Мы клонируем и анализируем гены репортеров, генерирующие круговые РНК. Эти гены репортеров больше, чем конструкции для анализа линейного сращивания и содержат элементы Alu. Для исследования циркулярных РНК конструкции трансфицируются в клетки и в результате РНК анализируется с помощью РТ-ПЦР после удаления линейной РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование элемента Alu, содержащего минигены, для анализа циркулярных РНК
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В дополнение к линейным мРНК, многие эукариотические гены генерируют круглые РНК. Большинство круглых РНК генерируются путем присоединения 5' сращивания сайта с вверх по течению 3 ' сращивания сайта в рамках предварительной мРНК, процесс, называемый обратно-сплайсинг. Эта круговая речь, вероятно, способствует вторичных структур в предварительном MRNA, которые приносят сращивания сайтов в непосредственной близости. В человеческих генах, Элементы Alu, как полагают, способствуют эти вторичные структуры РНК, как Алу элементы в изобилии и экспонат базы взаимодополняемости друг с другом, когда присутствуют в противоположных направлениях в предварительном mRNA. Здесь мы описываем генерацию и анализ большого элемента Алу, содержащего репортёрские гены, образующие круглые РНК. Благодаря оптимизации протоколов клонирования могут образоваться гены репортеров длиной до 20 кб. Их анализ в экспериментах по сотрансфокации позволяет выявить регуляторные факторы. Таким образом, этот метод может определить последовательности РНК и клеточных компонентов, участвующих в круговой рнкобразования.
Введение
Круговые РНК
Круговые РНК (циркрнки) являются ковалентно закрытыми одноцепочечными РНК, которые выражаются в большинстве организмов. Они генерируются путем присоединения вниз по течению 5 ' сращивания сайт вверх по течению 3 ' сращивания сайта, процесс называется обратно-сращивания (Рисунок 1А)1. Последовательности в pre-mRNA, которые демонстрируют базу, дополняемую как короткие, как 30-40 nt принести обратно-сращивания сайтов в надлежащее выравнивание для формирования циркрнки2. У людей, Alu элементы1, представляющие окол....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Проектирование конструкций
- Используйте браузер генома UCSC24 для выявления повторяющихся элементов, необходимых для формирования круговой РНК, и их включения в конструкции. Важно отметить, что грунтовки для усиления должны быть вне повторяющихся элементов.
- Вставьте круговую последовательность РНК(Дополнительная рисунок 1 является испытательной последовательностью) в https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start и выберите правильный организм. Отправить последовательность и перейти к браузеру зрения, увеличить 1.5x ил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Гены репортеров позволяют определить регуляторные факторы, влияющие на формирование круговой РНК. Тем не менее, эти гены репортера являются большими и содержат повторяющиеся элементы, которые часто делают днк конструкции нестабильными. Из-за их большого размера, часто необходимо удалить части интронов, что достигается путем усиления геномных частей, содержащих экзоны и меньшие фланговые интронные части. Эти части ДНК ферментно собраны, что позволяет строить без ограничений ферментов.
Пример кр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В целом, круговые РНК являются низкими обильными1,что усложняет изучение их функции и формирования. Подобно линейным РНК13,использование репортера minigenes позволяет определить cis и транс-действующих факторов, которые регулируют формирование круговых РНК. Таким образом, этот подход порождает гипотезы, которые могут быть дополнительно протестированы с помощью эндогенных генов.
Наиболее важным шагом является дизайн гена репортера. Ферментативная .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством обороны Министерства обороны грант a180075. Stefan Stamm благодарит фонд Jacqueline Noonan. Анна Павлючина была поддержана DAAD, немецкая программа академического обмена, Джастин Р. Уэлден был получателем Университета Кентукки Макс Стеклер премии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| (PEI) Гидрохлоридные | полинауки | 24765-1 | |
| Строительный инструмент | NEB | a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Набор для сборки ферментативной ДНК | NEB | E2621S | |
| Набор для очистки гелем и ПЦР | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 сайт клонирования | поликлонирования | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Полимераза 1 | NEB | M0491L | Q5 ДНК-полимераза |
| Полимераза 2 | Biorad | 1725310 | Полимераза дальнего действия (NEB), iproof (BioRad) |
| Полимераза 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen Long Range Polymerase Набор |
| обратной транскриптазы | Thermo Fisher | 18080044 | |
| Набор для выделения РНК | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Стабильные компетентные клетки | NEB | C3040H | NEB стабильные клетки Стандартное |
| клонирование бактерий | NEB | C2988J | NEB5-alpha компетентный |
| веб-инструмент для проектирования грунтовок | NEB | a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Веб-расчеты температуры | NEB | a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Ссылки
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
