62534-10 | Форма для закладки |
| ОКТБуферы и реагенты | Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| Блокирующий раствор | 2% Нормальная лошадиная сыворотка, 1,5% Желатин холодной рыбьей кожи (40-50% в H2O, кош. #G7765), 5% бычий сывороточный альбумин (кат. #AK1391-0100) в буфере для пермеабилизации. | ||
| Гельватол (антивыцветающий монтажный материал) | Под вытяжным шкафом растворите 0,337 г DABCO (Sigma cat #D2522-25G) в 10 мл Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Отрегулируйте pH до 8-8,5 с 12N HCl (~ 5 капель). Хранить в флаконе с янтарными каплями при температуре 4° С (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 мг/мл в PBS (1000x). Аликвот и хранить в темноте, при температуре 4°С; C на срок до 1 года или при -20°С; C для длительного хранения. Готовим свежие при 1 мкг/мл (1x) |
| Изопентан, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| жидкого азота | |||
| (PFA) в PBS | Electronic Microscopy Sciences | #15710 | Готовый свежий 4% PFA из 16% запаса PFA. Храните оставшиеся 16% PFA при температуре 4° C в темноте. |
| для пермеабилизации | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Готовьте свежие. | ||
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 г/л KCl, 0,02 г/л KH2PO4, 0,8 г/л NaCl, 0,216 г/л Na2HPO4, pH 7,4. Готовится из 10x бульона |
| Растворы сахарозы | Fisher Scientific | #S-5-500 | Растворите соответствующее количество сахарозы в 37°°; C PBS (требуется ~15 минут для растворения). Может храниться в течение нескольких дней при температуре 4 |
| Ткань-Тек ОКТ-соединение | Сакура& | nbsp;#4583 | |
| Антитела< | strong>Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| антикальбиндин | Sigma-Aldrich | C8666 | Для маркировки клеток горинзоталя |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Для маркировки ГАМКергических амакриновых клеток |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | Для маркировки Mü Клетки |
| антиродопсин | Millipore | MAB5316 | Для маркировки стержней |
Ссылки
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
