Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очищение тромбоцитов от мышонка крови

22.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59803

⸱

7 мая 2019 г.

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь, мышь кровь была собрана в присутствии анти-коагулянт. Тромбоциты были очищены от iohexol градиент среды с использованием низкой скорости центрифугирования. Тромбоциты были активированы с тромбина для расследования, если они были жизнеспособными. Качество очищенных тромбоцитов анализировалось с помощью потока цитометрии и микроскопии.

Аннотация

Тромбоциты очищаются от цельной крови для изучения их функциональных свойств, которые должны быть свободны от красных кровяных телец (РБК), лейкоцитов (WBC), и белков плазмы. Мы описываем здесь очищение тромбоцитов от мыши крови, используя три раза больше iohexol градиент среднего относительно объема крови и центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Восстановление/выход очищенных тромбоцитов было 18.2-38.5%, а очищенные тромбоциты находились в состоянии покоя, которое не содержало сколь-либо значительного количества РБК и WBC. Очищенные тромбоциты, обработанные тромбином, показали до активации 93%, что указывает на их жизнеспособность. Мы подтвердили, что очищенные тромбоциты являются достаточно чистым использованием потока цитометрической и микроскопической оценки. Эти тромбоциты могут использоваться для экспрессии генов, активации, высвобождения гранул, агрегирования и анализа адгезии. Этот метод может быть использован для очистки тромбоцитов из крови других видов, а также.

Введение

Тромбоциты являются компонентом крови, который функционирует как инициатор свертывания крови в ответ на повреждение в кровеносный сосуд. Они собирают на месте повреждения для того чтобы заткнуть стену сосуда1. Тромбоциты являются ануклеатными фрагментами цитоплазмы, производными от мегакарыцитов костного мозга под действием тромбоноэтин и попадают в тираж2. Они считаются метаболически активными и способными воспринимать внеклеточную среду путем активации внутриклеточных сигнальных каскадов, которые приводят к распространению тромбоцитов, агрегированию и образованию гемостатической вилки1,3. Помимо гемостаза/тромбоза и заживления ран4, тромбоциты играют важную роль в принимающих воспалительных реакций, ангиогенез, и метагатис3,5,6,7, 8.

Тромбоциты очищают от крови для изучения их биохимических и физиологических свойств, которые должны быть свободны от других компонентов крови. Поскольку эритроциты (РБК) и лейкоциты (WBC) содержат значительно больше РНК и белков, чем тромбоциты9,10, наличие даже небольшого количества этих клеток может мешать транскриптомической и протеомической аналитикам РНК и белков, полученных из тромбоцитов. Мы обнаружили, что очищенные тромбоциты активируются с антителом тромбина антитела, такие как анти-GPIIb/IIIa (Джон/а) и анти-P-selectin более эффективно, чем целые тромбоциты крови.

Так как тромбоциты хрупкие, важно, чтобы обработать образцы как можно более мягко. Если тромбоциты активированы, они выпускают содержимое гранул и в конечном счете деградируют. Поэтому, чтобы сохранить функциональные свойства тромбоцитов нетронутыми, важно поддерживать старение тромбоцитов во время изоляции. Несколько протоколов описали изоляцию тромбоцитов от человека, собаки, крысы, и не-человека приматов различными методами1,10,11,12. Некоторые из методов требуют несколько этапов, таких как сбор обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования, фильтрации путем разделения колонки, отрицательный выбор тромбоцитов с РБК-и WBC-специфические антитела, сопряжения к магнитным бисером, и так далее, которые являются отнимает много времени и может ухудшить тромбоциты и их содержимое.

Форд и его коллеги описали очищение тромбоцитов от человеческой крови с помощью iohexol средних11. Этот метод использует аналогичный объем проб крови и средних во время очистки. В виду того что люди дают более высокий объем крови, оно относительно легки для того чтобы очистить тромбоциты.

Iohexol является универсальным градиентом плотности инертной среде, которая свободно растворяется в воде и используется в фракционирование нуклеиновых кислот, белков, полисасахадов, и нуклеопротеидов13,14. Он имеет низкую осмолальность и нетоксичен, тем самым делая его идеальной средой для очищения неповрежденными живыми клетками11. Это не-твердых частиц среды; Таким образом, распределение ячеек в градиенте можно определить с помощью хемоцитометер, Flow cytometer, или спектрофотометра. Он не мешает большинству ферментативной или химической реакции клеток или клеточных фрагментов после разбавления.

Мышь служит важной моделью животных для многих заболеваний человека15,16,17,18. Есть несколько опубликованных статей, которые описывают очищение мыши тромбоцитов19,20. Однако, мышь дает относительно меньший объем крови, что затрудняет очищение тромбоцитов. Если используется тот же малый объем градиента средних и образцов крови, то слой тромбоцитов не может быть четко отделен от слоя РБК-WBC после центрифугирования. В этой статье мы описали быстрый и простой метод очистки мыши тромбоцитов с три раза больше iohexol градиент среды относительно объема выборки крови и низкой скорости центрифугирования. Мы также активировали очищенную тромбоциты с тромбин и исследовали их качество с потоком цитометрии и микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Мышеловки крови должны быть проведены с соответствующими институциональными ухода за животными и использования Комитета одобрения.

Примечание: Протокол очистки тромбоцитов описан в диаграмме потока на рисунке 1.

1. сборник крови

  1. Добавьте 25 мкл 3,2% цитрата натрия (pH 7,2) в качестве анти-коагулянта и 0,4 мм ГУНО-про-АРГ-про (гпрр) в полипропиленовой трубе.
  2. Соберите примерно 200 мкл крови из C57BL/6 мышь с помощью ретро-орбитального кровотечения.
    Примечание:     кровь может быть собрана из любого типа деформации мыши, независимо от возраста или пола.
    1. Используйте 2 мл изофлуран в любом типе камеры для обезболирования мыши.
      Примечание: Глубина анестезии проверяется признаками повышенного дыхания и снижением движения. Мышь не должна реагировать на движение анестезии камеры, или обрабатываются. Если мышь реагирует на движение или обработку, то она требует больше времени, чтобы держать в анестезии камеры.
    2. 1.2.2 Откройте или правое или левое веко мыши и вставьте трубу капилляра 7,5 cm (диаметром 0,12 cm) в сосудистое сплетение глаза.
    3. Поверните трубу капилляра одной половинной поворот пока прикладывая давление к трубке капилляра для того чтобы сломать сосуды и начать подачу крови. Держите животное вверх дном над собранием флакон, чтобы быть заполнены действием капилляров.
    4. Как только соответствующий объем крови собирается, удалите трубку капилляра и закройте глаза, применяя мягкое давление в течение 30 лет на веко с марлей. Как только кровотечение остановлено, возвратйте мышь к своей клетке и контролируйте для кровотечения.
    5. Проверьте глаза на травму через 1-2 дней после ретро-орбитального кровотечения. Удалите мышь из исследования, показывая признаки значительной травмы глаза в результате процедуры и эвтаназии.
      Примечание: Мышь не должна подвергаться какому-либо лечению, которое может подавлять тромбоциты, по крайней мере за две недели до сбора крови. Образец крови должен быть использован для очищения тромбоцитов в течение одного часа кровотечения мыши.

2. Очищение тромбоцитов

Примечание: Очищение от тромбоцитов должно проводиться при комнатной температуре, чтобы предотвратить их деградацию. Убедитесь, что температура реагентов и приборов составляет от 18 до 22 °C. Чтобы предотвратить деградацию тромбоцитов, быстро пипетки и энергичные встряхивания следует избегать во время процедуры.

  1. Добавить 600 Мкl из градиента iohexol (12% порошка iohexol в 0,85% хлористого натрия, 5 мм Тричин, pH 7,2)11 в трубку 1,5 мл.
  2. Добавить 200 мкл образца крови медленно вниз по стороне трубки на вершине градиента среды с широким отверстие пипетки наконечник так, что кровь и iohexol среды не смешиваются (рис. 2A).
  3. Центрифуга образца, содержащего трубки на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c в качающийся ротор ведра с медленным ускорением и замедлением.
  4. Соберите большую часть обогащенной тромбоцитами слоя и небольшую часть тромбоцитов бедных слоя (всего 300 до 400 мкл), используя широкий наконечник пипетки, не нарушая РБК и WBC слоев (Рисунок 2B). Перенесите образец тромбоцитов в новую трубку.
    Примечание: Если количество тромбоцитов меньше в крови или используется меньший объем крови, богатый тромбоцитами слой и слой тромбоцитов-бедных можно рассматривать как один слой.
  5. Добавьте 1 мл PBS в образец тромбоцитов, смешайте инвертирование и центрифугу на 800 x g в течение 10 минут при температуре 20 °c в качающейся роторе ведра. Полностью выбросите раствор и добавьте 200 мкл PBS, чтобы ресуспензируем тромбоциты мягким пипетатом.
    Примечание: Этот шаг является необязательным, так как он удаляет градиент средних и плазменных белков и увеличивает чувствительность тромбоцитов к агонистов, таких как тромбин. Так как различные центрифуги имеют различные программы, медленное ускорение/замедление может быть определено путем чтения руководства пользователя центрифуги.
  6. Перенесите 30 мкл этого образца в новую трубку для подсчета тромбоцитов. Оставшиеся тромбоциты могут быть использованы для биохимических и физиологических анализов, таких как активация тромбоцитов, агрегация, релиз гранул и т.д.
  7. Для извлечения РНК или белка, центрифуга образец тромбоцитов на 800 x g в течение 10 минут, чтобы гранулы тромбоцитов. Выбросьте супернатант полностью, не нарушая гранулят. Добавить требуемый объем РНК или лизиса белка буфер для Lyse тромбоцитов.

3. Подсчет тромбоцитов

  1. Подсчет всех кровяных клеток без разбавления и очищенных тромбоцитов (разбавляют 2 до 5 раз с PBS) с помощью автоматизированного анализатора клеток. Используйте от 30 до 50 мкл образцов для подсчета.
  2. Рассчитать общее количество тромбоцитов путем умножения на объем образца.
  3. Рассчитать процент доходности/восстановления очищенных тромбоцитов.
  4. Граф РБК и WBC в очищенный образец тромбоцитов (разбавленный 50 до 100 раз с PBS) с хемоцитометер и микроскопом.

4. Активация тромбоцитов

  1. В трубке, добавить 1 до 2 000 000 очищенных тромбоцитов в до 100 мкл окрашивания буфера (PBS с 2% плода бычьей сыворотки, ФПС).
  2. Для нескольких образцов, сделать мастер смесь антител с 1 мкл (0,5 мг/мл) из следующих: PE-Cy7 крысы анти-мышь TER 119, PE крысы анти-мышь CD45, FITC крысы анти-мышь CD41, и АКН крысы анти-мышь/человека CD62P (P-selectin) для обнаружения РБК, WBC, тромбоцитов, и активированных тромбоцитов, соответственно. Добавьте Мастер микс в трубы для окрашивания клеток. Не добавляйте тромбин.
  3. В другой трубе, добавить 1 до 2 000 000 очищенных тромбоцитов в до 100 мкл окрашивания буфера, и 0,4 mM GРРП пептид. Добавить тромбин, чтобы активировать тромбоциты и пятно клеток следующий шаг 4,2.
    Примечание: ГРП следует добавлять в образец перед добавлением тромбина для предотвращения агрегирования или сгустка через активацию тромбоцитов. Тромбин концентрация должна быть оптимизирована для получения хорошей активации тромбоцитов. После активации тромбоцитов, количество событий уменьшается при приобретении образцов потоком цитометрии.
  4. Как положительный элемент управления, добавить 1 мкл цельной крови в до 100 мкл окрашивания буфера в трубке и 0,4 mM пептид GРРП. Добавьте тромбин, чтобы активировать тромбоциты. Как отрицательный элемент управления, добавьте 1 мкл цельной крови в до 100 мкл окрашивания буфера. Не добавляйте тромбин в отрицательный образец управления. Пятно клеток следующий шаг 4,2.
  5. Для управления потоком цитометрией изотипа, этикетка 5 труб с незапятнанными, PE-Cy7, PE, FITC, и БТР. Добавьте 100 мкл окрашивания буфера, 1 мкл крови и 1 мкл соответствующего антитела к помеченных трубам, чтобы испачкать клетки.
  6. Инкубировать образцы, чтобы пятно на 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  7. Вымойте образцы, добавив 1 мл окрашивания буфера для каждой трубки. Центрифуга при комнатной температуре 800 x g в течение 5 минут. Выбросьте окрашивание буфера осторожно, не выбивая гранулы.
  8. Добавьте 300 мкл окрашивания буфера в каждую трубку, мягко перемешайте и переведите в трубку FACS. Храните окрашенные образцы в темноте, пока не проанализировано с потоком cytometer.

5. поток цитометрии анализы тромбоцитов

  1. Создайте новый эксперимент и генерировать журнал вперед рассеивать против журнала стороны разлетаются точечные участки и назначить ворота для Ter119 PE-Cy7 (РБК), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (тромбоциты), и CD62P БТР (активированный тромбоцитов) населения в соответствии с стратегией стробирования выбран для эксперимент в программное обеспечение FACS DIVA.
    1. Откройте иерархию населения, выбрав на вкладке популяции шоу иерархию популяции. Измените иерархию населения, проверив стратегию стробирования и правильно переименовав ворота.
    2. Открытое представление статистики путем выбора создания просмотра статистики. Редактировать представление статистики в соответствии с пользовательскими предпочтениями вправо, нажав на просмотр статистики и выбрав режим редактирования статистики.
    3. Выберите цвет для каждого ворот, что повышает визуальный аспект макета с помощью двойного нажатия на поле, соответствующее населению.
  2. В окне Cytometer щелкните на вкладке параметров и отрегулируйте напряжения для параметров, чтобы визуализировать популяцию процентов на участках.
  3. Отрегулируйте напряжения для каждого из параметров так, чтобы негативное население можно было отличить от положительной популяции. Перед записью образцов для контроля компенсации проверьте, что одноцветные положительные элементы управления находятся на шкале (убедитесь, что положительные пики видны и не слишком далеко вправо).
    Примечание: Если положительные пики не достигают масштаба, напряжение должно корректироваться, чтобы увидеть положительные популяции.
  4. Запишите одноцветные окрашенные ячейки для контроля за компенсацией (незапятнанные, PE-Cy7, PE, FITC и БТР).
  5. Если положительные контрольные ворота не устанавливаются должным образом, отрегулируйте их, изменяя напряжение.
  6. Перейти к эксперименту ≫ Настройка компенсации ≫ рассчитать компенсацию. Выберите применять только в результирующее окно.
  7. Переключитесь на глобальную таблицу, нажав на кнопку переключения в верхней части, слева от окна листа.
  8. Загрузите положительный образец управления и приобретите достаточное количество ячеек, чтобы скорректировать компенсацию и ворота.
  9. Загрузите образец снова и проверить, что каждый участок показывает ожидаемые популяции клеток на основе флюфрохром окрашенных антител. Приобретите и запишите 100 000 событий для целых образцов крови и 10 000 событий для очищенных тромбоцитов. Загрузите образцы один за другим до завершения приобретения.
  10. Проанализируйте данные о потоке цитометрии с программным обеспечением с соответствующими участками и воротами (рис. 3)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сводка по очистке тромбоцитов описывается в схеме потока (рис.1). Шаги включают в себя сбор крови из мыши с помощью ретро-орбитального кровотечения в присутствии антикоагулянта, Добавление образца крови на iohexol градиент среды, центрифугирования в размахивая ведро ротора на 400 x g для 20 мин при температуре 20 °c. Качество очищенных тромбоцитов оценивалось с помощью микроскопии и потока цитометрии после окрашивания с антителами для выявления любых загрязняющих клеток и активирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обычно тромбоциты изолированы низкоскоростным центрифугирования, которая дает богатую тромбоцитами плазму, которая содержит значительное количество клеток крови, клеточного мусора и белков плазмы, которые могут вмешиваться в биохимические и физиологические анализы и потребности дальнейшее очищение21. Поэтому, важно использовать быстрый и простой метод, который может дать чистые тромбоциты без основных загрязняющих веществ. Представленный здесь протокол описывает очищение тромбоцитов от крови мышей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана запуска финансирования детского исследовательского фонда Цинциннати и Университета Цинциннати пилот поступательный Грант на М.Н. Мы хотели бы поблагодарить детский госпиталь Цинциннати исследовательский поток Цитометрическая Core за их услуги.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
APC крыса антимышиный/человеческий CD62P (P-селектин)Thermoscientific17-0626-82Маркер активации тромбоцитов
Eppendorf tubeFisher Scientific14-222-166Пробирка для сантифуге
FACS DIVA программное обеспечениеBD BiosciencesНе каталог Анализтромбоцитов и цельной крови
FACS пробиркаFisher Scientific352008Пробирки для потока цитомтерия
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Инвитроген26140079Ингредиент для окрашивания буфера
FITC крыса антимышиный CD41BD Biosciences553848Маркер тромбоцитов
Проточный цитометрBD BiosciencesНе каталог Анализтромбоцитов и цельной крови
FlowJo программное обеспечениеFlowJo, Inc.Не каталог Анализтромбоцитов и цельной крови
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)EMD Millipore03-34-0001Предотвращение образования тромбоцитов
Гематокрит Капиллярная трубкаFisher Scientific22-362566Забор крови Капиллярная трубка
HemavetDrew ScientificНе каталог товаров Анализаторклеток крови
ГемоцитометрHausser Scientific3100Камера для подсчета клеток
ИзофлуранБакстера1001936040Использование для обезболивания мышей
Микроскоп (Olympus CKX41)OlympusНекаталожный элементМониторинг и подсчет клеток
Nycodenz (Histodenz)Sigma-AldrichD2158Градиентная среда
PE крыса антимышиный CD45BD Biosciences561087маркер лейкоцитов
PE-Cy7 крысиный антимышиный TER 119BD Biosciences557853маркер эритроцитов
Pipet tips 200 µ L, широкопроходнойThermoFisher Scientific21-236-1AПеренос образцов крови и тромбоцитов
Наконечники для пипеток 1000 &; L, широкопрофильныйThermoFisher Scientific21-236-2CПеренос образцов крови и тромбоцитов
Фосфатный баффированный физиологический раствор (PBS)ThermoFisher Scientific14040-117Буфер для промывки и разбавления
Хлорид натрияSigma-AldrichS7653Физиологический раствор
Цитрат натрияFisher Scientific02-688-26Антикоагулянт
Буфер для окрашиванияСобственныйНе каталогБуфер для промывки и разбавления
Стеильная водаСобственныйНе каталогРастворитель
Настольная центрифугаThermoFisher Scientific75253839/433607Роторная центрифуга с качающимся ведром
Исследование фермента тромбина LaboratotyHT 1002aАгонист активации тромбоцитов
ТрицинSigma-AldrichT0377Буфер для среды Nycodenz

Ссылки

  1. de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
  2. Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
  3. Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
  4. Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
  5. Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
  6. Hampton, T. Platelets' Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
  7. Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
  8. Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
  9. Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
  10. Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144(2013).
  11. Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
  12. Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
  13. Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
  14. Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
  15. Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
  16. Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
  17. Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
  18. Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
  19. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
  20. Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
  21. Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PBS
Очищение тромбоцитов от мышонка крови
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.