Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59731

⸱

24 мая 2019 г.

 , 
1Division of Immunology, Allergy, and Rheumatology, Department of Internal Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для подготовки апоптозных тимоцитов и перитонеальных макрофагов и анализировать эффективность эффофоцитоз и конкретных ингибитор-опосредованной блокировки апоптотического тимоцитов поглощает. Этот протокол имеет широкое применение в клеточной опосредованной зазор других частиц, включая искусственные бусы и бактерии.

Аннотация

Апоптоз клеток является естественный процесс и играет решающую роль в эмбрионального развития, гомеостатическое регулирование, индукции иммунной толерантности, и разрешение воспаления. Накопление апоптотического мусора в организме может вызвать хронические воспалительные реакции, которые приводят к системным аутоиммунным заболеваниям с течением времени. Нарушенного апоптотического клеточного допуска был замешан в различных аутоиммунных заболеваний. Апоптотический зазор – это сложный процесс, который редко обнаруживается в физиологических условиях. Она включает в себя обильные поверхностные рецепторы и сигнальные молекулы. Изучение процесса апоптотического клеточного расчистки обеспечивает проницательные молекулярные механизмы и последующие биологические реакции, которые могут привести к развитию новых терапевтических средств. Здесь мы описываем протоколы для индукции апоптотических тимоцитов, подготовку перитонеальных макрофагов, а так же анализ апоптотических клеточных расчистки по течению цитометрии и микроскопии. Все клетки будут подвергаться апоптозу на определенном этапе, и многие жилые и циркулирующих клеток может поглощения апоптотического мусора. Таким образом, описанный здесь протокол может быть использован во многих приложениях для характеризации апоптотического клеточного связывания и проглатывания многими другими типами клеток.

Введение

Наше тело генерирует 1-10 миллиард апоптотических клеток на ежедневной основе. Такое большое количество апоптотических клеток должно быть очищено таким образом, что иммунные реакции остаются покоя. Для обеспечения очистки апоптотических клеток своевременно, многочисленные виды тканей резидентов клеток и циркулирующих клеток разработать механизмы, чтобы поглотить апоптотических клеток1. Дисфункциональные регулирование апоптоза был замешан в возникновении и прогрессирования различных воспалительных заболеваний и аутоиммунитет2. Апоптоз также играет решающую роль в патогенезе развития рака и его последующее сопротивление традиционным лечения3,4. Удаление апоптотических клеток обычно способствует противовоспалительной реакции, которые могут быть связаны с иммунологической толерантности5. Нарушение апоптотического клеточного расчистки стимулирует самоиммунизацию и способствует развитию системных аутоиммунных заболеваний как у людей, так и у мышей6.

Когда клетки проходят апоптоз, они подвергают воздействию фосфатидилсерина (Птдзер) из внутренней листки в внешнюю брошюру мембраны. Птдзер будет распознан фагоцитами через поверхностные рецепторы. Более десятка рецепторов были определены распознавать и/или способствовать поглощает апоптозных клеток. В общем, есть по крайней мере три типа поверхностных рецепторов, участвующих в апоптосной клеточной очистки: привязывая рецепторы, признают Апоптотические клетки; Щекотка рецепторов, инициировать поглощает; рецепторы, облегчающие весь процесс7. Таминовых рецепторов тирозина (там Риткс) состоят из Tyro-3, AXL, и мER и в первую очередь выражены миелоидных клеток иммунной системы8. Основная функция там Риткс заключается в том, чтобы служить привязывая рецепторы, облегчая фагоцитическое удаление апоптотических клеток и мусора. Наша группа изучила там опосредованный апоптотический клеточный зазор в условиях аутоиммунитета на долгие годы. Витамин к-зависимый рост белка арест специфического белка 6 (Gas6) и белка S (плюсы) связывается и активирует там рецепторы9,10. Gas6 вырабатывается в сердце, почках и легких. Профи в основном производятся в печени11. ТАМ признает апоптозных клеток таким образом, что N-терминал Gas6/профи связывается с Птдзер на апоптотической клетке и C-терминал Gas6/профи связывается с там рецепторов, которые закреплены на поверхности фагоцитов. Вместе с другими рецепторами, поглощает Апоптотические клетки происходит12. Хотя Mer может связываться как с лигандами профи и Gas6, мы обнаружили, что Gas6, как представляется, единственным лигандов для Mer опосредованного фагоцитоза апоптоз клеток, которые могут быть заблокированы анти-Mer антитела13. Макрофаги являются профессиональными гогоцитами. Быстрое оформление апоптозных клеток макрофагами имеет важное значение для ингибирования воспаления и аутоиммунные реакции против внутриклеточных антигенов. Mer рецептор тирозинкиназы имеет решающее значение для затопления макрофагов и эффективного оформления апоптотических клеток14. В селезенке мыши, Mer главным образом выражает на предельной зоне и материальном теле макрофагах13.

Представленный здесь протокол описывает базовый метод индуцирования апоптоза клеток и демонстрирует способы измерения процесса и эффективности эффоцитоза. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения эффофоцитоз другими типами клеток в поглощает апоптозных клеток различного происхождения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подопытных мышей разводили и поддерживали в нашей мышиных колониях. Все животные работы были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Университета Цинциннати.

1. Подготовка CFSE помечены апоптотических тимоцитов

  1. Эвтаназии двух наивных C57/В6 мышей по CO2 вдыхании 10 мин и рассечения, чтобы открыть грудную полость, удалить (вытащить) тимуса с изогнутыми тонкой наконечник щипцы в ткань культуры Петри, содержащий 10 мл RPMI1640 среды.
  2. Получить одну клеточную суспензию, шлифовальные весь тимус против двух матовое концы микроскопа слайды, а затем фильтр подвески через 100 мкм сетчатый фильтр.
  3. Соберите суспензию 10 мл тимуса в трубку 50 mL и центрифугу на 300 x g в течение 5 мин.
  4. Снимите supernatant, ресуспензируем в 40 мл 1x PBS, и Кол-во номера клеток с хемоцитометер.
  5. Центрифуга на 300 x g для 5 мин и удалить supernatant.
  6. Ресуспензируем в 20 мл 1x PBS в 50 mL трубки в качестве одной ячейки подвески с до 2 х 108 клеток (если больше, чем 2 х 108 клеток, ресуспензируем остальные клетки в другой 20 мл 1 х PBS в различных 50 ml трубки).
  7. Сделать 5 мкм CFSE в равном объеме (20 мл) 1x PBS в отдельной 50 mL трубки на пипетки 40 мкл из CFSE складе решение (2,5 mM) в 20 мл 1x PBS и хорошо перемешать путем инвертинг трубки 2-3 раз.
  8. Добавить 20 мл CFSE из шага 1,7 в 20 мл клеточной суспензии из шага 1,6 (окончательная концентрация CFSE в настоящее время 2,5 мкм).
    Примечание: для каждой ячейки суспензии 20 мл требуется 20 мл трубки CFSE.
  9. Инвертировать ячейку и CFSE смесь трубки 2-3 раз и инкубировать смесь в темноте при комнатной температуре в течение максимум 2 мин, затем остановить реакцию, добавив 10 мл тепла-инактивированных лошадь сыворотки.
  10. Центрифуга 50 mL смесь трубки на 300 x g для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Если маркировка CFSE успешно, ячейки гранулы станет светло-желтого цвета.
  11. Удалите супернатант и ресуспензируем ячейки гранул в 40 мл 1x PBS и Кол-номера клеток с хемоцитометер.
  12. Центрифуга ячейки подвески на 300 x g в течение 5 минут и отбросить supernatant.
  13. Вымойте ячейку гранул снова с 40 мл среднего RPMI1640.
  14. Удалите супернатант и ресуспензируем клетки с RPMI1640 культуры ткани среды (RPMI1640, 20 мм HEPES, 10% ФБС (тепло инактивированных), 20 мм глютамина, и 1x Пен/стрептококк) при концентрации 7 х 106 клеток/мл в 100 мм ткани культуры блюдо.
    Примечание: если больше клеток получены, отдельный 100-мм ткани культуры блюдо будет необходимо.
  15. Добавьте ставроспорина в культуру суспензии клеток в конечной концентрации 1 мкм и культуры на 4 ч при температуре 37 ° с в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO2.

2. Приготовление перитонеальных макрофагов

  1. Впрыснуть два C57B6 мышей (или любой ген-манипулировали мышей в лаборатории) интрааперитиально с 1 мл 3% в возрасте тиоглисопоставления в день 0.
  2. Эвтаназии мышей в день 5, как в шаге 1,1, вырезать и очистить открытой брюшной кожи, но оставить брюшины нетронутыми. Флеш брюшной полости, быстро нажав 10 мл буфера мытья (RPMI1640, 2% ФБС, 0,04% ЭДТА) в брюшной полости с использованием шприца 10 мл прилагается с 18 г иглы.
  3. Медленно извлекайте буфер мытья с той же иглой/шприцом и соберите буфер для мытья в 50 mL (подробности относятся к лабораторной статье Янссен15).
  4. Вымойте перитонеальный Гавриил дважды с 1x PBS, ресуспензируем перитонеальный макрофаги в RPMI1640 ткань культуры среды при плотности 2 х 106 клеток/мл и Алиготе 500 мкл в каждый колодец 24-хорошо пластины. Оставьте тарелку в инкубаторе тканевой культуры на 2 ч.
  5. Удалите плавающие клетки, аспирин и заменив 500 мкл свежей культуры среды, в два раза.
  6. По желанию добавьте ингибитор тирозин там рецептора, RXDX-106, в концентрациях, указанных в рисунке легенды в каждый колодец макрофагов культуры и инкубировать еще 2 ч.

3. co-культура перитонеальных макрофагов с апоптотической тимоцитов

  1. Соберите Апоптотические тимоциты из шага 1 и промойте три раза с RPMI1640 средой. Эффективность апоптотической индукции можно измерить на данном этапе с помощью приложения V/7-ад.
  2. Распределите 0-12 x 106 клеток (в 500 мкл среды) в каждый колодец макрофагов культур от протокола #2, в соответствии с экспериментальной договоренности (например, см. диаграмму 1). Это делает весь объем культуры 1 мл в каждом хорошо 24-хорошо пластины. Добавить блокирующего антитела в культуру непосредственно перед добавлением апоптотических тимоцитов.
  3. Культура клеточной смеси при температуре 37 ° c для 4 ч в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO2.
  4. Вымойте каждый колодец культуры с 1x PBS (содержащий 500 мкм ЭДТА) дважды, чтобы удалить свободно плавающие апоптозных клеток.
  5. Пятно пластины связанных макрофаги с CD11b-PE на данном этапе.
    1. Вымойте пластины связанных макрофаги с окрашивания буфера (1x PBS, 1% БСА) один раз.
    2. Добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE в каждый колодец.
    3. Инкубировать пластины при температуре 4 °C в течение 20 мин.
    4. Вымойте каждый колодец пластины три раза с окрашивания буфера.
    5. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить пластины для анализа изображений под флуоресцентным микроскопом.
  6. Кроме того, отделить пластины связанных макрофагов, добавив 1 мл 1% лидокаин в PBS и инкубации в течение 10 минут при температуре 37 ° c.
  7. Отсоедините пластину связанных макрофагов с повторным пипеткой.
  8. Перенесите суспензию макрофагов в индивидуальную 5 мл-нижнюю панель FACS с каждой скважины 24-хорошо пластины.
  9. Центрифуга на 300 x g в течение 5 мин.
  10. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE (1:200 разбавления в буфере окрашивания).
  11. Инкубировать клеточную суспензию в окрашивании буфера при температуре 4 °C в течение 20 мин.
  12. Вымойте клеточную подвеску дважды при окрашивании буфера.
  13. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить к анализу FACS с потоком cytometer и проанализировать процент от макрофагов положительности CFSE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ перитонеального макрофага-опосредованного затопления апоптотических тимоцитов. Перитонеальных макрофагов и апоптотических клеток были подготовлены и совместно культивировали как описано в протоколе. Макрофаги были отделены и запятнанные с a сопрягано Anti-CD11b антитело PE для 20 минут на льдах. Макрофаги затем промывают и обрабатываются в потоке cytometer. Как видно, в правом нижнем квадранте нет положительного макрофага CFSE, когда в культуру не добавлялись Апоптотические клетки (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Апоптоз является высоко консервативны клеточной смерти процесс, который включает в себя множество каскадов сигнала и индуцирует выражение белка, секреции и транспортировки. Апоптоз часто ассоциируется с клеточными изменениями морфологии17. Апоптотические клетки активно выпускают цитокинов и хемокинов, которые привлекают фагоцитов к миграции на участок и инициируют процесс затопления, чрезвычайно сложного пути под жестким контролем18. С другой стороны, некротической клеточно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование в лаборатории Шао поддерживается научно-исследовательской премией от медицинского колледжа и экспериментальной премии младшего факультета от Департамента внутренней медицины, Университета Цинциннати и гранта ДК K01_095067 от NIDDK/НИЗ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лизирующий буферAck GIBCOA10492
Аннексин V/7-AADBD Pharmingen559763
Anti-Mer антителаR& D SystemsBAF591
CD11b-PE (клон M1/70)BD Pharmingen553311
CFSEInvitrogenC1157
DMSO Sigma-AldrichD-2650
EDTA (0,5 мМ)GIBCO15575-020
FACS tubesBD Biosciences352017
Матовые слайдыFisher Scientific12-552-343
Сыворотка для лошадей (инактивированная при нагревании)Инвитроген26050088
лидокаинSigma-AldrichL-5647Приготовьте 1% буфер в 1x PBS
PBS, 1xCorning21040CV
RPMI-1640Corning10040CV
RXDX-106Selleck ChemicalsCEP-40783
Staurosprine (100 мг)Fisher ScientificBP2541-100Добавьте 214,3 мл ДМСО в 100 мг для получения 1 мМ раствора для чулок
Тиогликолят Medium Brewer ModifiedBD Biosciences243010Приготовьте 3% тиогликолят буфер в 1 мкг; PBS, автоклавированные, и хранить в темноте в течение 3 месяцев.

Ссылки

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Апоптотические тимоцитыперитонеальные макрофагипроточная цитометриямикроскопический анализфагоцитоз клетокмаркировка CFSEобработка стауроспориномстимуляция тиогликолятомантитела к CD11bвестерн-блоттинг
Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.