Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

5.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/59804

⸱

14 сентября 2019 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

В этой статье

Краткое содержание

Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.

Аннотация

Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 "конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.

Введение

Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.

Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli1. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему1. В этих случаях, целевой белок, как правило, изолированы из клеток, которые родно синтезирует белок через комплекс ряд шагов, которые могут привести к потере генного продукта. Чтобы преодолеть эти проблемы, простая процедура была разработана для очистки генного продукта после метода нарушения гена2,ПЦР на основе метода сращивания ДНК3 (обозначенный двухступенчатый фьюжн ПЦР), и электропорации для генетической преобразование в Streptococcus mutans. Добавление тега полихистидина (His-tag) к C-термину с генным продуктом облегчает его очистку путем обездвижения хроматографии сродства металла (IMAC).

Чтобы изолировать его-тег-выражение штамма, вся геномная ДНК гена интереса (в этом Его-тег-выражение гена нарушенных штамма) заменяется антибиотикорезистентный маркер гена. Процедура для генерации Его-тег-выражение strainis почти идентичны, что для генерации гена нарушенных штамма, как описано ранее4,5. Поэтому методы нарушения генов и изоляции генного продукта должны выполняться в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа.

В настоящей работе, последовательность политистидина-кодирования прилагается к 3 "конец gtfC (GenBank локус тег SMU-1005) ген, кодирование glucosyltransferase-SI (GTF-SI) в S. mutans6. Затем были проведены экспрессионные исследования стрептококковых видов. Достижение гетерологичного выражения gtfC E. coli затруднено, вероятно, из-за высокой молекулярной массы GTF-SI. Этот штамм называется S. mutans His-gtfC. Схематическая иллюстрация, изображающая организацию кассеты гена gtfC и spectomycin resistance(spcr)7 локусов в диком типе S. mutans (S. mutans WT) и его производных показана в Рисунок 1. GTF-SI является секреторным белком, который способствует развитию кариогенной стоматологической биопленки6. При наличии сахарозы, адепт биопленка наблюдается на гладкой стеклянной поверхности в WT S. mutans штамма, но не в S. mutans gtfC-нарушенныйштамм (S. mutans s gtfC)2,5 . Формирование биопленки восстанавливается в S. mutans sgtfC при экзогенном добавлении рекомбинантного GTF-SI. Штамм, S. mutans His-gtfC, затем используется для производства рекомбинантных GTF-SI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spcr, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении5.

1. Дизайн Праймера

  1. Подготовка грунтовки для строительства S. mutans Его-gtfC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров, используемые в этом протоколе, отображаются в таблице 1. Двухступенчатый метод фьюжн ПЦР для генерации S. mutans His-gtfC схематично иллюстрируется на рисунке 2.
    1. Дизайн праймеров (gtfC-обратнойи spcr-forward)для крепления его-тег-кодирования последовательности, вмешиваясь между геном gtfC и spcr (Рисунок 2A).
      1. Включите GS linker и его-тег-кодирования последовательности в обоих gtfC-обратнойи spcr-впередпраймеры, в которых 24 баз в 5 'регионов дополняют друг друга.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Аминокислотная последовательность связующим GS и его-тег (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His- His) прилагается к C-термину gtF-SI через перевод генов.
      2. Дизайн gtfC-впередгрунтовка для целевой gtfC гена в геноме S. mutans WT в S. mutans Установите температуру плавления8 (Tм) gtfC-впереди spcr-обратныйгрунтовки в соответствии с температурой плавления gtfC-обратнойи spcr- вперед грунтовки, соответственно.
    2. Дизайн вложенных грунтовок (вложенных вперед и вложенных обратного) для второго ПЦР(рисунок 2B).
    3. Дизайн праймеров(gtfC-впереди колонии-обратного) конкретные для геномной ДНК трансформаторов(Рисунок 2C; праймеры используются для колонии PCR).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ампромсоны пересекают границу между gtfC и spcr. GTfC-впередгрунтовка может быть применена в качестве переднего грунтовки.
    4. Дизайн праймеров (вверх-вперед и вниз-обратно) для окончательного подтверждения поколения S. mutans His-gtfC (Рисунок 2C; пЦР продукт усиливается грунтовки используется для секвенирования ДНК).

2. Геномная ДНК Извлечение из S. mutans

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штамм S. mutans должен быть культивирован в инфузии сердца головного мозга (BHI) среде при 37 градусах Цельсия в анаэробных условиях. Штаммы мутантов S. mutans и S. mutans His-gtfC культивируются в BHI, дополненных 100 мкг/мл спектриномицина.

  1. Streak S. mutans WT и S. mutans -gtfC отдельно на каждую из тарелок BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
  2. Выберите одиночные колонии S. mutans WT или S. mutans sgtfC с помощью стерилизованной зубочистки и привить в 1,5 мл бульона BHI. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии могут быть использованы в качестве источника шаблона ДНК для первого ПЦР (шаг 3.1).
  3. Перенесите 1 мл каждой бактериальной культуры в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Центрифуги культуры в течение 1 мин на 15000 х г.
  4. Удалите супернатант и добавьте 1 мл буфера Tris-EDTA (pH 8.0), чтобы повторно приостановить действие клеточной гранулы.
  5. Centrifuge подвески в течение 1 мин на 15000 х г. Удалите супернатант. Повторное увеличение количества клеточных гранул в 50 зликатбуфера Tris-EDTA (pH 8.0).
  6. Нагрейте подвеску с помощью блока инкубатора в течение 5 мин при температуре 95 градусов по Цельсию. Centrifuge подвески в течение 5 мин на 15000 х г.
  7. Перенесите супернатант в новую микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл (супернатант будет служить шаблоном ДНК для первого ПЦР).

3. Усиление ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1, Таблица 2и таблица 3 обобщены праймеры ПЦР, реагенты и циклы усиления, соответственно.

  1. Выполните первый ПЦР с использованием S. mutans WT и S. mutans sgtfC в качестве шаблонов ПЦР. Усиль регионы укрывательство вниз по течению часть гена gtfC и тех, укрывательство spcr с помощью грунтовки описаны в шаге 1.1.1.2(Рисунок 2A).
  2. Электрофорез каждый продукт ПЦР на 1% агарозный гель. Акциз желаемых фрагментов ДНК около 1000 bp и 2000 bp. Очистите фрагменты из гелей с помощью кремнезема мембраны на основе метода извлечения геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основные процедуры для ПЦР9,электрофорус днк-геля10и очистки ДНК11 подробно описаны в других местах.
  3. Выполните второй ПЦР с использованием продуктов первого ПЦР (приблизительно эквимолярных) в качестве шаблонов ПЦР с вложенными вперед и вложенными обратной праймеры(рисунок 2B).
  4. Электрофорезоднаодная одна десятая смеси ПЦР на геле агарозы. Подтвердите генерацию соответствующего ампликона примерно 3000 б.п.
  5. Осаждает оставшийся продукт ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Очистка продукта ПЦР не требуется, так как неспецифические ампликоны, генерируемые вторым ПЦР, не мешают гомологическому рекомбинации.
    1. Добавьте в смесь ПЦР воду без нуклеайза и доведите общий объем до 100 кв.м., а затем 0,1 объема (10 л) 3 М ацетата натрия (pH 5.2) и 2,5 тома (250 л) абсолютного этанола. Смешайте и храните смесь в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
    2. Центрифуги образца в течение 20 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Добавьте 1 мл 70% этанола для мытья гранул ДНК.
    3. Центрифуги образца в течение 5 мин при 15000 х г при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Воздух-сухой и растворить гранулы ДНК с 10 зл и без нуклеазы воды.

4. Преобразование клеток

  1. Подготовьте компетентный S. mutans WT, чтобы представить второй продукт ПЦР, следуя шагам, описанным в предыдущей публикации5. Храните ячейки при -80 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента компетентные клетки S. mutans WT уже сохранились в -80 градусах по Цельсию для генерации S. mutans .
  2. Смешайте 5 qL концентрированного второго продукта ПЦР с 50 qL аликот ледяных компетентных клеток, замороженных ранее. Добавить смесь в электропорации кюветы. Дайте один электрический импульс (1,8 кВ, 2,5 мс, 600,0, 10 кВ) клеткам с помощью электропорационного аппарата.
  3. Приостановите действие клеток в 500 л бульона BHI. Немедленно, распространение 10-100 л суспензии на BHI агар пластин, содержащих спектромицин. Инкубировать пластины в течение 2-6 дней при 37 градусах Цельсия, пока колонии не выросли достаточно, чтобы быть подобраны.

5. Проверка Genome рекомбинации и хранения

  1. Выполните колонии PCR, используя gtfC-вперед и колонии-обратной грунтовки для экрана для рекомбинации. Электрофорез ы каждой колонии ПЦР продукт на агарозный гель. Подтвердите фрагмент ДНК примерно 1500 bp.
  2. Выберите одну из положительных колоний с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток на ночь в 2 мл бульона BHI, содержащего спектромицин.
  3. Смешайте 0,8 мл бактериальной культуры с 0,8 мл стерильного 50% глицерола и бульон при -80 градусах или -20 градусов по Цельсию.
  4. Перенесите оставшийся 1 мл клеточной подвески в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл. Повторите шаги 2.3-2.7 для извлечения геномной ДНК из клеток.
  5. Выполните ПЦР с использованием вверх вперед и вниз-обратно грунтовки и геномной ДНК в качестве шаблона. Повторите шаг 3.2 для очищения усиленного продукта ДНК от гелей.
  6. Определите последовательность ДНК очищенного ампромликона по секвенированию ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы подтвердить поколение S. mutans Его-gtfC по секвенированию ДНК.

6. Очистка полистицидина по метке GTF-SI

  1. Streak S. mutans His-gtfC на спектромицин-содержащую BHI агар пластины. Инкубировать их на ночь при 37 градусах Цельсия.
  2. Возьмите одну колонию с помощью стерилизованной зубочистки и субкультуры клеток в 3 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
  3. Приготовьте две конические колбы с 1 l бульона BHI без спектромицина. Прививать 1 мл ночной культуры подвески в 1 л бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
  4. Концентрируйте протеины от supernatant культуры высыпанием сульфата аммония.
    ПРИМЕЧАНИЕ:     Извлекайте из клеточных тел, если целевой белок внутриклеточного. Основные процедуры для осадков сульфат аммония подробно в другом месте12.
    1. Центрифуги бактериальной культуры суспензии в течение 20 мин при 10000 х г при 4 c. Восстановить культуры supernatant в 3 L стеклянный стакан.
    2. Добавьте 1122 г сульфата аммония в 2 л супернатанта (80% насыщения) с энергичным перемешиванием с помощью магнитного мешалки. Разрешить осадок сформировать в течение 4 ч или более при 4 градусах Цельсия с перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование осадка может быть продолжено в одночасье.
    3. Центрифуги аммиак сульфат-осаждаемый раствор при 15000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Декант супернатант.
    4. Соберите осадок шпателем и перенесите в стеклянный стакан 200 мл. Отрептутивать гранулы в 35 мл связывающего буфера (50 мм2PO4,300 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, pH 8.0).
    5. Диализировать подвеску против 2500 мл связывающего буфера с помощью регенерированной целлюлозы диаметра трубки, при 4 кв С, с перемешиванием. Замените диализный раствор после 2 ч и продолжайте диализ на ночь.
    6. Замените раствор диализа снова. Продолжайте диализ для дополнительных 2 ч.
  5. Центрифуга диализированной подвески на 20000 х г в течение 10 мин при 4 c. Фильтр супернатант через мембранный фильтр с помощью всасывающего фильтрационного оборудования. Перенесите фильтрат на колбу 75 см2.
  6. Фракция пополистидин-тегами GTF-SI от фильтрообразной подвески с помощью обездвиженной хроматографии сродства металла (IMAC).
    1. Передача 2 мл суспензии с госраствором IMAC (примерно 1 мл из мина семы) в хроматографическую колонку, розетка которой установлена на силиконовую трубку. Удалите решение для хранения с помощью гравитационного потока.
      ПРЕДЕКТО: Не допускайте высыхания по всему IMAC.
    2. Добавьте 3 мл дистиллированной воды в колонку, чтобы помыть посуду. Добавьте 5 мл связывающего буфера, чтобы уравновесить пошельнку.
    3. Выключите поток с Hoffmann щепотку петух. Добавьте 5 мл отфильтроченной подвески со ступени 6.5, чтобы сделать суспензию.
    4. Добавьте всю суспензию в оставшуюся отфильтрованную подвеску. Закрутите смесь осторожно в течение 30 мин при 4 градусах По Цельсию.
    5. Загрузите смесь обратно на столбец. Удалите подвеску гравитационным потоком. Вымойте resin IMAC с 20 мл связывающего буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте скорость потока примерно до 2 мл/мин с помощью рваного петуха Хоффмана на протяжении всего последующего IMAC.
    6. Выявите рекомбинантный GTF-SI с 20 мл элютионного буфера (50 мМ2PO4,300 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 8.0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Элуат должен храниться при 4 градусах Цельсия. Resin IMAC можно использовать повторно. Обратитесь к инструкциям для мизины.
  7. Замените буфер elution буфером хранения (50 мМ фосфатный буфер, pH 6.5) и концентрируйте рекомбинантный раствор GTF-SI примерно на 1 мл с помощью центробежного ультрафильтрационного блока. Храните рекомбинантный раствор GTF-SI при 4 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подтвердите политистидин помечены GTF-SI очистки с помощью SDS-PAGE13 и западной blotting14, используя хрен пероксидазы-конъюгированные анти-полихистидин моноклональных антител. Добавление CHAPS (окончательная концентрация, 0.1%) к eluent может быть необходимо во избежание nonspecific adsorption к блоку, в зависимости от протеина цели.

7. Функционная реставрация рекомбинантной GTF-SI

  1. Полоса каждого S. Mutans деформации на BHI агар пластины индивидуально. Инкубировать тарелки на ночь при 37 градусах Цельсия.
  2. Используя стерилизованные зубочистки, подобрать одну колонию, чтобы привить в 2 мл бульона BHI. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия.
  3. Используйте 20 зЛ ночной культуры S. mutans и gtfC, чтобы привить 2 мл бульона BHI, содержащего 1% сахарозы без антибиотиков в стеклянной пробирке. Добавьте GTF-SI или эквивалентный объем транспортного средства к культуре S. mutans иgtfC, и культурные клетки с трубкой, помещенной в наклонное положение, на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать раствор GTF-SI с помощью стерильного фильтра шприца и определить концентрацию белка с помощью анализа белка бисинхониновой кислоты15 перед использованием.
  4. Агитировать культуры подвески с вихрем смеситель для 10 s. Decant подвески. Вымойте пробирки достаточным количеством дистиллированной воды.
  5. Пятно биопленок на трубчатой стене с 1 мл 0,25% Coomassie блестящий синий (CBB).
  6. Декантирование окрашивающий раствор после 1 мин. Вымойте пробирки с достаточным количеством дистиллированной воды. Воздушно-сухие пробирки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A показаны колонии S. mutans, преобразованные со вторым продуктом ПЦР и покрытые на агарных пластинах BHI, содержащих спектромицин. Продукция колон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spcr-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 "конец области gtfC и 5" конец области spcr. Каждый праймер включает в себя 24 дополнительных баз, которые кодируют gs linker и его-тег-кодирования последовательности в их 5 'регионов. Нарушения местных регулятивных последовательностей, расположенных в восходящих фланговых региона...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) (гранты 16K15860 и 19K10471 до Т. М., 17K12032 до М. И., и 18K09926 н. Х.) и SECOM Научно-технический фонд (SECOM) (грант No 2018.09.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02Для электрофореза в агарозном геле
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Система анаэробных культур
Anti-His-Tag моноклональное антителоMBLD291-7HRP-конъюгированный
набор для анализа белка BCAThermo Fisher Scientific23227Измерение концентрации белка
Мозговой инфузионный бульонBecton, Dickinson237500Бактериальная питательная среда
CBB R-250Wako031-17922Для окрашивания биопленки
Центробежная ультрафильтрационная установкаSartoriusVS2032Замена буфера и концентрация белка
ЦентрифугаKubota7780II
Хроматографическая колонкаBio-Rad7321010Для IMAC
Диализный мембранный зажиммарки Fisher21-153-100
Диализная трубкакак одно целое2-316-06
ДНК-полимеразаTakaraR045AВысокоточная ДНК-полимераза
Секвенирование ДНКEurofins Genomics
ECL субстратBio-Rad170-5060Для вестерн-блоттинга
ЭДТА (0,5 М pH 8,0)Wako311-90075Препарат буфера Tris-EDTA
Электропорационная кюветаBio-Rad1652086зазор 0,2 см
ЭлектропораторBio-Rad1652100
EtBr растворNippon Gene315-90051Для электрофореза в агарозном геле
Гелевый резакNippon GeneticsFG-830
Гель Набор для экстракцииNippon GeneticsFG-91202Экстракция ДНК из агарозного геля
ImagerGE Healthcare29083461Для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга
ImidazoleWako095-00015Связывающий буфер и препарат элюирующего буфера
ИнкубаторNippon Medical & Химические инструментыEZ-022Настройка температуры: 4 °°; C
ИнкубаторNippon Medical & Химические инструментыLH-100-RDSНастройка температуры: 37 °°; C
Мембранный фильтрMerck MilliporeJGWP047000,2 &; m диаметр
МикроцентрифугаKubota3740
NaClWako191-01665Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера
2PO4· 2H2OWako192-02815Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера
NaOHWako198-13765Приготовление связывающего буфера и элюирующего буфера
(NH4)2SO4Wako015-06737Осаждение сульфата аммония
Ni-заряженной смолойBio-Rad1560133Для IMAC
ПЦР-праймерыEurofins GenomicsИндивидуальный заказ
Стандарт белкаBio-Rad161-0381Для SDS-PAGE и вестерн-блоттинга
Фильтрующий аппарат для фильтрации растворителейКак одинFH-1G
SpectinomycinWako195-11531Антибиотики; использование при 100 мк; г/мл
Стерильный шприцевой фильтрMerckmilliporeSLGV004SL0,22 &; m diameter
Streptococus mutans Δ gtfCStock штамм в лаборатории.gtfC заменен на штамм spcr
Streptococus mutans UA159Stock штамм в лаборатории.S. mutans ATCC 700610, Дикий тип штамм
SucroseWako196-00015Для развития биопленки
TAE (50 × )Nippon Gene313-90035Для электрофореза в агарозном геле
ТермоамплификаторBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)Wako314-90065Tris-EDTA буферный препарат

Ссылки

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нарушение функции генаочистка белкаметаллохелатная аффинная хроматографиявысаливание сульфатом аммонияSDS-PAGEвестерн-блоттингэлектропорациявыделение из геляПЦР-амплификация
Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.