Методическая статья

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

DOI:

10.3791/59733

⸱

19 июля 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для метода он-мембранного пищеварения для подготовки образцов для массовой спектрометрии. Этот метод облегчает удобный анализ белково-белковых взаимодействий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многочисленные внутриклеточные белки физически взаимодействуют в соответствии с их внутриклеточными и внеклеточными обстоятельствами. Действительно, клеточные функции во многом зависят от внутриклеточного белково-белкового взаимодействия. Поэтому исследования, касающиеся этих взаимодействий, необходимы для облегчения понимания физиологических процессов. Совместное выпадение связанных белков, за которым и начинается анализ масс-спектрометрии (МС), позволяет выявить новые белковые взаимодействия. В этом исследовании мы предоставили подробную информацию о новой технике иммунопреципиционно-жидкой хроматографии (LC)-MS/MS анализ в сочетании с имбрамбранным пищеварением для анализа белково-белковых взаимодействий. Этот метод подходит для грубых иммунопросицитантов и может улучшить пропускную работу протеомных анализов. Tagged рекомбинантные белки были осаждены с использованием конкретных антител; Далее иммунопроцициты, запятнанные на поливинилиденовые дифлуоридные мембранные части, подвергались редуктивной алкилированию. После трипсиизации, переваренные остатки белка были проанализированы с помощью LC-MS/MS. Используя эту технику, мы смогли определить несколько кандидатов, связанных белков. Таким образом, этот метод удобен и полезен для характеристики новых белково-белковых взаимодействий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя белки играют составную роль в живых организмах, они постоянно синтезируются, обрабатываются и деградируют во внутриклеточной среде. Кроме того, внутриклеточные белки часто физически и биохимически взаимодействуют, чтовлияет на функцию одного или обоих 1,2,3. Например, для сборки комплекса экзонических соединений соединения4необходима прямая привязка сплайсцео-связанного белка омолога CWC22 с эукариотическим фактором инициации перевода 4A3 (eIF4A3). В соответствии с этим, eIF4A3 мутант, который не хватает сродства к CWC22 не может облегчить экзон соединения комплексного мРНК сращивания4. Таким образом, изучение белковых взаимодействий имеет решающее значение для точного понимания физиологических регуляции, а также клеточных функций.

Последние достижения в области масс-спектрометрии (МС) были применены к комплексному анализу белково-белковых взаимодействий. Например, совместное выпадение эндогенных белков или экзогенно введенных помеченных белков с их сопутствующими белками, а затем анализ MS, позволяет выявить новые взаимодействия белка5. Тем не менее, одним из основных узких мест MS / MS анализа является плохое восстановление от триптических дайджестов белковых образцов. Для проведения протеомического анализа на клеточных лизатах, в геле и на мембранном пищеварении методы, как правило, используются для подготовки MS / MS образцов. Ранее мы сравнили процедуру переваривания в геле сметодом пищеварения 6, и показали, что последняя была связана с лучшим покрытием последовательности. Поливилиден дифлуорид (PVDF) мембрана может быть подходящим для этой цели, потому что это механически надежный и устойчивый к высоким концентрациям органических растворителей7,8, что позволяет ферментативное пищеварение обездвижемых белки в присутствии 80% ацетонитрила9. Кроме того, иммобилизация на мембране может вызвать конформанционные изменения в целевых белков, что приводит к улучшению эффективности триптического пищеварения10. Соответственно, в этой статье мы описали использование иммунопреципиции-LC/MS/MS анализа белковых взаимодействий с использованием метода пищеварения на мембране. Этот простой метод облегчает удобный анализ белково-белковых взаимодействий даже в неспециализированных лабораториях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Иммунопрециция

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали не натрий додецил сульфат (SDS) лиза буфера и цитрат elution, как описано в следующих разделах. Однако использование альтернативного метода иммунопреципиции может быть также применимо для подготовки образцов LC-MS/MS.

  1. Трансфект культивированные клетки с переносчиками, кодируя только эпитопный тег или белок синтеза. Для получения репрезентативных данных, передача J774 клеток (1 х 106) с переносчиками кодирования зеленого флуоресцентного белка (GFP) в одиночку или GFP-слитый Capn6 (calpain-6 ген) с использованием киационных липосом.
  2. Спрягите антитела к магнитным бусинкам.
    1. Для этого смешайте анти-GFP антитела (2 Л/реакции) с магнитными бусинами (25 л/реакции) в 500 л цитратного фосфатного буфера (24,5 мМ лимонной кислоты, 51,7 мм диосновных фосфатов натрия; pH 5.0) в 1,5 мл испытательной трубки.
    2. Поверните смесь при 50 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем промойте бисер IgG-конъюгированные три раза с цитратом фосфатного буфера, содержащего 0,1% полиоксиэтилен (20) сорбитанского монолаурата.
  3. Вылажь трансинфицированные клетки с помощью соответствующего буфера лиза. Для получения репрезентативных данных, лисизировать трансинфицированные клетки в течение 30 минут на льду в 400 л люсиса буфера (50 мм Tris-HCl; рН 7,5, 120 мМ NaCl, 0,5% поли (оксиетенина) октилфенил эфир), содержащий 40 моль / л фенилметилсулфонил фторид, 50 мкг/мл леупептина, 50 мкг / мЛ апротинин, 200 моль/л ортоноватататата, и 1 мМ этиленгликоль тетраацетической кислоты (EGTA) в 1,5 мл пробирки 24 ч после трансфекции.
  4. Очистите лизат путем центрифуга на 15000 х г в течение 5 минут и собирать супернатант.
  5. Преочистите лизат. Добавьте немаркированные магнитные бусы (25 л/реакции) в 1,5 мл-пробной трубки. Вымойте бисер три раза с 500 л цитратфофофатного буфера. После удаления цитрата фосфат буфера в окончательной стирки, добавить лизат клетки над магнитными бусинами. Поверните смесь с помощью ротатора при 50 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
  6. Поместите пробирку на магнитную подставку в течение 5 минут для магнитного разделения, и собирать лизат клетки. Рекомендуется использование магнитного стенда, назначенного производителем.
  7. Привязать целевые белки к спряженым бусинкам. Поместите иммуноглобулин (Ig)G-конъюгированные бусы на магнитной подставке в течение 5 минут для магнитного разделения, отбросьте цитрат буфера, а затем добавить клеточный лисат в отделенные бусинки.
  8. Поверните смесь при 50 об/мин в течение 1 ч при комнатной температуре.
  9. Отделить белки-мишени от свободных нецелевых белков. Вымойте бусины три раза с помощью 500 л цитрата фосфатного буфера, содержащего 0,1% полиоксиэтилен (20) сорбитанского монолаурата. После окончательной стирки добавьте 30 кЛ цитратного буфера (рН 2-3) и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы утилизировать целевые белки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если восстановление после иммунопрецитификации недостаточно, использование альтернативных эпитопных тегов, таких как FLAG или HIS, может повысить эффективность. Если эффективность elution недостаточна, использование других элуантов, таких как решение на основе SDS, может повысить эффективность.

2. На мембрана переваривание белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование белковых материалов и оборудования необходимо, чтобы избежать загрязнения экзогенными белками. Кроме того, рекомендуется, чтобы оператор носить хирургическую маску и перчатки, чтобы избежать загрязнения человеческими белками.

  1. Разрежьте мембраны PVDF на 3 мм х 3 мм с помощью хирургических ножниц, которые были протерты метанолом и высушены непосредственно перед использованием.
  2. Добавьте 2-5 л этанола на кусочки мембраны PVDF на чистую алюминиевую фольгу.
  3. Прежде чем они полностью высохнут, добавьте eluant (2-5 л каждый, 4-6 штук на образец) на гидрофильные мембраны PVDF, а затем просушить воздух мембраны, пока поверхность мембраны не станет матовой. Сушеные мембраны можно хранить при 4 градусах Цельсия.
  4. Перенесите все мембраны в пластиковые трубки мощностью 1,5 мл, добавьте 20-30 л этанола, чтобы сделать мембраны гидрофильные, а затем удалите этанол с помощью пипетки.
  5. Перед тем, как мембрана высохнет полностью, добавьте 200 л дитиотрейтол (DTT) на основе реакции (80 мМ NH4HCO3, 10 мм DTT, и 20% ацетонитрия) и инкубировать его при 56 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
  6. Замените раствор реакции 300 л раствора йодоацетамида (80 мм NH4HCO3,55 мМ иодоацетамида и 20% ацетонитрия) и инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре в темное время суток.
  7. Вымойте мембраны дважды с 1 мл дистиллированной воды и один раз с 1 мл 2% ацетонитрила вихрем смешивания для йgt;10 s.
  8. Растворите лиофилизированный трипсин MS-класса(Таблицаматериалов) непосредственно в растворе реакции (30 мМ NH4HCO3, содержащий 70% ацетонитрила). Добавьте 100 qL реакционного раствора, содержащего 1 мкг трипсина(Таблица материалов) (30 мМ NH4HCO3, содержащий 70% ацетонитрила) и инкубировать при 37 градусах Цельсия за одну ночь.
  9. Перенесите раствор реакции, содержащий триптические дайджесты, в чистую пробирку длиной 1,5 мл с помощью пипетки.
  10. Добавьте в мембрану 100 кЛ раствора для мытья (70% ацетонитрила/1% трифторацетической кислоты) и инкубировать ее при 60 градусах По Цельсию в течение 2 ч. Соберите раствор для мытья и смешайте его с раствором реакции. Добавьте еще 100 л раствора для мытья в мембрану и смягчить его в течение 10 мин. Затем соберите раствор для мытья и смешайте с раствором реакции.
  11. Накройте пробирку куском лабораторной пленки и сделайте пару маленьких отверстий иглой. Высушите раствор с помощью вакуумного концентратора.
  12. Растворите остатки в 10 л из 0,2% для меновой кислоты. После центрифугирования (12 000 г, 3 мин при комнатной температуре) перенесите супернатант в пробную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стисы являются критическими шагами этого раздела. Во время переваривания белка на мембране, промывка мембран, содержащих обездвиженные белки после сокращения и алкилирования с дистиллированной водой, а затем 2% ацетонитрила, более 10 сек каждый, имеет решающее значение для удаления реагентов.

3. Ионизация LC-электроспрея (ESI)-MS/MS анализ

  1. Активируйте инструмент ESI-MS/MS(Таблицаматериалов) в сочетании с системой nano-LC HPLC (Таблицаматериалов). Ссылка предварительной колонки (Таблица материалов) и аналитическая колонка (Таблица материалов).
  2. Перед анализом откалибровать масс-спектрометр с помощью триптических дайджестов бычьего сывороточных альбомина, растворенного в 0,2% для модной кислоты, которая обеспечивает стандартные пептиды.
  3. Проанализируйте пробы с использованием положительного ионного режима и диапазона масс 400-1250 м/з; затем приобрести до 10 MS/MS спектра (100 мс каждый) с массой 100-1600 м/з и линейным градиентом 2%-80% ацетонитрила и 0,2% для мической кислоты на 80 мин при скорости потока 300 нл/мин.
  4. Проанализируйте выходные данные с помощью программного обеспечения для идентификации белка(ТаблицаМатериалов), чтобы определить кандидат связанных белков. Для положительной идентификации кандидата белка, обнаружение по крайней мере одного высокоточного пептида фрагмента (Яgt; 95% верности) не требуется.
  5. Опускай белки, которые аналогичным образом осаждаются в GFP-выражениях (трансфекция вектора, выражающего только тег GFP) из списка кандидатов белков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в анализе базы данных выявлено несколько белков, изменение условий приобретения MS/MS (например, изменение времени от 100 мс каждый до 50 мс каждый) может увеличить количество выявленных белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью вышеописанной процедуры были проанализированы иммунопреципицианты с помощью LC-MS/MS(рисунок 1). После исключения экзогенно производных белков (белков других видов и IgGs), 17 белков были выявлены в calpain-6-ассоциированных иммунопреципицитов (Таблица 1) и 15 белков были выявлены в GFP-ассоциированных иммунопреципицитов ( Таблица 2). Из calpain-6 и GFP-ассоциированных белков, 11 были выявлены в обоих иммунопрокципи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы описали анализ окислительных модификаций аполипопротеина B-100 в окисленном липопротеине низкойплотности с использованием LC-MS/MS, предшествовавшего методу переваривания на мембране 6. В настоящем исследовании мы объединили эту технику с иммунопрецицией и выявили несколько связанных с калбоном белков. Этот новый метод представляет собой удобный метод скрининга для кандидатов связанных белков. Calpain-6 является непротеолитический член calpain протеолитических семьи11,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было частично поддержано Японским обществом содействия науке KAKENHI Грант номер 17K09869 (к AM), Японское общество по содействию науки KAKENHI Грант номер 15K09418 (к TM), научно-исследовательский грант от Kanehara Ichiro Медицинский научный фонд и исследовательский грант от Мемориального фонда Suzuken (все - Tm).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонитрилWako014-00386
Лимонная кислотаWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.нанопотоковая высокоэффективная жидкостная хроматография
DiNa AIKYA Tech Co.nanoflow высокопроизводительная жидкостная хроматография оснащена автосэмплером
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads protein GThermo Fisher Scientific10003D
Муравьиная кислотаWako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000,10 ммID * 100 ммL
ЙодоацетамидWako095-02151
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors A.v. Моноклональное антитело (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507поли(оксиэтелен) октилфениловый эфир (n=9)
пептид стандартKYA Tech Co.tBSA-04триптические дистили бычьего сывороточного альбумина
PP флаконKYA Tech Co.03100Sпластиковая пробирка для образцов
Ингибитор протеазы коктейльSigmaP8465
ProteinPilot программное обеспечениеSciex5034057программное обеспечение для идентификации белков
Секвенирование модифицированного трипсинаPromegaV5111трипсин
ортванадат натрияSigmaS6508
Дигидрат натрия фосфата двухосновногоSigma71643
TFAWako206-10731
колонна ловушкиKYA Tech Co.A03-05-0010,5 ммID * 1 ммL
TripleTOF 5600 системаSciex4466015Гибридный квадрупольный тандемный масс-спектрометр
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи