В настоящем докладе описаны комплексные методы подготовки замороженных секций сетчатки мыши для иммуногистохимии (IHC). Описанные методы включают вскрытие глазной задней чашки, параформальдегидная фиксация, встраивание в оптимальную температуру резки (OCT) носителей и ориентации тканей, секционирование и иммуностоирование.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка крио-секций мышиной подвздошной сыки для иммуногистохимии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Подготовка высококачественных секций глаз мыши для иммуногистохимии (IHC) имеет решающее значение для оценки структуры и функции сетчаточной системы и для определения механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчаточной железы. Поддержание структурной целостности на протяжении всей подготовки ткани имеет жизненно важное значение для получения воспроизводимых данных IHC сетчатого, но может быть сложной задачей из-за хрупкости и сложности цитоархитектуры сетчаточной системы. Сильные фиксаторы, как 10% формалин или решение Буин оптимально сохранить структуру сетчатки, они часто препятствуют анализУ IHC путем повышения фоновой флуоресценции и / или уменьшение антител-эпитопов взаимодействий, процесс, известный как эпитоп маскировки. Мягкие фиксаторы, с другой стороны, как 4% параформальдегида, снижает фоновой флуоресценции и эпитоп-маскировки, тщательные методы вскрытия должны быть использованы для сохранения структуры сыворотки. В этой статье мы представляем комплексный метод подготовки мыши глазной задней чашки для IHC, что достаточно, чтобы сохранить большинство антител-эпитоп взаимодействия без потери структурной целостности сетчатых. Мы включаем представительный IHC с антителами к различным маркерам типа сетчаточных клеток, чтобы проиллюстрировать сохранение тканей и ориентацию в оптимальных и неоптимальных условиях. Наша цель заключается в оптимизации IHC исследований сетчатки путем предоставления полного протокола от глазной задней чашки вскрытия IHC.
Введение
Иммуногистохимия (IHC) является мощным методом для локализации конкретныхбелков и клеточных структур в тканях на месте 1,2,3. Неуместные методы фиксации и субоптимальное сечение сложных тканей могут нарушить структуру тканей, генерировать высокие фоновые окрашивания или уменьшать антитела-эпитопные взаимодействия, что приводит к окрашиванию артефактов и последующему неправильному толкованию Данные IHC4. Поскольку позвоночную сетчатку является сложным и высокоорганизованным нервным органом, состоящим из слоев взаимосвязанных фоторецепторов, интернейронов и ганглия-клеток, она очень хрупкая и может быть легко нарушена во время вскрытия и секции. Подробный, стандартизированный и проверенный протокол от вскрытия глаз мыши и ориентации на иммуно-стоикирование поможет значительно уменьшить iHC артефакты, тем самым повышая надежность результатов и позволяя более точные сравнительные данные Анализа.
Есть много протоколов для подготовки тканей для IHC, однако, не все подходят для ткани сетчатины. Сильные фиксаторы, такие как 10% формалин или решение Bouin сохранить структуру сытины во время вскрытия и секции5. К сожалению, сильные фиксаторы часто приводят к усиленной фоновой флуоресценции и маскировке эпитопов из-за химической модификации эпитопов6. С другой стороны, более мягкие фиксаторы, как 4% параформальдегида (PFA) может облегчить некоторые из этих артефактов, но требуют тщательного вскрытия и сечения, чтобы сохранить оптимальную структуру сетчатого глаза. ПФА быстро проникает в ткани, но перекрестные белки очень медленно, снижая риск маскировки эпитопа. Поскольку короткое время инкубации ПФА является относительно мягкой фиксации, ткани часто требуют быстрого замораживания для сохранения антигенов. Важно, чтобы избежать образования кристалла льда во время замораживания тканей, как они искажают и повреждения целостности клеток и тканей7.
Здесь мы описываем подробные и стандартизированные протоколы для вскрытия, фиксации и криозащиты мыши глазных задних чашек, которые дают последовательные и надежные данные IHC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные здесь методы были выполнены в строгом соответствии с рекомендациями Национального руководства по охране здоровья по уходу и использованию лабораторных животных, предоставленными Институтом лабораторных ресурсов животных, и были одобрены Институциональный комитет по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.
Все инструменты и оборудование для методов показаны на рисунке 1 и перечислены в таблицематериалов.
1 . Мышь глаз энуклеации, рассечение чашки глаз, и встраивание
- Эвтаназия мышей суглекислым газом (CO 2), а затем либо обезглавливание (послеродовые мыши P0 - P11) или вывих шейки матки (взрослые мыши и p11). Для мышей P0-P14 глаза покрыты кожей. Убедитесь, что удалить кожу до последующих шагов.
- Отметьте височной части глаза(рисунок 2A) слегка сжигая роговицу с помощью хвостового каутеризатора. Избегайте сжигания отверстия в роговицы, касаясь роговицы очень легко и не более чем на долю секунды с cauterizer.
- Немедленно энуклират ные глаза мыши с помощью изогнутых Дюмон #5/ 45 щипцы. Инкубировать в течение 15 минут в 1,5 мл криотрубки с 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в фосфат-буферированном сольнике (PBS) на льду.
- После 15 мин в 4% PFA, передача фиксированного глаза с помощью изогнутых щипцы Дюмон #5/45 в измененном 35 мм вскрытия блюдо (см. Таблица материалов и Рисунок 1C) заполнены PBS и место под рассекречивающим микроскопом.
- Сделайте небольшой разрез на ожоговой отметке, перпендикулярно и чуть выше лимба (граница роговицы) с помощью микро-нож.
- Вставьте изогнутые ножницы в разрез и выполните окружной разрез роговицы после лимба(рисунок 2B).
- Снимите роговицу и извлечь линзу с тонкой Дюмон #5 щипками,(Рисунок 2B) и поднимите его деликатно от задней части глаза. Стекловидное тело, прозрачный гель, который заполняет пространство между объективом и сетчаткой, выйдет с объективом(Рисунок 2B) и сетчатки будут видны как белая поверхность, покрывающая внутреннюю часть задней чашки глаза. Убедитесь, что нет никаких видимых повреждений сетчатки, таких как отверстия или слезы(рисунок 2C).
- Вымойте глазные чашки дважды в 1 мл PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Криозащита глаз чашки, уравновешись их в растворе 15% сахарозы в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию, пока глаз чашка раковины
- Передача глаз чашки 30% сахарозы в PBS для 2-3 ч, пока глаз чашка тонет.
- Встраивайте чашки глаз в OCT в криомолды 10 x 10 мм(рисунок 3A). Используя рассекающий микроскоп, ориентируйте глаз в криомольде вдоль его рстально-вентральной оси(Рисунок 2D, Рисунок 3A) при повороте глаза, пока след ожога находится на вершине, зрительный нерв находится слева и вырезанная часть плесени стоит справа ( Рисунок 2D). Позаботьтесь, чтобы избежать пузырьков вблизи ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы манипулировать глазчашкой, используйте титановый зонд из титановой проволоки, прикрепленной к кончику пипетки. - Чтобы заморозить ткани сытинальной ткани, погрузите криомольд в течение по крайней мере 5 мин в металлический стакан, содержащий изопентан и поместите стакан в жидкий азот или сухой лед /100% этанол ванны (до 1/3 от высоты металлического стакана).
ПРИМЕЧАНИЕ: Криомольд должен быть погружен в изопентан больше половины своей высоты, но не должен быть полностью погружен. - Снимите замороженный блок и заверните его в алюминиевую фольгу.
- Хранить при -80 градусах по Цельсию.
- Отметьте замороженный блок с помощью ручки или резкости для записи ориентации блока(рисунок 3B).
2 . Секция с использованием криостата
- После регулировки криостатной температуры (от -20 до -25 градусов по Цельсию) позвольте плесеням, содержащим встроенные чашки для глаз, уравновеситься до температуры криостата в течение 1 ч.
- Установите блок с дорсо-вентральной ориентации(рисунок 3C) и вырезать 10 мкм толщиной серийных разделов. Аккуратно поместите участки сытов для стины на аннотированных и пронумерованных слайдах микроскопа.
- Храните слайды в слайд-боксах при -20 градусах по Цельсию или -80 градусов до процедур IHC.
3 . Флуоресценция иммуностоинга с помощью слайд-стойки
ПРИМЕЧАНИЕ: Система Slide Rack (например, Sequenza) содержит слайды стеклянного микроскопа с крышкой пластины, создавая капиллярный зазор в размере 100 евро между слайдом и пластиной.
- Оттепель криосекций при комнатной температуре (RT) на 2 ч до 4 ч, чтобы позволить им высохнуть и прикрепить к микроскопу слайды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также высушить их при 30-37 градусах по Цельсию в течение 30 мин до 1 ч. - Поместите слайды в Слайд Стойка и мыть секции сыворотки дважды в 100-200 Л Л. PBS в течение 2 минут.
- Пермяки ретинальных секций путем инкубации их в 0,25% Triton-X / 0,05% NaN3в PBS в течение 5 минут на RT.
- Добавьте 100 зл блокирующего раствора на слайды.
- Добавьте 100 л первичных антител, разбавленных в блокирующем растворе на слайдах.
- Инкубировать участки ретины на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени, крышка слайд Стойка, чтобы избежать высыхания разделов. - Вымойте секции сытов 3 раза, каждый в течение 15 минут, используя 200 Л Л PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 0,001- 0,002% Triton-X100 к PBS (PBS-T) позволяют более строгие мыть, но может нарушить некоторые мембраны и клеточные структуры. - Инкубировать участки сеттины в флуоресцентных маркировке вторичных антител в течение 1 ч на RT. Отныне защитите от света.
- Вымойте секции сытов 3 раза, каждый в течение 15 минут.
- Инкубировать участки сытов в/рейко на РТ в течение 5 минут с ядерным маркером, таким как Hoechst 33342 или DAPI решение.
- Вымойте участки сытины 1 раз в течение 15 минут.
- Поместите крышку на верхней части бумажного полотенца на скамейке лаборатории.
- Добавьте 2 капли антиугасающих монтажных носителей в центр coverslip.
- Переверните слайд, чтобы иметь крио-сечение с вышек.
- Тщательно смонтируйте крышку медленно, под углом 45, наклоняйте слайд на монтажные носители.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегая формирования пузырьков, как вы опустите слайд на месте. - Применить даже давление, используя тяжелую книгу или каталог (см. ниже), к слайд-coverslip комбинации для устранения избыточного монтажа средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения согласованности в подготовке образца, всегда используйте один и тот же объект (т.е. одну и ту же книгу или каталог), чтобы применить даже давление на обложку во время монтажа слайда. - Держите плоский и дайте затвердеть на ночь на RT в темноте. Хранить слайды плоские при 4 градусах по Цельсию на неопределенный срок.
- Изображение с помощью широкой полевой или конфокальной флуоресценции микроскопии(рисунок 4).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы проиллюстрировать, как эти протоколы, обеспечить оптимальное сохранение сетчатки для IHC, мы исследовали участки сетчатки от p28 WT мышей (C57BL/6N) с антителами к родопсину (маркер фоторецептора)8, глутаминовой кислотой decarboxylase 65 (Gad65, амакринная клетка маркер)9, глутамин синтезаза (GS, маркер клетки Мюллера)10, и calbindin (горизонтальный маркер клетки)11 (...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рассечение сетчатки мыши является деликатным процессом из-за небольшого размера и формы мыжеток и хрупкости ткани сетчатки. Несмотря на то, что выполнение высококачественного вскрытия является вопросом практики, наличие детального протокола, предоставление эффективных методов и советов является необходимостью получения секций сетчатого и IHC. В дополнение к протоколам, описанным здесь, есть несколько советов, которые позволяют последовательно высокого качества сетточной секции, которые подходят для воспроизводимых IHC.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Никаких разоблачений.
Благодарности
Эта работа была поддержана средствами NIH (RO1-GMO97327) и Университетского исследовательского фонда (UPenn). Мы особенно благодарим Светлану Савину за помощь в разработке протокола иммуногистохимии, Гордона Рутеля (Университет Пенсильвании) и Ядро визуализации ветеринаров Пенна за помощь в микроскопии и Лесли Кинг, доктор философии, за критическое чтение этой рукописи .
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-литровый стакан из нержавеющей стали (185 x 218 мм) | Gilson | #MA-48 | Для жидкого азота (Рисунок 1E) |
| Алюминиевая фольга | |||
| Прижигатель | Бови | #AA01 | Для обозначения ориентации глаз (Рисунок 1A) |
| Изогнутые щипцы, пинцет Dumont #5/45, согнутый под углом 45 градусов; | Электронная микроскопия | Sciences#72703-D | Для энуклеации и поддержания глаз мышей (Рисунок 1A) |
| Изогнутые ножницы, пружинные ножницы Vannas - режущая кромка 2,5 мм | Инструменты для изобразительной науки | #15002-08 | Для надреза роговицы по окружности (Рисунок 1B) |
| Стоматологическая препаративная чашка | для вскрытия наглазника (Рисунок 1C) | ||
| Препарирующий микроскоп | Leica, Хьюстон, США | MZ12.5 Высокопроизводительный микромикроскоп Микроножи | |
| - Пластиковая ручка | Инструменты для изобразительной науки | #10315-12 | Сделать небольшой разрез на месте ожога (Рисунок 1А) |
| Розовый зубной воск | Электронная микроскопия Наук | #72660 | Тарелка для препарирования покрытий |
| Тед Пелла | #36107 | Для сетчатки ИГХ (Рисунок 1G) | |
| Стакан из нержавеющей стали (89 x 114мм) | Gilson | #MA-40 | Для изопентановой ванны (Рисунок 1E) |
| Пенополистирольная коробка | Для изолированного холодильника | ||
| Тонкие щипцы Dumont #5 | Инструменты для изобразительной науки | #11254-20 | Для удаления роговицы и извлечения хрусталика (Рисунок 1B) |
| Cryomold (10 мм x 10 мм x 5 мм) | Наука об электронной микроскопии | #62534-10 | Форма для закладки |
| ОКТБуферы и реагенты | Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| Блокирующий раствор | 2% Нормальная лошадиная сыворотка, 1,5% Желатин холодной рыбьей кожи (40-50% в H2O, кош. #G7765), 5% бычий сывороточный альбумин (кат. #AK1391-0100) в буфере для пермеабилизации. | ||
| Гельватол (антивыцветающий монтажный материал) | Под вытяжным шкафом растворите 0,337 г DABCO (Sigma cat #D2522-25G) в 10 мл Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01). Отрегулируйте pH до 8-8,5 с 12N HCl (~ 5 капель). Хранить в флаконе с янтарными каплями при температуре 4° С (8). | ||
| Hoechst 33342 1000x Stock | Thermo Scientific | #62249 | 1 мг/мл в PBS (1000x). Аликвот и хранить в темноте, при температуре 4°С; C на срок до 1 года или при -20°С; C для длительного хранения. Готовим свежие при 1 мкг/мл (1x) |
| Изопентан, 99% | GFS Chemicals | #2961 | |
| жидкого азота | |||
| (PFA) в PBS | Electronic Microscopy Sciences | #15710 | Готовый свежий 4% PFA из 16% запаса PFA. Храните оставшиеся 16% PFA при температуре 4° C в темноте. |
| для пермеабилизации | PBS + 0,25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05% NaN3. Готовьте свежие. | ||
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Bioworld | #41620015-20 | 0,02 г/л KCl, 0,02 г/л KH2PO4, 0,8 г/л NaCl, 0,216 г/л Na2HPO4, pH 7,4. Готовится из 10x бульона |
| Растворы сахарозы | Fisher Scientific | #S-5-500 | Растворите соответствующее количество сахарозы в 37°°; C PBS (требуется ~15 минут для растворения). Может храниться в течение нескольких дней при температуре 4 |
| Ткань-Тек ОКТ-соединение | Сакура& | nbsp;#4583 | |
| Антитела< | strong>Company | Номер в каталоге | >Комментарии |
| антикальбиндин | Sigma-Aldrich | C8666 | Для маркировки клеток горинзоталя |
| anti-GAD65 | Chemicon | AB5082 | Для маркировки ГАМКергических амакриновых клеток |
| anti-GS | BD Transduction | 610517 | Для маркировки Mü Клетки |
| антиродопсин | Millipore | MAB5316 | Для маркировки стержней |
Ссылки
- Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
- Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
- Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
- Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
- Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
- Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
- Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
- Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
- Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
- Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
