Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59760

⸱

10 марта 2020 г.

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

Мы клонируем и анализируем гены репортеров, генерирующие круговые РНК. Эти гены репортеров больше, чем конструкции для анализа линейного сращивания и содержат элементы Alu. Для исследования циркулярных РНК конструкции трансфицируются в клетки и в результате РНК анализируется с помощью РТ-ПЦР после удаления линейной РНК.

Аннотация

В дополнение к линейным мРНК, многие эукариотические гены генерируют круглые РНК. Большинство круглых РНК генерируются путем присоединения 5' сращивания сайта с вверх по течению 3 ' сращивания сайта в рамках предварительной мРНК, процесс, называемый обратно-сплайсинг. Эта круговая речь, вероятно, способствует вторичных структур в предварительном MRNA, которые приносят сращивания сайтов в непосредственной близости. В человеческих генах, Элементы Alu, как полагают, способствуют эти вторичные структуры РНК, как Алу элементы в изобилии и экспонат базы взаимодополняемости друг с другом, когда присутствуют в противоположных направлениях в предварительном mRNA. Здесь мы описываем генерацию и анализ большого элемента Алу, содержащего репортёрские гены, образующие круглые РНК. Благодаря оптимизации протоколов клонирования могут образоваться гены репортеров длиной до 20 кб. Их анализ в экспериментах по сотрансфокации позволяет выявить регуляторные факторы. Таким образом, этот метод может определить последовательности РНК и клеточных компонентов, участвующих в круговой рнкобразования.

Введение

Круговые РНК
Круговые РНК (циркрнки) являются ковалентно закрытыми одноцепочечными РНК, которые выражаются в большинстве организмов. Они генерируются путем присоединения вниз по течению 5 ' сращивания сайт вверх по течению 3 ' сращивания сайта, процесс называется обратно-сращивания (Рисунок 1А)1. Последовательности в pre-mRNA, которые демонстрируют базу, дополняемую как короткие, как 30-40 nt принести обратно-сращивания сайтов в надлежащее выравнивание для формирования циркрнки2. У людей, Alu элементы1, представляющие около 11% генома3, образуют обширные двойные структуры РНК в предварительном mRNA из-за их самокомплементи4,5 и тем самым способствовать образованиюциркрнки 1.

В настоящее время описаны три основные функции циркрнки. Некоторые циркрнки связывают микроРНК (миРНК) и через секвестр действуют как губки miRNA6. CircRNAs были вовлечены в транскрипционной и после транскрипции регулирования, через конкуренцию с линейным сращивания7 или модуляции транскрипции фактор деятельности8. Наконец, циркорные системы содержат короткие открытые рамки для чтения, и доказательства принципиальных исследований показывают, что их можно перевести9,10. Тем не менее, функция большинства циркрнок остается загадочной. Большинство круглых РНК были обнаружены с использованием методов секвенирования следующего поколения11. Детальный анализ отдельных генов с использованием целевых подходов RT-PCR показывает, что большое количество круговых РНК еще предстоит обнаружить12.

Использование генов репортеров для анализа обработки предварительной мРНК
Анализ мРНК, полученных из ДНК-репортер агонстративных транссексуалов в клетки является устоявшимся методом для изучения альтернативных пре-мРНК сращивания, которые могут быть применены к круговой РНК. В общем, альтернативный экзон, окружающие его интроны и составные экзоны усиливаются и клонируются в вектор эукариотического выражения. Часто интроны сокращаются. Конструкции трансфицируются в эукариотические клетки и обычно анализируются RT-PCR13,14. Этот подход широко используется для картирования нормативных сращивания сайтов и транс-действующих факторов в экспериментах по со-трансфекции13,15,16,17,18. Кроме того, генерация белково-выражающих минигенов допускается скрининг веществ, которые меняют альтернативное сращивание19,20.

Метод применяется к циркулярным РНК. В настоящее время, по крайней мере 12 минигенных позвоночников были описаны в литературе и кратко изложены в таблице 1. За исключением системы экспрессии на основе tRNA21,22, все они зависят от промоутеров полимераза II. Здесь мы описываем метод генерации минигенов репортера для определения циси и транс-действующих факторов, участвующих в генерации круговых РНК. Обзор метода с использованием последовательностей опубликованного гена репортера23 показан на рисунке 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Проектирование конструкций

  1. Используйте браузер генома UCSC24 для выявления повторяющихся элементов, необходимых для формирования круговой РНК, и их включения в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов.
  2. Вставьте круговую последовательность РНК(Дополнительная рисунок 1 является испытательной последовательностью) в https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start и выберите правильный организм. Отправить последовательность и перейти к браузеру зрения, увеличить 1.5x или по мере необходимости(Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность поиска отображается в верхней строке(рисунок 2А, 1). В зависимости от порядка экзонов в круговой РНК, BLAT не будет соединять все экзоны. В этом примере экзон 12(Рисунок 2А, 4) не подключен к 11(рисунок 2А, 2, 3),потому что экзон 12 находится вверх по течению экзона 11 в круговой последовательности РНК(Дополнительная рисунок 1). Повторяющиеся элементы находятся в треке "повторить маску", обозначенном коробками, где от черного до серого цвета указывает на эволюционное сохранение(рисунок 2А, 5).
  3. Мышь над повторяющимися элементами, чтобы определить их подтип в плавающем окне. Элементы Alu находятся в линии SINE (короткий перемежается ядерный элемент). Используйте кнопку "По умолчанию треков" под окном, чтобы сбросить браузер, если получена другая картинка, чем рисунок 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Mousing над экзонами в генном дисплее генерирует окно с экзонномерами, которые генерируются компьютером. Эти числа не соответствуют экзону нумерованию, установленному в литературе, а также изоформироваться между изоформами.

2. Выберите последовательность для клонирования в векторе выражения

  1. Скачать последовательность ДНК показано в окне, перейдя к Просмотр у ДНК на верхней строке браузера генома UCSC. В варианте форматирования последовательностивыберите расширенные параметры корпуса/цвета.
  2. Выберите случай по умолчанию в качестве Нижнего и выберите чехол переключения для NCBI refseq. Выберите подчеркнуть, и смелый, и курсивом для Повторите Маскер. Нажмите Отправить. Там будут экзоны, как заглавные буквы и интроны, как маленькие буквы. Проверьте границы экзона/интрона.
  3. В этом примере есть последовательность 'cccttacCTTTTT', указывающая на то, что браузер показывает обратную комплект. Если это так, вернитесь назад и выберите обратную коробку дополнения, пока не увидеть правильные границы интронов экзона (agEXONgt), в этом примере AAAAAGgtaaggg.
  4. Копировать файл с правильной ориентацией (внутренние экзоны окружены интроником ag... gt) в документ обработки текста и выделить экзоны(Дополнительный рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере геномный фрагмент, охватывающий экзоны 9-12, составляет около 24 кб и, таким образом, слишком велик, чтобы быть усиленным из геномной ДНК. Таким образом, каждый экзон, окруженный около 1 кБ интронной области индивидуально усиливается, и эти четыре фрагмента собраны в вектор клонирования.
  5. Выберите фрагменты для усиления (экзон - 500 nt intron). Убедитесь, что интрон не начинается или не заканчивается в повторяющейся области, так как грунтовки в этих регионах не будут усиливать определенные последовательности. Выбранные области отображаются на рисунке 2B,а их последовательности показаны на дополнительном рисунке 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В общем, чем больше конструкций, тем сложнее будет клонирование. Фрагменты могут быть собраны либо шаг мудрым (т.е. экзон 9 сочетается с вектором и в следующем шаге exon 10 вводится в эту конструкцию путем клонирования до тех пор, пока все экзоны находятся на месте), или же все фрагменты собираются одновременно. Пошаговый подход всегда работает, но требует больше времени. Одновременная сборка не всегда работает и зависит от того, насколько хорошо отдельные фрагменты могут быть усилены из геномной ДНК и от общего размера конструкции. Поэтому мы обычно начинаем с обоих подходов одновременно.

3. Дизайн грунтовки для клонирования

  1. Используйте веб-инструмент(https://nebuilder.neb.com/#!/)для разработки праймеров для клонирования. Например, введите фрагменты 9, 10, 11 и 12 и векторную последовательность(дополнительная рисунок 3)к этому инструменту.
  2. Для векторной последовательности добавьте место вставки в качестве последнего нуклеотида и затем добавьте фрагменты. Поскольку векторная нумеровка не начинается с заданного участка вставки, находится место вставки в вектор, а нижепом часть ставится перед восходящей последовательностью. В этом примере вставки начинаются сразу после сайта HindIII «AAGCTT» и заканчиваются сразу после pmeI (GTTTAAAC) сайта pcDNA3.1. Последовательность из cccgctgatcag ... ccgtaaaaaaagggccна вставлены перед положением 1 в последовательности pcDNA3.1 (gttgctggcgttttcc ...).
  3. Отрегулируйте грунтовки, если их точки плавления находятся более чем на 4 градуса Цельсия друг от друга, так как они не будут работать в усилении. Сборка фрагментов и грунтовки последовательностей, направленных показаны на дополнительном рисунке 4. Праймеры для клонирования также могут быть разработаны вручную25.

4. Обнаружение ПЦР и ампииконов

  1. Стандартная реакция ПЦР: Сделайте реакционную смесь общим объемом 50 л за реакцию. Ниже приведен рецепт одной реакции с использованием полимеразы 1:
    10 злиц 5x Реакционный буфер
    1 кл/л 10 мМ dNTPs
    2,5 л из 10 мкм форвард айтор
    2,5 л из 10 ММ Обратный праймер
    0,5 л полимеразы 1
    32,5 л Нуклеанеи бесплатно H2O
    1. Дополнительно добавьте 10 зл 5x GC Enhancer, если продукт имеет высокое содержание GC; сделать отдельную смесь, содержащую GC Enhancer для проверки реакции ПЦР.
  2. Aliquot 49 л смеси в ПЦР трубки на образец реакции.
  3. Добавьте в ПЦР 1 кЛ ДНК, количество которого колеблется от 10 пг до 1 нг.
  4. Спин вниз образцы, чтобы удалить остатки от сторон и поместить их в машину ПЦР. Используйте ту же машину, а также те же пятна в машине при оптимизации условий ПЦР.

5. Оптимизация для более длинных фрагментов ДНК для использования различных полимеразы

  1. Температура
    1. Оптимизация дальней полимеразеи 2.
      1. Используйте более низкую температуру денатурации (Полимераза 1: 98 градусов по Цельсию, Полимераза 2: 94 градусов по Цельсию).
      2. Используйте более длительное время денатурации (Полимераза 1: 10 с, Полимераза 2: 30 с).
      3. Используйте более длительное время аннулирования (Полимераза 1: 30 с, Полимераза 2: 60 с).
      4. Используйте более длительное время продления (Полимераза 1: 30 с/кб, Полимераза 2: 50 с/кб).
      5. Используйте более низкую температуру расширения (Полимераза 1: 72 градуса по Цельсию, Полимераза 2: 65 градусов по Цельсию).
      6. Используйте анналинг температуры 5 градусов ниже ТМ грунтовки.
    2. Оптимизируйте концентрации грунтовки (в 5 раз меньше, чем первоначальная концентрация грунтовки). Оптимизируйте концентрации ДНК от 10 п.п. до 50 пг, 100 п.п., 1 нг, 5 нг, 10 нг.
    3. В качестве примера программы ПЦР для усиления размера продукта 15 кб с использованием Полимераза 2, выполнить начальную денатурацию на 94 градусов по Цельсию в течение 30 с, ДНК денатурации на 94 градусов по Цельсию в течение 30 с, а затем annealing на 58 градусов по Цельсию на 30 с, и расширение ДНК на 65 градусов по Цельсию для 12 мин 30 s. Выполните окончательное расширение при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут с окончательным удержанием 4 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура annealing (Ta) специфична для грунтовок, определяемых веб-расчетами температуры, которые специфичны для каждой полимеразы. Время расширения может меняться и нуждаться в оптимизации, если фрагменты больше 10 кб.
  2. Время расширения и концентрации ДНК
    1. Используйте более длительное время расширения для фрагментов ДНК более 6 кб: 1 мин на 1 кб. Более длинные фрагменты должны использовать меньше ДНК.
    2. Выполните разбавления ДНК, чтобы найти оптимальную концентрацию ДНК для усиления, как правило, 1 пг до 1 нг для плазмиды или 1 нг до 1 мкг для геномной ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства клонирования использовать полимеразы 1, инженерии путем сплавляя Sso7d ДНК связывания домена запатентованную термостабильную ПОЛимеразу ДНК26. Полимераза имеет низкую частоту ошибок и из-за домен Sso7d высокой процессии, необходимой для усиления больших (10-15 кб) геномных фрагментов. Из-за этого большого размера фрагмента для вставки в векторы используется ферментная сборка молекул27 ДНК, так как этот метод не требует ограничения ферментов. Усиление фрагментов длиной более 15 кб становится все труднее с полимеразой 1. Для большого увеличения фрагмента использовать полимеразы 2 из пирококка,как корректуры полимеразы слиты с Sso7d или дальнего комплекта ПЦР, что дает, однако, более высокие показатели ошибок.

6. Очистка продуктов ПЦР для клонирования

  1. Запустите половину продуктов ПЦР на 1% гелей агарозы, содержащих интеркалирующее пятно нуклеиновой кислоты (например, 1x GelGreen). Визуализируйте окрашенные гели на темном трансиллинодоре читателя. Эта запятнанная дна не бежит по верному размеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: GelGreen переплетается в ДНК, похож на бромистый этидий, но он возбуждается светом около 500 нм (циань), длина волны, которая не повреждает ДНК, что значительно улучшает клонирование.
  2. Параллельно, запустить половину продуктов ПЦР на 1% гель, который окрашен после запуска с бромистом этидия(Рисунок 3A,B).
  3. Акцизные полосы нужного размера от окрашенных гель (шаг 6.1) и изолировать ДНК с помощью геля и комплекта очистки ПЦР. В отклонении от своего стандартного протокола, увядительный ДНК только в 20 л двойной дистиллированной воды, как правило, концентрации ДНК являются низкими.
  4. Перед клонированием проверьте изолированную ДНК на геле агарозы на концентрацию и целостность(рисунок 3В). Цель для 2:1 молярной вставки в векторное соотношение. При использовании нескольких вставок соотношение 2:2:2:1.

7. Сборка ДНК и обнаружение клонов

ПРИМЕЧАНИЕ: Клонирование осуществляется с использованием ферментативного комплекта для сборки ДНК, с незначительными изменениями. Сборка выполняется в течение 60 мин при 50 градусах Цельсия и, как правило, нижний диапазон ДНК используется для сборки (20-100 фмоль/20 л реакции). Вся смесь реакции добавляется в химические компетентные клетки и целые клетки выкрываются на 6-сантиметровой агаровой пластине.

  1. Смешайте вектор и вставьте в соотношении моляров 1:2 (по 20-500 моль каждый) в 10 л воды.
  2. Добавьте 10 зл ДНК сборки Мастер Mix.
  3. Инкубировать образцы в течение 60 минут при 50 градусах Цельсия.
  4. Затем преобразуйте компетентные ячейки с общей реакцией сборки. Здесь используйте штамм E. coli 1 клетки для более коротких конструкций или штамма e. coli 2 клеток для более длинных или нестабильных конструкций. Клетки должны быть в объеме 50 л.
  5. Оттепель клетки на льду и добавить 2 зл и L охлажденных собранных продуктов в компетентные клетки. Смешайте, аккуратно щелкая трубку 4-5 раз. Не вихрь.
  6. Пусть смесь сидеть на льду в течение 30 минут.
  7. Тепловой шок при температуре 42 градуса по Цельсию в течение 30 с. Не смешивайте.
  8. Перенесите трубку обратно на лед на 2 мин.
  9. Добавьте в трубку 950 л комнатной температуры SOC Media.
  10. Инкубировать реакционную трубку при 37 градусах по Цельсию в течение 60 мин. Встряхните энергично (300 об/мин).
  11. Теплые подборные тарелки с соответствующим антибиотиком во время инкубации при 37 градусах Цельсия.
  12. Пеллетклетки через центрифугацию (10 000 х г,30 с) и вылезать 1/4 и 3/4 клеток на двух селекционных пластинах и инкубировать при 37 градусах Цельсия за одну ночь.

8. Проверка клонов

  1. Используйте колонии PCR, используя ПЦР праймеры, охватывающие сборочныеплощадки (рисунок 1C) для обнаружения.
  2. Возьмите стерильную зубочистку и коснитесь одной бактериальной колонии.
  3. Коснитесь нижней части трубки ПЦР с зубочисткой, которая имеет колонию, а затем полоса зубочистки на антибиотик агар пластины, инкубировать полосатые пластины при температуре 37 градусов цельсия или комнатной температуры для чувствительных конструкций на ночь.
  4. Наложение трубки ПЦР коснулся с колонией с PCR смесь, содержащая обнаружения грунтовки. Они разработаны с использованием грунтовки 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Программа имеет возможность заставить грунтовку дизайн через определенную последовательность, используя знаки "Ccc", чтобы выбрать грунтовки через сборочный узел. ДНК от положительных штаммов изолирована и проверена путем секвенирования.

9. Анализ круговой РНК, выражающей гены репортера

  1. Для анализа, трансфект-репортер генов в эукариотических клеток. Здесь используйте клетки HEK293 (ATTC #CRL-1573), поскольку они дают высокую эффективность трансфекции. Для экономии затрат используйте решения PEI (полиэтиленеимин).
  2. Для раствора PEI растворите линейный полиэтиленеимин гидрохлорид (PEI) при 1 мг/мл в воде при низком рН, рН 2. Поднесите рН до 7 с NaOH. Стерильный фильтр с фильтрами 0,22 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
  3. Разделите клетки на шесть скважин (примерно 150 000 клеток на скважину) и дайте им расти в одночасье в 10% FBS в DMEM media.
  4. Aliquot 1 мкг гена репортера в стерильной трубке и добавить 200 л стерильных фильтрованных 150 мМ NaCl. Смешайте с ДНК путем вихря.
  5. Добавьте PEI раствор к этой смеси и вихрю, кратко центрифугу для сбора образцов на дне трубки. Используйте коэффициент 1 мкг ДНК на 3 ЗЛ ПЭИ.
  6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем добавить непосредственно в HEK 293 клеток.
  7. Инкубировать HEK293 клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,на ночь.
  8. Изолировать РНК для RT-PCR через комплект изоляции РНК.

10. RNase R лечение для удаления линейных РНК

  1. Используйте 10 мкг общей РНК в трубке, свободной от RNase.
  2. Добавьте в РНК 10 кв. м 10x RNase R буфер (0,2 М Tris-HCl (pH 8.0), 1 M KCl, 1 мМ MgCl2.
  3. Добавьте RNase R в РНК (1 ql 20U).
  4. Добавьте в РНК 1 зликольного синего цвета и доведите объем до 100 л со стерильной водой.
  5. Инкубировать образцы при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
  6. Добавьте 100 л фенола/хлороформа и вихря в течение 1 мин.
  7. Центрифуга при 21 000 х г в течение 1 мин в отдельные фазы.
  8. Возьмите супернатант (вавную фазу) и добавьте 1 том (около 80 л л хлороформа).
  9. Вихрь в течение 1 мин, а затем центрифуга в течение 1 мин, чтобы отделить фазы.
  10. Возьмите супернатант, добавьте 1:10 вольт КАК и 2,5 вольт этанола, и осадок при -20 градусах по Цельсию в течение 1-4 ч. Центрифуга при 4 КК в течение 30 мин на полной скорости (21 000 х г). Там будет небольшой синий гранулы на дне.
  11. Удалить супернатант, и мыть с 80% этанола. Дайте воздуху высохнуть в течение 5 мин при комнатной температуре и растворите в 10 л воды.

11. Анализ РТ-ПКР

  1. Используйте 1 мкг РНК на реакцию RT.
  2. Сделать реакционную смесь для окончательного общего объема 20 Л л на реакцию. Для одной реакции используйте 1 кЛ 10 мМ dNTPs, 1 л 0,1 М дитиотрейтол (DTT), 4 Зл 5x First-Strand Buffer, и 0,5 л обратной транскриптазы.
  3. Аликвот 6,5 л реакции смешивают с новыми трубками ПЦР.
  4. Смешайте до 5 грунтов к одной смеси. Тем не менее, некоторые грунтовки могут неправильно спариваться с другими грунтовками в ПЦР(рисунок 5). Праймер последовательности находятся в таблице 2. Мы обычно используем генно-специфические праймеры экзон-соединения, но грунтовка со случайными гексемеры также возможно.
  5. Добавьте 1 зл из 10 мкм Обратная грунтовка в желаемую трубку реакции RT.
  6. Добавьте 1 мкг РНК в трубку для реакции ПЦР.
  7. Добавьте H2O без RNase до общего объема 20 Зл.
  8. Спиновые трубки вниз, чтобы удалить остатки на стороне труб и место в термоцикле.
  9. Запустите реакцию RT в термоцикле при 50 градусах по Цельсию в течение 50 минут.
  10. Храните RT cDNA при -20 градусах по Цельсию или переходите к реакции ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гены репортеров позволяют определить регуляторные факторы, влияющие на формирование круговой РНК. Тем не менее, эти гены репортера являются большими и содержат повторяющиеся элементы, которые часто делают днк конструкции нестабильными. Из-за их большого размера, часто необходимо удалить части интронов, что достигается путем усиления геномных частей, содержащих экзоны и меньшие фланговые интронные части. Эти части ДНК ферментно собраны, что позволяет строить без ограничений ферментов.

Пример кр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В целом, круговые РНК являются низкими обильными1,что усложняет изучение их функции и формирования. Подобно линейным РНК13,использование репортера minigenes позволяет определить cis и транс-действующих факторов, которые регулируют формирование круговых РНК. Таким образом, этот подход порождает гипотезы, которые могут быть дополнительно протестированы с помощью эндогенных генов.

Наиболее важным шагом является дизайн гена репортера. Ферментативная ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством обороны Министерства обороны грант a180075. Stefan Stamm благодарит фонд Jacqueline Noonan. Анна Павлючина была поддержана DAAD, немецкая программа академического обмена, Джастин Р. Уэлден был получателем Университета Кентукки Макс Стеклер премии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(PEI) Гидрохлоридныеполинауки24765-1
Строительный инструментNEBa href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.Clare Chemical Research
Набор для сборки ферментативной ДНКNEBE2621S
Набор для очистки гелем и ПЦРPromegaA9282
Glyco BlueThermo FisherAM9516
pcDNA3.1 сайт клонированияполиклонированияhttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Полимераза 1NEBM0491LQ5 ДНК-полимераза
Полимераза 2Biorad1725310Полимераза дальнего действия (NEB), iproof (BioRad)
Полимераза 2Qiagen206402Qiagen Long Range Polymerase Набор
обратной транскриптазыThermo Fisher18080044
Набор для выделения РНКLife Technologies12183025Ambion by Life Technologies
RNAse RLucigenRNR07250Epicenter/Lucigen
Стабильные компетентные клеткиNEBC3040HNEB стабильные клетки Стандартное
клонирование бактерийNEBC2988JNEB5-alpha компетентный
веб-инструмент для проектирования грунтовокNEBa href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/
Веб-расчеты температурыNEBa href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main
< для <<

Ссылки

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236(2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435(2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777(2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215(2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Образование кольцевой РНКанализ Alu-элементовклонирование минимального генаоптимизация ПЦРферментативная сборка ДНКвыделение РНКамплификация методом ОТ-ПЦРобработка РНказой Rкольцевая РНК белка tauзависимость от факторов сплайсинга
Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.