Method Article

Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описано здесь протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечника человека микробиоты с использованием in vitro пакетных систем брожения.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроорганизмы кишечника человека в последнее время стали важной целью исследований в области укрепления здоровья человека и профилактики заболеваний. Следовательно, исследования взаимодействия между эндобиотиками (например, препаратами и пребиотиками) и микрофлорой кишечника стали важной темой исследования. Тем не менее, эксперименты in vivo с человеческими добровольцами не являются идеальными для таких исследований из-за биоэтики и экономических ограничений. В результате, животные модели были использованы для оценки этих взаимодействий in vivo. Тем не менее, исследования моделей на животных по-прежнему ограничены соображениями биоэтики, в дополнение к различным композициям и разнообразию микробиоты у животных по сравнению с людьми. Альтернативной стратегией исследования является использование пакетных экспериментов брожения, которые позволяют оценить взаимодействия между эндобиотиками и кишечной микробиотой in vitro. Для оценки этой стратегии, бифидобактерии (Bif) экзополисахариды (EPS) были использованы в качестве представителя ксенобиотик. Затем взаимодействия между Bif EPS и микрофлорой кишечника человека были исследованы с помощью нескольких методов, таких как тонкослойная хроматография (TLC), бактериальный композиционный анализ сообщества с 16S rRNA гена высокой пропускной способности секвенирования, и газовой хроматографии короткоцепочечных жирных кислот (СКФО). Представлен протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечной микрофлоры кишечника человека с использованием in vitro пакетных ферментации систем. Важно отметить, что этот протокол также может быть изменен для изучения общих взаимодействий между другими эндобиотиками и кишечной микробиотой.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микробиота кишки играет важную роль в функционировании кишечника человека и в здоровье хозяина. Следовательно, кишечная микробиота в последнее время стали важной мишенью для профилактики заболеваний и терапии1. Кроме того, кишечные бактерии взаимодействуют с клетками кишечника и регулируют фундаментальные процессы пребывания, включая метаболическую деятельность, наличие питательных веществ, модуляцию иммунной системы и даже функцию мозга и принятие решений2,3 . Эндобиотики обладают значительным потенциалом для влияния на бактериальный состав и разнообразие кишечной микробиоты. Таким обр....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике Хунаньского университета науки и инженерии (Хунань, Китай) и Университета Чжэцзян Гуншань (Чжэцзян, Китай).

1. Подготовка бактерий

  1. Приготовление бифидобактерий среднего бульона
    1. Смешайте следующие компоненты в 950 мл дистиллированной воды: экстракт мяса, 5 г/л; дрожжевой экстракт, 5 г/л; казеин пептон, 10 г/л; соевого, 5 г/л; глюкоза, 10 г/л; K2HPO4, 2.04 г/l; MgSO47H2O, 0,22 г/л; MnSO4. Н20, 0,05 г/л; NaCl, 5 г/л; Твина 80, 1 мл; соляной раствор, 40 мл (CaCl2.2H2O, 0.25 г/л; ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство слизистой ОБОЛОЧКи может наблюдаться в B. longum культур на PYG пластин после анаэробной инкубации для 72 ч (рисунок1A). Центрифугация культуры царапин, а затем этанола осадков и высыхания, привело к сбору целлюлозы, как EPS (Рисунок 1B). Сушеные EPS и растворимый крахмал затем использовались в качестве источников углерода для культур брожения. TLC был использован для олигосахарида разделения и анализа чистоты из-за его низкой стоимости и б.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании состава и деятельности микрофлоры кишечника человека. Как следствие этих исследований, концепция голобиона возникла, которая представляет собой взаимодействие между хостом и связанных с ними микробных сообществ, таких как между людьми и их кишечной микробиоты19,20. Кроме того, люди даже в настоящее время рассматривается как суперорганизмы21, в котором кишечная микроби.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Цифры были приведены в Инь и др. 11.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано Национальным фондом естественных наук Китая (No 31741109), Фондом естественных наук Хунаня (No 2018JJ3200), а также программой строительства прикладной характерной дисциплины в Хунаньском университете науки и техники. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь в подготовке этой рукописи.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 & микро; m мембранные фильтрыMilliporeSLGP033RBИспользовать для фильтрации образцов
0,4 мм СитоThermo Fischer308080-99-1Использовать для подготовки образцов фекалий человека
5-бром-4-хлор-3-индолил&бета;-D-галактопиранозид (X-Gal)SolarbioX1010Использовать для подготовки цветной пластины
УксуснаяSigma-Aldrich71251Стандартный образец для КЦЖК
АгарSolarbioYZ-1012214Компонент средней
анаэробной камерыElectrotek AW 400SGАвтоклав для культивирования и ферментации бактерий
SANYOMLS-3750Использование для автоклавирования
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178Компонент среды
Печь для выпечкиShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AИспользование для нагрева и запекания
Экстракт говядиныSolarbioG8270Компонент среды
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™бактерии
Желчные солиSolarbioYZ-1071304Компонент масляной
Sigma-Aldrich19215Стандартный образец для SCFA
CaCl2SolarbioC7250Раствор соли среднего
капиллярного столбикаSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 мм × 30 м × 0,25; m)Используется для обнаружения SCFA
казеина ПептонSigma-Aldrich39396Компонент средней
центрифугиThermo ScientificSorvall ST 8Используется для центрифугирования
CoSO4.7H2OSolarbioC7490Компонент среды
CuSO4.5H2OSolarbio203165Компонент среды
Цистеин-HClSolarbioL1550Компонент среды
этанолаSigma-AldrichE7023Использовать для приготовления витамина K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614Компонент среды
Муравьиная кислотаSigma-Aldrich399388Используется для TLC
Газовая хроматографияShimadzu CorporationGC-2010 PlusИспользуется для обнаружения SCFA
Стеклянный стаканFisher ScientificFB10050Используется для приготовления суспензии
ГлюкозаSolarbioG8760Компонент среды
HaeminSolarbioH8130Компонент среды
HClSigma-Aldrich30721Основной раствор, используемый для регулировки pH буферов
ИзомасляныйSigma-Aldrich46935-UСтандартный образец для SCFA
Изовалериановые кислотыSigma-Aldrich129542Стандартный образец для SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Раствор соли среды
KClSolarbioP9921Компонент среды
KH2PO4SolarbioP7392Раствор соли среды
LiCl.3H2OSolarbioC8380Использовать для приготовления цветной тарелки
Мясной экстрактSigma-Aldrich-Aldrich70164Компонент среды
Метафосфорная кислотаSigma-AldrichB7350Стандартный образец для SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160Компонент среды
MgSO4.7H2OSolarbioM8300Раствор соли среды
MISEQMiSeq 300PE системасеквенирования ДНК
MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Раствор соли среды
MupirocinSolarbioYZ-1448901Антибиотик
NaClSolarbioYZ-100376Раствор соли среды
NaHCO3Sigma-Aldrich792519Раствор соли среды
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Определение концентраций в ДНК
NaOHSigma-Aldrich30620Основной раствор, используемый для регулировки pH буферов
n-бутанолChemSpider71-36-3Используемый для ТС
NiCl2Solarbio746460Компонент среды
орцинолаSigma-Aldrich447420Используется для приготовления орциновых реактивов
ПропионовыйSigma-Aldrich94425Стандартный образец для SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Экстракт бактериальной геномной ДНК
Готовый к использованию порошок PBSSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Используется для приготовления липидной суспензии
ResazurinSolarbioR8150Анаэробное оборудование
Скоростной вакуумный концентраторLABCONCOCentriVapИспользуется для приготовления EPS
крахмалаSolarbioYZ-140602Используется в качестве источника углерода
Серная кислотаSigma-Aldrich150692Используется для приготовления орциновых реагентов
T100 PCRBIO-RADПЦР амплификация
TLC алюминиевые листыMerckMillipore116835используется для TLC
Триптиказ пептонSigma-AldrichZ699209Компонент среды
ТриптонSigma-AldrichT7293Компонент среды
Tween 80SolarbioT8360Раствор соли среды
ValericSigma-Aldrich75054Стандартный образец для SCFA
Витамин K1Sigma-AldrichV3501Компонент среднего
вихревого осциллятораScientific IndustriesVortex.Genie2Использование для вихревого
дрожжевого экстрактаSigma-AldrichY1625Компонент среды
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251Компонент среды
среды 1861096

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personalit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles