Здесь, мышь кровь была собрана в присутствии анти-коагулянт. Тромбоциты были очищены от iohexol градиент среды с использованием низкой скорости центрифугирования. Тромбоциты были активированы с тромбина для расследования, если они были жизнеспособными. Качество очищенных тромбоцитов анализировалось с помощью потока цитометрии и микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очищение тромбоцитов от мышонка крови
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Тромбоциты очищаются от цельной крови для изучения их функциональных свойств, которые должны быть свободны от красных кровяных телец (РБК), лейкоцитов (WBC), и белков плазмы. Мы описываем здесь очищение тромбоцитов от мыши крови, используя три раза больше iohexol градиент среднего относительно объема крови и центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Восстановление/выход очищенных тромбоцитов было 18.2-38.5%, а очищенные тромбоциты находились в состоянии покоя, которое не содержало сколь-либо значительного количества РБК и WBC. Очищенные тромбоциты, обработанные тромбином, показали до активации 93%, что указывает на их жизнеспособность. Мы подтвердили, что очищенные тромбоциты являются достаточно чистым использованием потока цитометрической и микроскопической оценки. Эти тромбоциты могут использоваться для экспрессии генов, активации, высвобождения гранул, агрегирования и анализа адгезии. Этот метод может быть использован для очистки тромбоцитов из крови других видов, а также.
Введение
Тромбоциты являются компонентом крови, который функционирует как инициатор свертывания крови в ответ на повреждение в кровеносный сосуд. Они собирают на месте повреждения для того чтобы заткнуть стену сосуда1. Тромбоциты являются ануклеатными фрагментами цитоплазмы, производными от мегакарыцитов костного мозга под действием тромбоноэтин и попадают в тираж2. Они считаются метаболически активными и способными воспринимать внеклеточную среду путем активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые приводят к распространению тромбоцитов, агрегированию и образованию гемостатической вилки1,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мышеловки крови должны быть проведены с соответствующими институциональными ухода за животными и использования Комитета одобрения.
Примечание: Протокол очистки тромбоцитов описан в диаграмме потока на рисунке 1.
1. сборник крови
- Добавьте 25 мкл 3,2% цитрата натрия (pH 7,2) в качестве анти-коагулянта и 0,4 мм ГУНО-про-АРГ-про (гпрр) в полипропиленовой трубе.
-
Соберите примерно 200 мкл крови из C57BL/6 мышь с помощью ретро-орбитального кровотечения.
Примечание: кровь может быть собрана из любого типа деформации мыши, независимо о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сводка по очистке тромбоцитов описывается в схеме потока (рис.1). Шаги включают в себя сбор крови из мыши с помощью ретро-орбитального кровотечения в присутствии антикоагулянта, Добавление образца крови на iohexol градиент среды, центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Качество очищенных тромбоцитов оценивалось с помощью микроскопии и потока цитометрии после окрашивания с антителами для выявления любых загрязняющих клеток и активирова.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Обычно тромбоциты изолированы низкоскоростным центрифугирования, которая дает богатую тромбоцитами плазму, которая содержит значительное количество клеток крови, клеточного мусора и белков плазмы, которые могут вмешиваться в биохимические и физиологические анализы и потребности дальнейшее очищение21. Поэтому, важно использовать быстрый и простой метод, который может дать чистые тромбоциты без основных загрязняющих веществ. Представленный здесь протокол описывает очищение тромбоцитов от крови мышей.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана запуска финансирования детского исследовательского фонда Цинциннати и Университета Цинциннати пилот поступательный Грант на М.Н. Мы хотели бы поблагодарить детский госпиталь Цинциннати исследовательский поток Цитометрическая Core за их услуги.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| APC крыса антимышиный/человеческий CD62P (P-селектин) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Маркер активации тромбоцитов |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Пробирка для сантифуге |
| FACS DIVA программное обеспечение | BD Biosciences | Не каталог Анализ | тромбоцитов и цельной крови |
| FACS пробирка | Fisher Scientific | 352008 | Пробирки для потока цитомтерия |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Инвитроген | 26140079 | Ингредиент для окрашивания буфера |
| FITC крыса антимышиный CD41 | BD Biosciences | 553848 | Маркер тромбоцитов |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | Не каталог Анализ | тромбоцитов и цельной крови |
| FlowJo программное обеспечение | FlowJo, Inc. | Не каталог Анализ | тромбоцитов и цельной крови |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Предотвращение образования тромбоцитов |
| Гематокрит Капиллярная трубка | Fisher Scientific | 22-362566 | Забор крови Капиллярная трубка |
| Hemavet | Drew Scientific | Не каталог товаров Анализатор | клеток крови |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 3100 | Камера для подсчета клеток |
| Изофлуран | Бакстера | 1001936040 | Использование для обезболивания мышей |
| Микроскоп (Olympus CKX41) | Olympus | Некаталожный элемент | Мониторинг и подсчет клеток |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Градиентная среда |
| PE крыса антимышиный CD45 | BD Biosciences | 561087 | маркер лейкоцитов |
| PE-Cy7 крысиный антимышиный TER 119 | BD Biosciences | 557853 | маркер эритроцитов |
| Pipet tips 200 µ L, широкопроходной | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Перенос образцов крови и тромбоцитов |
| Наконечники для пипеток 1000 &; L, широкопрофильный | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Перенос образцов крови и тромбоцитов |
| Фосфатный баффированный физиологический раствор (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Буфер для промывки и разбавления |
| Хлорид натрия | Sigma-Aldrich | S7653 | Физиологический раствор |
| Цитрат натрия | Fisher Scientific | 02-688-26 | Антикоагулянт |
| Буфер для окрашивания | Собственный | Не каталог | Буфер для промывки и разбавления |
| Стеильная вода | Собственный | Не каталог | Растворитель |
| Настольная центрифуга | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Роторная центрифуга с качающимся ведром |
| Исследование фермента тромбина Laboratoty | HT 1002a | Агонист активации тромбоцитов | |
| Трицин | Sigma-Aldrich | T0377 | Буфер для среды Nycodenz |
Ссылки
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
